We describe a method to establish human enteroids from small intestinal crypts and colonoids from colon crypts collected from both surgical tissue and biopsies. In this methodological article, we present the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.
The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem cells (ISCs) and progeny that progressively migrate and differentiate toward the tip of the villi. These processes, essential for gastrointestinal homeostasis, have been extensively studied using multiple approaches. Ex vivo technologies, especially primary cell cultures have proven to be promising for understanding intestinal epithelial functions. A long-term primary culture system for mouse intestinal crypts has been established to generate 3-dimensional epithelial organoids. These epithelial structures contain crypt- and villus-like domains reminiscent of normal gut epithelium. Commonly, termed “enteroids” when derived from small intestine and “colonoids” when derived from colon, they are different from organoids that also contain mesenchyme tissue. Additionally, these enteroids/colonoids continuously produce all cell types found normally within the intestinal epithelium. This in vitro organ-like culture system is rapidly becoming the new gold standard for investigation of intestinal stem cell biology and epithelial cell physiology. This technology has been recently transferred to the study of human gut. The establishment of human derived epithelial enteroids and colonoids from small intestine and colon has been possible through the utilization of specific culture media that allow their growth and maintenance over time. Here, we describe a method to establish a small intestinal and colon crypt-derived system from human whole tissue or biopsies. We emphasize the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.
Slimhinnen epitel av mage-tarmkanalen er i konstant fornyelse. Denne prosess er trigget av proliferasjon av tarm stamceller (ISCS) som kontinuerlig produsere avkom til raskt å erstatte den intestinale epitel som det svinger over. Den proliferative rom som omfatter de ISCS er begrenset til bunnen av kryptene. De ISCS gi opphav til avkom som til slutt differensiere i absorberende eller sekretoriske linjene. Beveger seg ut av krypten og på villus eller overflate epitel, cellene differensieres hvert som de vandrer oppover før eksfoliering inn i hulrommet 1. ISCS gi opphav til alle intestinale epitel celletyper, inkludert enterocytter, microfold celler, enteroendocrine celler, slimceller, knippe celler og Paneth celler. Tykktarmen er preget av langstrakte krypter består hovedsakelig av colonocytes og slimceller, med spredt enteroendocrine og bunt celler 2.
Ex vivo Culdige systemer utgjør lovende verktøy for å studere ISC vedlikehold og tarmvevet homeostase. Det er imidlertid vanskelig å stole på vevskultur-teknologier som fysiologiske betingelser ikke er fullstendig gjengitt og epiteliale mikromiljøet ofte endret 3,4. Et stort fremskritt i ISC-feltet var etableringen av vevskulturteknikker å opprettholde og utvide enkelt murine ISCS hjelp av definerte vekstfaktorer for å erstatte den normale tarmnisje signaler. Langtidsdyrkningsbetingelser ble beskrevet av Sato et al., I hvilket enkelt krypter eller isolerte stamceller fra tarmepitelet vokse for å danne 3-dimensjonale strukturer epiteliale inkludert flere krypten-lignende domener 5-7. Disse tridimensional strukturer gjennomgå fisjons hendelser å kontinuerlig utvide. Interessant er alle tarmcelletyper som er spesifikke for vevet opprinnelses produsert og i tillegg blir ekstrudert inn i et hulrom 8. Ved hjelp av modifiseringer av dette systemet, epitelialorganoids kan genereres fra magen, tynntarmen og tykktarmen. Mer spesifikt, epiteliale organoids fra tynntarmen er enteroids 9, og de fra tykktarmen er colonoids 9,10. Disse epiteliale organoid kultursystemer har vært brukt til å teste evnen av isolerte enkeltceller til å fungere som stamceller in vitro, og dermed å teste "stemness" av isolerte celler 5,6,10-15. Andre forskere har brukt både enteroids og colonoids å studere funksjonen av individuelle epitelceller 16-21. Dermed kan enteroid og colonoid kulturer brukes til å evaluere både stilk og ikke-stamcelle funksjoner og gi ny innsikt i grunnleggende cellulære interaksjoner i tarmen.
I 2011 Sato og kolleger generert langsiktig kultur for epitel organoids avledet fra humant tynntarm og tykktarm 22,23. Foruten forskjeller i media sammensetning, de menneskelige epiteliale enteroidsog colonoids stille de samme funksjonene som sin muse motstykke. Videre kan de bli generert fra syke vev som Barretts øsofagus, adenom eller adenokarsinom, og cystisk fibrose 22,24. Menneskelige enteroids utgjør et verdifullt system for å studere tarmstamcelle og epitelial slimhinne biologi og tjene som en roman eksperimentelt system for å studere både normal og unormal gastrointestinal fysiologi tre.
Her beskriver vi metoder for å etablere enteroids og colonoids fra menneskets tynntarm og tykktarm krypter (figur 1). I denne metodisk gjennomgang, vi understreke krypten samling fra hele vev og biopsier. Vi rekapitulere kultur modaliteter som er avgjørende for en vellykket vekst og vedlikehold av menneskelige enteroids og colonoids og mulige eksperimentelle strategier utført av denne modellen.
Denne metoden gir et komplett system reprodusere intestinale epitelceller i rett linje og epiteliale dynamikk som utgjør et nyttig verktøy for å studere intestinal epithelial biologi. Metoden som presenteres her var tilpasset fra den opprinnelige murine studie av Sato og Clevers 22 som effektivt resulterer i menneskelige enteroids og colonoids. Her plukket vi manuelt opp krypter ved mikrodisseksjon å unngå eventuelle cellulære forurensninger. Denne fremgangsmåte tillater en direkte visualisering av krypter og fører til konsistens overtid i forhold til den opprinnelige krypt samling ved "riste". Andre grupper utviklet lignende teknikk ved hjelp av litt forskjellige tilnærminger spesielt erstatte den chelation av EDTA med kollagenase 25. I tillegg til forskjellene i krypten samling, disse teknikk bruker et definert medium som er nødvendig for å dyrke humane enteroids i kultur 22. For å øke veksten effektivitet ved krypten seeding, vi legger en GSK3p inhibitor (CHIR99021)for de to første dagene 12.
Håndteringen av vevet eller biopsi er viktig og krypten isolering bør utføres så snart som vevet kommer i laboratoriet. Imidlertid kunne forsinket krypt isolasjon og kulturen utføres opp til 24 timer etter innsamling vev (data ikke vist) som tidligere beskrevet for murine vev 26. Tarmvevet bør plasseres i et konisk rør helt fylt med DPBS for å unngå avbrudd vev, og bør opprettholdes ved 4 ° C. Den forsinkede forberedelse tillater vev frakt men temperaturvariasjoner bør unngås under transport. Den totale tid som er nødvendig for den første krypten plette er omtrent 2 timer med 15 til 30 min for å behandle vev og 1 til 2 timer for å isolere og plate krypten. Den mikrodisseksjon av vevet er en kritisk determinant og predikat av en ren krypt preparat. Det er imidlertid mulig krypten utgivelsen av håndhils som beskrevet i ulike protokoller 22,23.
Til tross for likhetene med den murine enteroid (enteroids) system, de menneskelige enteroids krever spesifikke molekyler til å forbedre og opprettholde sin vekst over tid. Vekstfaktorer, er EGF Noggin, R-spondin anvendes på lignende måte til de murine epiteliale organoids. Imidlertid er bruken av Wnt-3A kritisk. Vi har lagt merke til at dannelsen så vel som veksteffektiviteten er større ved bruk av en Wnt 3A-kondisjonert medium enn den humane rekombinante protein. Samtidig, demonstrerte vi forbedrede dyrkingsbetingelser ved bruk av en inhibitor av glykogen syntase kinase 3 (CHIR99021) 12. Rekombinante vekstfaktorer kunne erstattes av Wnt-3A, R-spondin, og Noggin aircondition-media. En Wnt-3A-uttrykkende L-cellelinje er kommersielt tilgjengelig (ATCC). Andre grupper har utviklet R-spondin 1- 23,27, Noggin- 19, og Wnt-3A / R-spondin3 / Noggin- 28 uttrykker cellelinjer. To lavmolekylære inhibitorer benyttes i kultur megdia og er nødvendige for opprettholdelse av kulturen 29. A-83 til 01 er en selektiv inhibitor av transformerende vekstfaktor-β og aktivin / nodal-reseptorer (aktivin-lignende kinase 4, 5, 7) og SB202190 er et p38-mitogen-aktivert protein kinase inhibitor (MAPK). Begge hemmere har blitt brukt henholdsvis å opprettholde menneskeskapte pluripotent stamceller selvfornyelse og å etablere menneskelige naive pluripotente stamceller 30-32. Også, nikotinamid, en forløper for nikotinamidadenindinukleotid, er nødvendig for å opprettholde enteroids og colonoids ekspansjon i en langsiktig måte 22,29.
EDTA chelation er et viktig skritt som den bestemmer utbyttet fra krypten forberedelse. Vi har vært vellykket med 2 mM EDTA-behandling. Imidlertid kan EDTA-konsentrasjonen endres fra 2 mM til 15 mM med hensyn til typen av vev. I dette tilfelle har inkubasjonstiden som skal bestemmes empirisk. Etter den første plating, vil krypten runde-up og til slutt danne enteroids. Men enteroids eller colonoids ofte demonstrere en "stamme" fenotype ved å danne kuler med liten eller ingen differensierte celler. I dette tilfelle kan differensiering initieres ved å trekke tilbake Wnt-3A, nikotinamid og p38 MAPK-inhibitor. Bruken av Notch inhibitor som DAPT eller DBZ hjelper øke differensieringen innenfor enteroids 22.
Denne modellen rekapitulerer tarm fysiologi med stadige krypten-spirende hendelser som oppstår fra en stamcelle samt villus-lignende epiteliale domener som inneholder både absorberende og sekretoriske differensiert linjene. Interessant, dette systemet inneholder ingen mesenkymalceller og bruker spesifikke medie forhold til å møte kravene til nisje signal.
Som den murine modellen, kan humane enteroids bli generert fra isolerte intestinale epitelceller for å teste evnen til disse cellene for å fungere som en stamcelle. Several studier har brukt klynge av differensiering markører (CD44, CD24 eller CD166) og EPHB2 positive celler for å berike for celler med stilk egenskaper 12,23,33. Sammen utgjør disse studiene viser nytten av menneskelige enteroids kulturer for å teste stemness. Andre forskere bruker denne modellen til å undersøke tarmsykdommer som smittsomme diarésykdommer, cystisk fibrose, eller kolorektal kreft 22,34-37. Disse studiene viser at menneskelige enteroids utgjør en pålitelig menneskelig sykdom modell med mulighet for å bevege seg mot en personlig screening. Menneskelige enteroids kan genmodifisert ved hjelp av DNA transfeksjon eller infeksjon med viruspartikler 38. Dette gir et kraftig verktøy for å studere genspesifikke funksjoner innenfor de menneskelige epiteliale organoids eller riktige genetiske mutasjoner. Nylig, Schwank og kolleger demonstrerte muligheten til å redigere genomet med CRISPR / Cas9 system og korrigere mutasjon på CFTR genet forårsaker acystic fibrose 24. Menneskelige enteroids utgjør et verdifullt system for å studere tarmstamcelle og epitelial slimhinne biologi og tjene som en roman eksperimentelt system for å studere både normal og unormal gastrointestinal fysiologi.
The authors have nothing to disclose.
We gratefully acknowledge Dr. Hans Clevers (Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research, Netherlands) for the kind gift of TOPflash cells.
This project was supported in part by NIH-R01DK083325 (MAH); NIH P30 DK078392 (Digestive Health Center); NIH UL1RR026314 (CTSA).
Name of Reagent | Company | Catalog Number |
Dulbecco’s Phosphate buffered saline Ca2+, Mg2+ free (DPBS) | Life technologies; Gibco | 14190-144 |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 431788 |
Sorbitol | Fischer Scientific | BP439-500 |
Sucrose | Fischer Scientific | BP220-1 |
Bovine serum albumin (BSA) Fraction V | Fischer Scientific | BP1600-100 |
Gzntamycin/Amphotericin B solution | Life technologies; Gibco | R-015-10 |
Wnt-3A conditionned medium | in house | – |
Advanced DMEM/F12 | Life technologies; Gibco | 12634-028 |
HEPES 1M | Life technologies; Gibco | 15630-080 |
GlutaMAX (glutamine) | Life technologies; Gibco | 35050-061 |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life technologies; Gibco | 15140-148 |
N2 Supplement | Life technologies; Gibco | 17502-048 |
B27 Supplement | Life technologies; Gibco | 17504-044 |
N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G |
Nicotidamide | Sigma-Aldrich | N0636 |
Matrigel, GFR, Phenol free (basement membrane matrix) | Corning | 356231 |
human recombinant Noggin | R&D | 6057-NG/CF |
human recombinant R-Spondin | Preprotech | 120-38 |
human recombinant EGF | Sigma-Aldrich | E9644-.2MG |
Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG |
A-83-01 | Tocris | 2939 |
SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067-5MG |
human [Leu]15-Gastrin 1 | Sigma-Aldrich | G9145-.1MG |
CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 |
Thiazovivin | Stemgent | 04-0017 |
TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red (cell dissociation enzyme) | Life technologies; Gibco | 12605-010 |
Fetal Bovine Serum | Life technologies; Gibco | 10082-147 |
CTS Synth-a-Freeze Medium (freezing medium) | Life technologies; Gibco | A13713-01 |
L Wnt-3A cell line | ATCC | CRL-2647 |
Renilla luciferase assay | Promega | E2710 |
human recombinant Wnt-3A | R&D | 5036-WN/CF |
HEK293 TOPflash cell line | – | – |