We describe a method to establish human enteroids from small intestinal crypts and colonoids from colon crypts collected from both surgical tissue and biopsies. In this methodological article, we present the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.
The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem cells (ISCs) and progeny that progressively migrate and differentiate toward the tip of the villi. These processes, essential for gastrointestinal homeostasis, have been extensively studied using multiple approaches. Ex vivo technologies, especially primary cell cultures have proven to be promising for understanding intestinal epithelial functions. A long-term primary culture system for mouse intestinal crypts has been established to generate 3-dimensional epithelial organoids. These epithelial structures contain crypt- and villus-like domains reminiscent of normal gut epithelium. Commonly, termed “enteroids” when derived from small intestine and “colonoids” when derived from colon, they are different from organoids that also contain mesenchyme tissue. Additionally, these enteroids/colonoids continuously produce all cell types found normally within the intestinal epithelium. This in vitro organ-like culture system is rapidly becoming the new gold standard for investigation of intestinal stem cell biology and epithelial cell physiology. This technology has been recently transferred to the study of human gut. The establishment of human derived epithelial enteroids and colonoids from small intestine and colon has been possible through the utilization of specific culture media that allow their growth and maintenance over time. Here, we describe a method to establish a small intestinal and colon crypt-derived system from human whole tissue or biopsies. We emphasize the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.
जठरांत्र पथ के अस्तर उपकला लगातार नवीकरण में है। यह प्रक्रिया लगातार यह खत्म हो जाता है के रूप में तेजी से आंतों उपकला को बदलने के लिए संतान की उपज है, जो आंतों स्टेम कोशिकाओं (ISCs) के प्रसार से शुरू हो रहा है। ISCs शामिल प्रफलन डिब्बे तहखाने की तह तक ही सीमित है। ISCs अंततः अवशोषण या स्रावी प्रजातियों में अंतर है, जो संतान को जन्म दे। वे लुमेन एक में विभाजन से पहले ऊपर की तरफ विस्थापित के रूप में तहखाना के बाहर और अंकुर या सतह उपकला पर चल रहा है, कोशिकाओं उत्तरोत्तर अंतर। ISCs enterocytes, microfold कोशिकाओं, enteroendocrine कोशिकाओं, जाम कोशिकाओं, गुच्छा कोशिकाओं और Paneth कोशिकाओं सहित सभी आंतों उपकला कोशिका प्रकार को जन्म दे। पेट के बिखरे हुए enteroendocrine और गुच्छा कोशिकाओं 2 के साथ ज्यादातर colonocytes और जाम कोशिकाओं से बना लम्बी तहखाने, की विशेषता है।
पूर्व vivo संस्कृतिसंरचना सिस्टम आईएससी रखरखाव और आंतों ऊतक homeostasis के अध्ययन के लिए होनहार उपकरण का गठन। शारीरिक स्थितियों को पूरी तरह से reproduced और उपकला microenvironment अक्सर 3,4 बदल नहीं कर रहे हैं लेकिन, जैसा कि यह टिशू कल्चर तकनीक पर भरोसा करने के लिए मुश्किल है। आईएससी क्षेत्र में एक बड़ी प्रगति को बनाए रखने और सामान्य आंत्र आला संकेतों को बदलने के लिए परिभाषित वृद्धि कारकों का उपयोग कर व्यक्ति murine ISCs विस्तार करने के लिए टिशू कल्चर तकनीक की स्थापना की थी। लंबे समय तक संस्कृति शर्तों सातो एट अल द्वारा वर्णित किया गया।, जिसमें एक तहखाने या आंतों उपकला से पृथक स्टेम कोशिकाओं कई तहखाना-जैसे डोमेन 5-7 सहित तीन आयामी उपकला संरचनाओं फार्म विकसित करने के लिए। ये निरीक्षण संरचनाओं लगातार विस्तार करने के विखंडन की घटनाओं से गुजरना। दिलचस्प है, मूल के ऊतक के लिए विशिष्ट सभी आंतों प्रकार की कोशिकाओं का उत्पादन कर रहे हैं और साथ ही एक लुमेन 8 में चली जाती हैं। इस प्रणाली के संशोधनों का प्रयोग, उपकलाorganoids पेट, छोटी आंत और पेट से उत्पन्न हो सकता है। अधिक विशेष रूप से, छोटी आंत से उपकला organoids enteroids 9 कर रहे हैं, और पेट से उन colonoids 9,10 हैं। ये उपकला organoid संस्कृति प्रणालियों इस प्रकार अलग कक्षों 5,6,10-15 की "stemness" परीक्षण, इन विट्रो में स्टेम कोशिकाओं के रूप में कार्य करने के लिए पृथक एकल कक्षों की क्षमता का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। अन्य जांचकर्ताओं व्यक्ति उपकला कोशिकाओं 16-21 के समारोह में अध्ययन करने के लिए enteroids और colonoids दोनों का इस्तेमाल किया है। इस प्रकार, enteroid और colonoid संस्कृतियों दोनों स्टेम और गैर स्टेम सेल कार्यों का मूल्यांकन करने और आंतों के भीतर मौलिक सेलुलर बातचीत में नई जानकारी देने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
2011 में, सातो और उनके सहयोगियों ने मानव छोटी आंत और पेट 22,23 से निकाली गई उपकला organoids के दीर्घकालिक संस्कृति उत्पन्न। मीडिया संरचना, मानव उपकला enteroids में मतभेद के अलावाऔर colonoids उनके murine समकक्ष के रूप में एक ही सुविधाओं दिखा रहे हैं। इसके अलावा, वे इस तरह के बैरेट घेघा, ग्रंथ्यर्बुद या ग्रंथिकर्कटता, और सिस्टिक फाइब्रोसिस 22,24 के रूप में रोगग्रस्त ऊतकों से उत्पन्न किया जा सकता है। मानव enteroids आंतों स्टेम सेल और उपकला श्लैष्मिक जीव विज्ञान का अध्ययन करने और सामान्य और असामान्य दोनों जठरांत्र फिजियोलॉजी तीन अध्ययन करने के लिए एक उपन्यास प्रायोगिक प्रणाली के रूप में काम करने के लिए एक मूल्यवान प्रणाली का गठन।
यहाँ हम मानव छोटी आंत और पेट के तहखाने (चित्रा 1) से enteroids और colonoids स्थापित करने की विधियों का वर्णन। इस पद्धति की समीक्षा में, हम पूरे ऊतक और बायोप्सी से तहखाना संग्रह पर जोर। हम सफल विकास और मानव enteroids और colonoids और इस मॉडल से बाहर किए गए संभव प्रयोगात्मक रणनीतियों के रखरखाव के लिए आवश्यक हैं कि संस्कृति के तौर तरीकों पुनरावृत्ति।
इस विधि आंतों उपकला जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी उपकरण का गठन जो आंतों उपकला प्रजातियों और उपकला गतिशीलता reproducing एक पूरी प्रणाली प्रदान करता है। इस के साथ साथ प्रस्तुत विधि कुशलतापूर्वक मानव enteroids और colonoids में यह परिणाम है कि सातो और Clevers 22 से मूल murine अध्ययन से अनुकूलित किया गया था। यहाँ, हम स्वयं किसी भी सेलुलर contaminants को बचने के लिए microdissection के द्वारा तहखाने उठाया। इस विधि के तहखाने के एक प्रत्यक्ष दृश्य की अनुमति देता है और "मिलाते हुए" द्वारा मूल तहखाना संग्रह की तुलना में स्थिरता ओवरटाइम की ओर जाता है। अन्य समूहों के लिए विशेष रूप से कोलैजिनेज 25 के साथ EDTA के द्वारा केलेशन की जगह से थोड़ा अलग दृष्टिकोण का उपयोग कर इसी तरह की शब्दावली का विकास किया। तहखाना संग्रह में मतभेद इसके अलावा, उन टेकनीक संस्कृति 22 में मानव enteroids विकसित करने के लिए आवश्यक है कि एक परिभाषित मीडिया का उपयोग करें। तहखाना बोने में वृद्धि की दक्षता बढ़ाने के लिए, हम (CHIR99021) एक GSK3 अवरोध करनेवाला जोड़नेपहले दो दिनों में 12 के लिए।
ऊतक या बायोप्सी की हैंडलिंग के लिए महत्वपूर्ण है और तहखाना अलगाव के रूप में जल्द ही ऊतक प्रयोगशाला में आता है के रूप में किया जाना चाहिए। हालांकि, देरी तहखाना अलगाव और संस्कृति ऊतक संग्रह के बाद 24 घंटे तक का प्रदर्शन किया जा सकता है कि पहले murine ऊतक 26 के लिए के रूप में वर्णित (डेटा) नहीं दिखाया। आंतों ऊतक पूरी तरह से ऊतक व्यवधान से बचने के लिए और 4 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा जाना चाहिए DPBS के साथ भरा एक शंक्वाकार ट्यूब में रखा जाना चाहिए। देरी तैयारी ऊतक शिपिंग के लिए अनुमति देता है, लेकिन तापमान परिवर्तन परिवहन के दौरान से बचा जाना चाहिए। प्रारंभिक तहखाना चढ़ाना के लिए आवश्यक कुल समय अलग और तहखाना थाली करने के लिए ऊतक और 1 घंटा 2 को संसाधित करने के लिए 15 से 30 मिनट के साथ लगभग दो घंटा है। ऊतक के microdissection के लिए एक साफ तहखाना तैयारी का एक महत्वपूर्ण निर्धारक और विधेय है। हालांकि, विभिन्न प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में हाथ-झटकों से तहखाना रिहाई संभव है 22,23।
Murine enteroid (enteroids) प्रणाली के साथ समानता के बावजूद, मानव enteroids बढ़ाने के लिए और समय के साथ उनके विकास को बनाए रखने के लिए विशिष्ट अणुओं की आवश्यकता होती है। वृद्धि कारकों, EGF, नोगिन, आर spondin murine उपकला organoids को इसी तरह से किया जाता है। हालांकि, Wnt -3 ए के उपयोग के लिए महत्वपूर्ण है। हम गठन के साथ ही विकास दक्षता मानव पुनः संयोजक प्रोटीन की तुलना में एक Wnt -3 ए वातानुकूलित माध्यम का उपयोग कर अधिक से अधिक है कि उल्लेख किया। समन्वित रूप से, हम ग्लाइकोजन सिन्थेज़ काइनेज 3 (CHIR99021) 12 के एक अवरोध करनेवाला के प्रयोग से उन्नत संस्कृति की स्थिति का प्रदर्शन किया। संयोजक वृद्धि कारकों Wnt -3 ए, आर spondin, और नोगिन वातानुकूलित मीडिया द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है। एक Wnt -3 ए व्यक्त एल सेल लाइन (ATCC) व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है। अन्य समूहों के आर-spondin 1- 23,27, Noggin- 19 विकसित की है, और Wnt-3 ए / आर-spondin3 / Noggin- 28 सेल लाइनों को व्यक्त किया है। दो छोटे अणु अवरोधकों संस्कृति में किया जाता है मुझेव्यास और संस्कृति 29 के रखरखाव के लिए आवश्यक हैं। एक-83-01 वृद्धि कारक β और Activin / नोडल रिसेप्टर्स को बदलने का एक चयनात्मक अवरोध करनेवाला है (activin तरह काइनेज 4, 5, 7) और SB202190 एक p38 माइटोजन सक्रिय प्रोटीन kinase अवरोध (MAPK) है। दोनों अवरोधकों मानव प्रेरित स्टेम सेल आत्म नवीकरण को बनाए रखने के लिए और मानव भोले स्टेम सेल 30-32 स्थापित करने के लिए क्रमशः इस्तेमाल किया गया है। इसके अलावा, निकोटिनामाइड, निकोटिनामाइड एडेनाइन डाईन्यूक्लियोटाइड के अग्रदूत, एक लंबी अवधि के तरीके 22,29 में enteroids और colonoids विस्तार बनाए रखने के लिए आवश्यक है।
यह तहखाना तैयारी से उपज को निर्धारित करता है के रूप में EDTA के केलेशन एक महत्वपूर्ण कदम है। हम 2 मिमी EDTA उपचार के साथ सफल रहे हैं। हालांकि, EDTA के एकाग्रता ऊतक के प्रकार के बारे में 15 मिमी 2 मिमी से संशोधित किया जा सकता है। उस मामले में, ऊष्मायन के समय अनुभव से निर्धारित किया जाना है। प्रारंभिक चढ़ाना के बाद, तहखाना दौर-यू जाएगापी और अंततः enteroids के रूप में। हालांकि, enteroids या colonoids अक्सर कोई विभेदित कोशिकाओं लिए थोड़ा के साथ क्षेत्रों के गठन से एक "स्टेम" फेनोटाइप प्रदर्शित करता है। उस मामले में, भेदभाव Wnt -3 ए, निकोटिनामाइड और p38 MAPK अवरोध करनेवाला वापस लेने के द्वारा शुरू किया जा सकता है। ऐसे DAPT या DBZ रूप पायदान अवरोध करनेवाला का उपयोग enteroids 22 भीतर भेदभाव को बढ़ाने में मदद करता है।
इस मॉडल अवशोषण और स्रावी विभेदित प्रजातियों दोनों युक्त स्टेम सेल डिब्बे से उत्पन्न होने वाली नित्य तहखाना-नवोदित घटनाओं के रूप में अच्छी तरह से अंकुर की तरह उपकला डोमेन के साथ आंतों फिजियोलॉजी स्मरण दिलाता है। दिलचस्प बात यह है कि इस प्रणाली के किसी भी mesenchymal कोशिकाओं होते हैं और आला संकेत आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए विशिष्ट मीडिया शर्तों का उपयोग करता है नहीं करता है।
Murine मॉडल की तरह, मानव enteroids एक स्टेम सेल के रूप में कार्य करने के लिए उन कोशिकाओं की क्षमता का परीक्षण करने के लिए पृथक आंतों उपकला कोशिकाओं से उत्पन्न हो सकता है। SeveRAL पढ़ाई स्टेम गुण 12,23,33 के साथ कोशिकाओं के लिए समृद्ध करने के लिए भेदभाव मार्कर (CD44, CD24 या CD166) और EPHB2 सकारात्मक कोशिकाओं के समूह का इस्तेमाल किया है। साथ में, इन अध्ययनों stemness के परीक्षण के लिए मानव enteroids संस्कृतियों की उपयोगिता प्रदर्शित करता है। अन्य जांचकर्ताओं ऐसी संक्रामक अतिसार रोग, सिस्टिक फाइब्रोसिस, या कोलोरेक्टल कैंसर 22,34-37 के रूप में आंतों के रोगों की जांच के लिए इस मॉडल का उपयोग कर रहे हैं। इन अध्ययनों से मानव enteroids एक व्यक्तिगत स्क्रीनिंग की ओर ले जाने के लिए एक संभावना के साथ एक विश्वसनीय मानव रोग मॉडल का गठन कि प्रदर्शित करता है। मानव enteroids आनुवंशिक रूप से वायरल कणों 38 के साथ डीएनए अभिकर्मक या संक्रमण का उपयोग कर संशोधित किया जा सकता है। यह मानव उपकला organoids या सही आनुवंशिक परिवर्तन के भीतर जीन विशिष्ट कार्यों का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है। हाल ही में, शेवांक और उनके सहयोगियों CFTR जीन के कारण एसी पर उत्परिवर्तन CRISPR / Cas9 प्रणाली के साथ जीनोम को संपादित करें और सही करने के लिए संभावना का प्रदर्शनystic फाइब्रोसिस 24। मानव enteroids आंतों स्टेम सेल और उपकला श्लैष्मिक जीव विज्ञान का अध्ययन करने और सामान्य और असामान्य दोनों जठरांत्र शरीर क्रिया विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक उपन्यास प्रायोगिक प्रणाली के रूप में काम करने के लिए एक मूल्यवान प्रणाली का गठन।
The authors have nothing to disclose.
We gratefully acknowledge Dr. Hans Clevers (Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research, Netherlands) for the kind gift of TOPflash cells.
This project was supported in part by NIH-R01DK083325 (MAH); NIH P30 DK078392 (Digestive Health Center); NIH UL1RR026314 (CTSA).
Name of Reagent | Company | Catalog Number |
Dulbecco’s Phosphate buffered saline Ca2+, Mg2+ free (DPBS) | Life technologies; Gibco | 14190-144 |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 431788 |
Sorbitol | Fischer Scientific | BP439-500 |
Sucrose | Fischer Scientific | BP220-1 |
Bovine serum albumin (BSA) Fraction V | Fischer Scientific | BP1600-100 |
Gzntamycin/Amphotericin B solution | Life technologies; Gibco | R-015-10 |
Wnt-3A conditionned medium | in house | – |
Advanced DMEM/F12 | Life technologies; Gibco | 12634-028 |
HEPES 1M | Life technologies; Gibco | 15630-080 |
GlutaMAX (glutamine) | Life technologies; Gibco | 35050-061 |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life technologies; Gibco | 15140-148 |
N2 Supplement | Life technologies; Gibco | 17502-048 |
B27 Supplement | Life technologies; Gibco | 17504-044 |
N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G |
Nicotidamide | Sigma-Aldrich | N0636 |
Matrigel, GFR, Phenol free (basement membrane matrix) | Corning | 356231 |
human recombinant Noggin | R&D | 6057-NG/CF |
human recombinant R-Spondin | Preprotech | 120-38 |
human recombinant EGF | Sigma-Aldrich | E9644-.2MG |
Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG |
A-83-01 | Tocris | 2939 |
SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067-5MG |
human [Leu]15-Gastrin 1 | Sigma-Aldrich | G9145-.1MG |
CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 |
Thiazovivin | Stemgent | 04-0017 |
TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red (cell dissociation enzyme) | Life technologies; Gibco | 12605-010 |
Fetal Bovine Serum | Life technologies; Gibco | 10082-147 |
CTS Synth-a-Freeze Medium (freezing medium) | Life technologies; Gibco | A13713-01 |
L Wnt-3A cell line | ATCC | CRL-2647 |
Renilla luciferase assay | Promega | E2710 |
human recombinant Wnt-3A | R&D | 5036-WN/CF |
HEK293 TOPflash cell line | – | – |