Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Selvbygging av komplekse Todimensjonale figurer fra Single DNA Fliser

Published: May 8, 2015 doi: 10.3791/52486
Automatic Translation
1, 2, 2, 2,3
1Tsinghua-Peking Center for Life Sciences, School of Life Sciences, Tsinghua University, 2Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering, Harvard University, 3Department of Systems Biology, Harvard Medical School

Introduction

Forrige nukleinsyre selvmonteringsarbeid 1-25 har ført til en vellykket bygging av en rekke komplekse strukturer, inkludert DNA 2 - 5,8,10 - 13,17,23 eller RNA 7,22 periodisk 3,4,7, 22 og algoritmisk 5 todimensjonale innhegninger, bånd 10,12 og rør 4,12,13, 3D krystaller 17, polyedre 11 og endelig, former 2D 7,8. En spesielt effektiv fremgangsmåte er stillaset DNA origami, hvorved en enkelt stillas tråd brettes av mange korte hjelpe stift strengene for å danne et kompleks form 9,14 - 16,18 - 21,25.

Vi har nylig rapportert en metode for å konstruere diskrete nanostrukturer med fastsatte 2D figurer ved hjelp av enkelt-strandet fliser (SST), og demonstrerte strukturer med kompleksitet sammenlignes med DNA origami 26. Dette article er en tilpasning av vår tidligere arbeidet 26 og beskriver detaljert protokoller for å arrangere individuelt adresser SSTS til sofistikerte endelig 2D figurer med nettopp foreskrevet dimensjoner (bredder og lengder) og morfologi. En viktig fordel med SST metoden er dens modularitet. Hver komponent SST av en struktur fungerer som en modulær konstruksjon enhet i forsamlingen, og ulike undergrupper av disse SSTS produsere forskjellige former. Dermed etablerte vi en generell plattform for å bygge nanostrukturer med foreskrevet størrelser og former fra korte, syntetiske DNA-trådene.

SSTS inneholde fire domener, hver 10 eller 11 nukleotider lang (Figur 1a). De SSTS binde slik at deres parallelle spiraler lage en DNA gitter holdt sammen av crossover bindinger. Hver crossover er fosfat mellom domenene 2 og 3. fosfat strekkes kunstig i diagrammene for visuell klarhet. Crossovers er plassert to skrueviklinger (21 baser) fra hverandre (<strong> Figur 1B). De sammensatte rektangler er referert til ved sine dimensjoner i antall helikser og skrueviklinger. For eksempel, et rektangel som er seks heliksene bred og åtte skrueviklinger lenge er referert til som en 6 H x 8T rektangel. SSTS kan bli tatt ut, lagt til, eller på annen måte omdisponeres til å skape strukturer av vilkårlige former og størrelser (figur 1C). For eksempel kan en rektangulær utforming bli rullet til et rør med en ønsket lengde og radius (figur 1D).

Alternativt kan den rektangulære SST gitteret bli sett på som en molekylær lerret består av SST piksler, hver 3 nm med 7 nm. I denne studien bruker vi en molekylær lerret av 310 helaftens interne SSTS, 24 helaftens SSTS gjøre opp venstre og høyre grenser, og 28 halv lengde SSTS danner de øvre og nedre grenser. Lerretet har 24 dobbeltrom helikser koblet av crossovers og hver helix inneholder 28 skrueviklinger (294 baser) og omtales derfor somen 24H × 28T rektangulær lerret. 24H × 28T lerretet har en molekylvekt lik som en DNA origami struktur opprettet fra en M13-fag stillaset.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. DNA Sequence Design

  1. Bruk UNIQUIMER programvare 27 for å designe et SST-endelig struktur ved å spesifisere antallet toseters helikser, lengder på topp og bunn helix for hver dobbeltspiralen, og crossover mønster for å skape en 24H × 28T lerret. Etter å ha definert disse parametre, blir den samlede arkitektur (tråd sammensetning og komplementaritet arrangement) vist grafisk i programmet.
  2. Generere sekvenser for trådene i den angitte strukturen for å møte komplementaritet arrangement og tilleggskrav (hvis noen). Design-DNA-sekvenser ved å minimere sekvensen symmetri 28 (for de fleste strukturer).
    1. Generere nukleotider (A, C, G og T) tilfeldig én etter én.
    2. Match nukleotider komplementære til de som genereres følgende base-paring regel: A til T og vice versa; C til G og vice versa.
    3. Ikke gjenta segmenter utover åtte eller ni nukleotider. Når en slik repspise segmenter dukke under design, mutere de sist genererte nukleotider til å gjenta-segmentet kravet er oppfylt.
    4. Ikke bruk fire sammenhengende A, C, G eller T baser.
    5. Bruk forhåndsspesifisert nukleotider på enkelt-trådede leddpunkter (for eksempel T og G som det tjueførste og tjueandre nukleotider, henholdsvis, for det meste av tråder) for å unngå glidende baser rundt leddpunktene (f.eks, hvis begge tjueførste og tjueandre nukleotider var T, var det mulig for den tjueførste nukleotid bindes til det nukleotid som den tjueandre nukleotid er ment å binde seg til).
  3. Modifisere DNA-sekvenser manuelt for streptavidin merking, transformasjonen av rektangler i rør, dannelsen av forskjellige rektangler og rør på tvers av ulike skalaer, og for å hindre aggregering forårsaket av utsatte domener på SST.
    1. Bytt ut de eksponerte områder på grensen av det molekylære lerret med poly-T traCTS.
    2. For streptavidin merking, utforme håndtaket segmentene (ekstra segment legges til komponenten tråd som kan binde seg til en komplementær motstykke, slik som et anti-håndtak tråd) slik at de kan tilpasses et anti-håndtak tråd med 3 'biotin modifikasjon.
    3. For konvertering av et rektangel i et rør, fjerne det øverste og nederste radene fra rektangel og sette inn en ny rad som SSTS har bestemt komplementaritet til tilsvarende fliser på den andre til øverste rad og den andre til nederste raden.
    4. For en utsatt enkelkjedete domenet av forskjellige former, erstatte med poly-T segmenter av 10-11 nukleotider lengde, eller dekk med kantbeskyttere som er komplementær til den eksponerte domene og avslutte med en 10-11 nucleotide lange poly-T segmenter.

2. Utarbeidelse av Molecular Canvas

  1. Innhente DNA-komponent tråder av spesifiserte sekvenser oppløst i RNase-fritt vann fra en oligonucleotide produsenten i V bunn 96 brønners plater med oligonukleotider syntetisert på 10 nmol skala med standard avsalting. Sentrifuger 96 brønners plater med DNA-trådene for omtrent 10 s ved 600 x g.
    1. Pipetter en pl fra hver av de 362 brønner med DNA-trådene for de 24H x 28T rektangel (figur 3A) ved 100 pM per tråd (produsentens spesifikasjoner) i en 2 ml prøverør. Legg 138 mL av destillert avionisert H2O til 2 ml prøverør for å lage en stamløsning av tråden blanding ved en konsentrasjon på 200 nM per tråd.
  2. Tilsett 50 pl av 200 nM forrådsløsning av tråd blanding, 10 ul 10X sammensmeltningsbuffer A (50 mM Tris, pH 7,9, 10 mM EDTA, 250 mM MgCl2), og 40 ul destillert avionisert H2O til en 0,2 ml PCR rør. Dette gjør en 100 ul prøve av det molekylære lerretet i 1 x annealing buffer A (5 mM Tris, pH 7,9, 1 mM EDTA, 25 mM MgCl2).
  3. Gløde sample for 17 timer i en termosykler avkjøling fra 90 ° C til 25 ° C. Program termosykler som følger: rampe ned fra 90 ° C til 61 ° C ved en konstant hastighet på 5 min per ° C; rampe ned fra 60 ° C til 25 ° C ved en konstant hastighet på 20 minutter per ° C; og inkuber ved 4 ° C inntil prøven kan tas ut av den termiske cycler.
  4. Forberede en innfødt 2% agarosegel.
    1. Mål 2,4 g agarose i et 600 ml begerglass. Legg 120 ml 0,5x TBE-buffer (44,5 mM Tris-borat, pH 8,3, 1 mM EDTA) og 30 ml destillert avionisert vann til begerglasset.
    2. Mikrobølgeovn i 3 min (eller 40 - 60 sek mer etter koking). Fylle vann som går tapt ved fordampning ved tilsetning av 30 ml vann, noe som bidrar til å opprettholde konsentrasjonen av agarose i gel ved 2%.
    3. Virvel innholdet i begerglasset i 1 min i et kaldt vannbad. Tilsett 1 ml 1,2 M MgCl2 (for å lage en 10 mM MgCl2-konsentrasjon i gelen) og pre-beis gel with 6 ul SYBR Safe fargestoff (1: 20.000).
    4. Hell gel løsning i en tørr gel boksen og sette inn en 1,5 mm tykk 12 godt gelelektroforese kam. La løsningen stivne 15 - 30 min på en jevn plattform.
    5. Hell gelen løpende buffer (44,5 mM Tris-borat, pH 8,3, 1 mM EDTA, og 10 mM MgCl2) inn i gelen boksen. Belastnings 2-3 ul av 1 kb DNA stige ned i en brønn på agarosegel. Bland 4 ul 6X bromfenol blått fargestoff (0,25% bromfenolblått, 5 mM Tris, 1 mM EDTA, 10 mM MgCl2 og 30% glycerol) med 20 ul av prøven av den molekylære lerretet og laste oppløsningen inn i en annen brønn av agarose gel.
  5. Kjør den innfødte 2% agarose for 2 timer ved 100 V i et isvannbad (bromfenolblått, vises i blått, går raskere enn komponent trådene slik at den kan fungere som en indikator på at hvis to timers driftstid er hensiktsmessig).
  6. Bilde gelen ved anvendelse av en gel skanner med et passende filter for SYBR sikker flekk (figur 2B
  7. På et blått lys transilluminator, skjære den dominerende bånd med lik mobilitet til båndet av 1500 basepar av 1 kb DNA stige med en skarp ren barberblad. Plasser den ønskede gel-bit (er) på en spinnkolonne og deretter knuse gelen til fine stykker ved hjelp av en mikrorør pistill. Sentrifuger ved 438 xg i 3 minutter ved 4 ° C.
  8. Måle konsentrasjonen av DNA ved hjelp av en ultrafiolett-spektrofotometer ved 260 nm.
    1. Bruke 2 mL av ultrarent DNase / RNase-Free destillert vann som tomt for å kalibrere maskinen.
    2. Bruke et tilsvarende volum av den innsamlede prøven fra spinnkolonne for å få et estimat av DNA-konsentrasjon. Den målte konsentrasjonsverdi ("a" = ng / mL) oppnådd ved en UV-absorpsjon på 260 nm vil bidra til å bestemme fortynningsfaktoren for AFM og TEM avbildning.
    3. Konvertere den målte konsentrasjonen fra "a" (ng / mL) for å "b" (nM) etter b = a × 10 6 / (330 &# 215; antall nukleotider).
      MERK: Molekylvekten av en nukleotid er 330 g / mol. Den beregnede molarkonsentrasjonen verdi vil avgjøre fortynningsfaktoren for AFM og TEM bildebehandling. Som for tilfellet med et 24H x 28T rektangel, er den felles måle for den rensede prøven omkring 10 til 60 ng / mL. Ettersom antallet nukleotider for en slik konstruksjon er 14 616 Da, er den molare konsentrasjon omtrent 2-12 nM. Den endelige konsentrasjonen bestemmes av samlingen utbytte (~ 20 - 50%) fra sentrifugering, og volumet av gelen båndet skåret ut (jo høyere volum, jo ​​mer fortynnet den rensede prøven).

3. Atomic Force Microscopy Imaging

  1. Skrelle av glimmer festet til en prøve metallisk plate ved hjelp av teip for å få en flat overflate og legg prøveplaten på bilde scenen.
  2. Legg 40 ul av 1 x annealing buffer A, etterfulgt av 5 pl (2-5 nM) av den rensede prøve av 24H x 28Trektangel til ferskt spaltet glimmer overflaten. La blandingen til å bosette seg i ca 2 min.
  3. Installer AFM siliciumnitrid cantilever chip på en cantilever holder. Bruk en C trekantet spiss (resonansfrekvens, f 0 = 40 - 75 kHz, fjærkonstant, k = 0,24 Nm -1) for bildebehandling.
  4. Bilde en prøve i væsken gjeng modus. Bruk følgende bildeparametre for skanning: skann størrelse på 2 mikrometer, 1024 linjer for oppløsning, og en scan rate på 0,5 til 1 Hz (figur 2C).
  5. Hvis det er nødvendig, tilsett 10 pl eller flere av 10 mM NiCl2 løsning for å øke styrken av DNA-bindende 29 glimmer.

4. Prøvepreparering for streptavidin Merking

  1. Manuelt utforme 24H x 28T rektangel, slik at håndtaks tråder på bestemte steder er tatt med for å være komplementære til de anti-håndtaket tråder med biotin modifikasjon, som i sin tur er i stand til å binde seg til streptavidi spesielt.
    1. Modifisere molekyl lerretet ved å feste en 3 '17-nukleotid-segment som består av en to-nukleotidsekvens (TT) som et avstandsstykke og en 15-nukleotid-håndtak (GGAAGGGATGGAGGA) til de 14 brikkene på den øverste raden og 14 fliser på bunnen rad av rektangelet (figur 3A) for å merke grensen. Denne sekvens er komplementær til en 3 'biotin modifisert anti-håndtak tråd (TCCTCCATCCCTTCC-biotin).
  2. For intern merking, feste 3 '17 nukleotidsegment 8 interne fliser og seks grense fliser av rektangelet (Figur 4A).
    1. Bland de 28 trådene med håndtak (grensemerking) med resten av komponent tråder av 24H × 28T rektangel (334 tråder) å lage en 200 nM stamløsning. Bland 14 tråder med håndtak (intern merking) med resten av komponent tråder av 24H x 28T rektangel (348 tråder) for å oppnå en 200 nM forrådsløsning.
  3. For boundary merking, tilsett 50 ul av 200 nM forrådsløsning av de strenger, 6 ul av 100 uM biotin modifisert anti-strenger, håndtak 10 ul av 10X annealing buffer A og 34 pl destillert deionisert vann til en 0,1 til 0,2 PCR ml reagensrør. Den endelige konsentrasjonen av komponenten tråd er 100 nM, og den endelige konsentrasjon av anti-biotin håndtaket modifiserte tråd er 6,000 nM. Legg merke til at 28 molekyler av anti-biotin håndtak modifisert tråd binder til det 24 x 28T rektangel, slik at anti-biotin håndtak modifisert tråd er i overkant av 100% for å gjøre bindingen gunstig.
  4. For intern merking, tilsett 50 pl av 200 nM forrådsløsning av de strenger, 3 ul av det innvendige håndtak anti-biotin modifiserte tråd på 100 uM, 10 ul av 10X sammensmeltningsbuffer A, 37 ul destillert deionisert vann til en 0,1 - 0,2 ml PCR-reagensrør. Den endelige konsentrasjonen av komponenten tråd er 100 nM, og den endelige konsentrasjon av anti-biotin håndtaket modifi ed strand er 3000 nM. Legg merke til at 14 molekyler av anti-biotin håndtaket modifiserte tråd binder seg til det 24 x 28T rektangel slik at anti-biotin håndtere modifisert tråd er i overkant av 100% for å gjøre bindingen gunstig.
  5. Anneale begge prøvene i en termosykler for 17 timer ved hjelp av trinnene som er beskrevet i punkt 2.3.
  6. Forberede en innfødt 2% agarosegel som beskrevet i trinn 2.4.
  7. Rens begge prøver som er beskrevet i trinn 2,5.
  8. Måle konsentrasjonene av de ønskede DNA-konstruksjoner som er beskrevet i trinn 2.6.

5. Atomic Force Microscopy For streptavidin Merking

  1. Bilde hver prøve ved hjelp av en AFM som beskrevet i trinn 3 (figurene 3B og 4B).
  2. Etter den første runden av bildebehandling, tilsett 40 ul 1X gløding buffer A etterfulgt av en ul streptavidin på 10 mg / ml til prøven. La blandingen til å bosette seg i ca 2 min før reimaging (Tall 3C og 4C).
_title "> 6. Konvertering et rektangel til et rør

  1. For å utforme et rør basert på rektangelet, holde alle komponent SSTS på plass bortsett fra de øverste og nederste radene. Introdusere en ny rad hvis SSTS er utformet ved å lenke sammen de øverste og nederste halv fliser av sine respektive kolonner til cyklisere den opprinnelige rektangel i et rør konformasjon (figur 5A).
  2. Bland den nye raden av tråder (14 tråder) med komponenten tråder av 24H x 28T rektangel med unntak av de øvre og nedre rader (336 tråder) for å oppnå en 200 nM forrådsløsning.
  3. Følg gelrensing trinn 02.02 til 02.07 (Figur 5B).

7. transmisjonselektronmikroskop Imaging

  1. Veie 0,06 g av uranyl formiat i 3 ml destillert vann for å fremstille en 2% vandig uranyl formiat fargende oppløsning. Filtrer den 2% vandige uranyl formiat fargende oppløsning ved bruk av en 0,2 pm filter festet til en sprøyte.
    1. Tilsett 5 mL av5 N NaOH til en ml filtrert fargende oppløsning. I korthet vortex-oppløsning og sentrifuger ved 20 000 x g.
  2. Glow utslipp av kullbelagt nett (belagt siden opp) med følgende innstillinger: 25 mA, 45 s, 0,1 mbar, og negative høy spenning polaritet.
  3. Bruk selvlukkende pinsett til å ta en glød discharger behandlet rutenett fra kanten.
  4. Pipetter 3,5 ul prøve på gitteret i 4 min. Bruke et stykke filterpapir for å transportere ut av prøven ved å bringe filterpapiret i kontakt med risten fra siden.
  5. Tilsett umiddelbart 3,5 mL av flekken løsningen på gitteret i 1 min.
  6. Veke av flekken som i 7.4 og hold filterpapiret mot gitteret i 1 - 2 minutter.
  7. Overfør rutenettet til en TEM prøveholder og bilde ved hjelp av et JEOL JEM-1400 drives med 80 kV med forstørrelse fra 10 K til 80 K (figur 5C).

8. Bygging av vilkårlige former Bruke holder molekylar Canvas

  1. Identifisere en form og velger strengene som svarer til formen på den molekylære lerretet. For en trekant form for eksempel velge 206 ut 362 tråder for molekylær lerret.
  2. Erstatte den eksponerte domenet (det vil si langs hypotenusen i trekanten) med poly-T-segmentet 10 - 11 nukleotider lang (design 1 i figur 6A), eller legge til en kantbeskytter som er komplementær til den eksponerte domenet og avslutte den med en 10 - 11-nukleotid lange poly-T-segmentet (design 2 i figur 6A) for å forhindre aggregering.
    MERK: Bare gløde SSTS som tilsvarer pikslene i trekanten (uten å bruke beskyttelses tråder) vil føre til aggregering og ingen distinkt produkt bandet formasjon på en gel. Bruk kantbeskytter design for ulike former som det er mer ressurseffektive; det krever bare fire ekstra sett med strenger (figur 6C) sammenlignet med 14 ekstra sett i erstatning design (Figure 6B).
  3. Lag en tråd biblioteket for 310-pixel molekylær lerret som inkluderer kjernesett (362 SST lerretet), sett 1 * (kantbeskyttere som binder seg til domene en av SST), sett 2 * (kantbeskyttere som binder til domene 2 av en SST), Set 3 * (kantbeskyttere som binder seg til domenet 3 av en SST), og Set 4 * (kantbeskyttere som binder seg til domenet 4 av SST) for å gi totalt 1344 kantbeskyttere.
  4. Sentrifuger 96-brønners plater for de ulike sett for omtrent 10 s. Pipetter ut de ønskede tråder fra platene for å gjøre en stamløsning for en bestemt form.
    1. For den form av en trekant med kantbeskyttere, pipettes 1 pl av 206 tråder fra kjernen sett fra 0, sett 1 * 0, set fra 2 *, 0 set fra 3 * og 24 tråder fra settet 4 * i en 2 ml sentrifuge rør. Tilsett 20 mL destillert avionisert vann til røret for å lage en 400 nM forrådsløsning av DNA-trådene.
  5. Tilsett 50 pl av 400 nM forrådsløsning av DNA stra nds, 10 ul av 10X sammensmeltningsbuffer B (50 mM Tris, pH 7,9, 10 mM EDTA, 125 mM MgCl2) forrådsoppløsning og 40 pl destillert avionisert H2O til et 0,2 ml PCR-rør. Dette gjør en 100 pl prøve av trekanten i 1 x annealing buffer B (5 mM Tris, pH 7,9, 1 mM EDTA, 12,5 mM MgCl2) med tråder i en konsentrasjon på omtrent 200 nM per tråd.
  6. Glødning av blandingen i en termosykler for 17 timer som beskrevet i trinn 2.3.
  7. Forberede en innfødt 2% agarosegel som beskrevet i trinn 2.4.
  8. Rens prøven som beskrevet i trinn 2.5.
  9. Måle konsentrasjonen av DNA som beskrevet i trinn 2.6.
  10. Bildet prøven som AFM som beskrevet i trinn 3 (figur 7C og 7D).
  11. Plukke og mikse tråder for ulike former som bruker samme tråd biblioteket. Gløde ulike løsninger og kombinere rensede prøver av forskjellige former for å spare tid under AFM avbildning.
jove_title "> 9. Valgfritt: Robot Automation Of Shape Design og væskeblanding

  1. Bruk en tilpasset MATLAB program for å hjelpe utformingen av komplekse former.
  2. Bruk programvare for å levere instruksjoner i form av en pipettering sekvens til en robot væskebehandler. Bruk roboten væskebehandler for å velge og blande trådene som utgjør målet form.
    MERK: Shape design og strand miksing ble automatisert for å redusere menneskelige feil og gjøre konstruksjonen mindre arbeidskrevende.

10. rektangler og rør på tvers av ulike Scales

  1. Konstruere forskjellige størrelser rektangler (figur 10) ved ganske enkelt å endre antallet parallelle helikser (H) og antallet av skrueformede vindinger (t).
  2. Følg Trinn 3 for en bestemt størrelse rektangel.
  3. Følg trinn 6 for en bestemt størrelse tube.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den selvbygging av SSTS (figur 1) vil gi et 24H x 28T rektangel, som illustrert i figur 2. DNA-sekvenser for de ulike SSTS kan modifiseres / optimalisert for å muliggjøre merking streptavidin (figur 3 og 4), transformasjon av en rektangel til et rør (figur 5), den programmerbare selvbygging av SSTS å danne rør og rektangler av varierende størrelse (figur 10), og konstruksjonen av 2D vilkårlige former ved hjelp av molekyl lerretet (figur 8). To design (domene substitusjon design og kantbeskytter design) ble testet som løsninger for å aggregering langs utsatte områder av vilkårlige former (figur 7). Begge design har tilsvarende gel yield og strukturell integritet, men kantbeskytter design er mer kostnadseffektivt fordi det krever færre hjelpe arter (figur 6).Strand plukking og blanding kan automatiseres, slik som vist i figur 9 for å redusere menneskelige feil og spare tid.

Figur 1
Figur 1. Selvmontering for molekylær Shapes Bruke Enkelt-strandet fliser. (A) Den kanoniske SST motiv, tilpasset fra 12 (B) Venstre og midten:. To skildringer av sammensatte SSTS. Indre SSTS har en full lengde på 42 baser og er merket "U", mens grense SSTS har 21 baser og er merket "L". I venstre diagram, farger skille mellom forskjellige domener. I den midtre diagram, farger skille mellom forskjellige tråder. Høyre: En skjematisk av murveggen visning av SST strukturer. Tykke klosser er fulle SSTS og tynne mursteinene er grense SSTS. Avrundede kanter indikerer ingen utfyllende sammenkobling. Som i midten figuren, farger skille de enkelte fliser. I alle diagværer, har hver flis en unik sekvens. (C) Tilbakeholdelse av et passende valg av tråder fra SST samlingen som utgjør rektangelet utformingen i figur B fører til dannelse av en annen ønsket form slik som en trekant (venstre) eller en rektangulær ring (høyre). (D) Utformingen av et rør med en forutbestemt bredde og lengde. (E) Gitt en pre-syntetisert pool av SST-sekvenser (øverst), vilkårlige former (bunn) kan være konstruert ved å velge et delsett av strengene for å bruke i tråd blanding (mørk blå piksler) og eliminere resten (lys blå piksler). Dette tallet har blitt forandret fra en tidligere publisert figur 26. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Design og AFM bilde av 24H × 28T rektangel. (A) Skjematisk tegning av 24H x 28T rektangel. En zoomet inn view er også vist for den detaljerte lokale struktur. Den enkelte SST segment ordningen er enten 10 nt - 11 nt - 11 nt - 10 nt (f.eks a2.13-b2.13-a1.13 * -b1.12 *) eller 11 nt - 10 nt- 10 nt - 11 nt (f.eks a3.12-b3.12-a2.13 * -b2.12 *). Trekanter på venstre side av rektangelet viser rader med 10NT-11nt-11nt-10NT SST arrangement; de andre interne SSTS har 11 nt - 10 nt -10 nt- 11 nt i stedet (nt er et akronym for nucleotide). Siden 24H × 28T SST rektangel har tilsvarende dimensjoner til en DNA origami struktur, kriteriet introdusert i DNA origami arbeid og vurdere en SST rektangel "velformet" hvis det ikke har noen feil i den forventede omrisset større enn 15 nm i diameter var vedtatt. I tillegg er en "well-formed" rektangel struktur has ingen hull i interiøret større enn 10 nm i diameter var nødvendig. Ved å følge de ovennevnte kriteriene, var en "well-dannelse" grad på 55% (N = 163) erholdt. En rød stjerne (*) viser nedre venstre hjørne av rektangelet her. (B) 2% innfødte agarosegelelektroforese. U, urenset; P, ble renset (ved gel ekstraksjon fra lane U) (C) AFM bilde av gitterstrukturen. (Scanning størrelse: 2 um x 2 um). Dette tallet har blitt forandret fra en tidligere publisert figur 26. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Boundary Merking av 24H × 28T rektangel. (A) Skjematisk tegning av den spesifikke biOtin-merket 24H × 28T rektangel. Trådene uthevet i blått er håndtaket tråder. Trådene markert med rødt er de anti-håndtak tråder merket med 3 'biotin (svarte prikker). Streptavidin er avbildet som en oransje ball (B) AFM bilde før du legger streptavidin (skanning størrelse: 1 mikrometer × 1 mikrometer).. (C) AFM bilde etter tilsetting streptavidin (skanning størrelse: 1 mikrometer × 1 mikrometer). Inset, en zoomet inn skisse som viser vellykket merking. Merk at streptavidin dukket opp som enten hvite prikker eller striper på grunn av sine hevet høyder. Dette tallet har blitt forandret fra en tidligere publisert figur 26. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Iintern Merking av 24H × 28T rektangel. (A) Skjematisk tegning av den spesifikke biotin-merket 24H x 28T rektangel. Trådene uthevet i blått er håndtaket tråder. Trådene markert med rødt er de anti-håndtak tråder merket med 3 'biotin (svarte prikker). Streptavidin er avbildet som en oransje ball (B) AFM bilde før du legger streptavidin (skanning størrelse: 1 mikrometer × 1 mikrometer).. (C) AFM bilde etter tilsetting streptavidin (skanning størrelse: 1 mikrometer × 1 mikrometer). Inset, en zoomet inn skisse som viser vellykket merking. Merk at streptavidin dukket opp enten som hvite prikker eller striper på grunn av de hevede høyder. Dette tallet har blitt forandret fra en tidligere publisert figur 26. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

innen-side = "always"> Figur 5
Figur 5. Design og TEM Bilde av 24H × 28T Tube. (A) Skjematisk tegning av 24H x 28T fat. To zoomet inn utsikten på toppen og bunnen viser detalj segmentet identiteter. Merk at segmentene a24.x * (f.eks a24.13 *) og b24.x * (f.eks b24.12 *) i den øverste raden er komplementære til segmenter a24.x (f.eks a24.13) og b24.x (f.eks b24.12) av den nederste rad; slik komplementaritet er forventet å resultere i dannelsen av den rørformede strukturen. (b) 2% naturlig agarosegel-elektroforese. U, urenset; P, renset (ved gel utvinning fra felt U) (C) TEM bilde av fatet struktur (skala bar: 100 nm).. Dette tallet har blitt forandret fra en tidligere publisert figur 26.ighres.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6
Figur 6. to modeller å hindre Aggregation forårsaket av Exposed Sticky domener. (A) en side-ved-side demonstrasjon av to metoder for å dekke eksponerte områder. Det uparede klebrige domene (domene 4) er angitt med en rød, stiplet boks. Design 1 er domenet substitusjon utforming, i hvilken den uparede domenet er substituert med en poly-t domene (vist i rødt, og som er merket "T"). Design 2 er den kantbeskytter design, som innebærer dekker uparet domene med en kantbeskytter tråd (vist i rød og merket "T-4 *"). Den kantbeskytter tråd er sammensatt av en poly-T-delen, og et supplement til den eksponerte domene. (B) De forskjellige mulige konfigurasjoner grense forbundet med domene substitusjon (design 1).Det er 14 forskjellige måter en intern SST (markert med blått) kan avsette en utsatt domene eller domener. De passende streng substitusjoner er vist i rødt for hver situasjon. (C) Det kantbeskytter design (design 2). En intern SST (blå) krever bare fire kantbeskytter tråder (rød) for å dekke utsatte domener som bruker denne designen. Dette tallet har blitt forandret fra en tidligere publisert figur 26. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 7
Figur 7. To Design for SST Triangle. (A) og (B) viser skjematisk basert på (domene substitusjon) og design 2 (kantbeskytter) utforming 1 i Figur 8, henholdsvis. En poly-T region (T10 eller T11 i figuren) er avbildet somet avrundet hjørne i blokkskjemaet. Det innfelte viser et forstørret bilde av strukturen indikert med stiplet ramme. Skala barer, 100 nm. (C) og (d) er de AFM bilder. Dette tallet har blitt forandret fra en tidligere publisert figur 26.

Figur 8
Figur 8. diagrammer og AFM Bilder av 100 forskjellige former. Struktur design vises i toppen paneler. Lys blå farge indikerer lerretet tråder utelatt av blandingen mens mørk blå farge indikerer trådene inkludert. For klarhet, er kantbeskytter tråder utelatt. En tilsvarende AFM bilde av hver struktur er vist under sin utforming. Hvert bilde er 150 nm × 150 nm i området. Det er 100 unike former. Inkludert er 10 arabiske tall, de 26 store bokstaver i det latinske alfabetet, 23 skilletegn og keyboard symboler, 10 uttrykksikoner, 9 astrologiske symboler, seks kinesiske tegn, og flere diverse symboler. Dette tallet har blitt forandret fra en tidligere publisert figur 26. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 9
Figur 9. Robot Automation flytdiagrammet. Dette diagrammet viser arbeidsflyten som brukes for å automatisere blandeprosessen. Først blir en tilpasset MATLAB program som brukes til å designe den ønskede formen. Igjen, mørk blå rektangler angir de tråder som skal inngå i blandingen. Etter utformingen er fullført, sender programmet et sett av instruksjoner for pipettering robotvæskebehandler. Roboten pipetter de riktige konsentrasjoner av passende tråder på en spesiell form til en plate godt. Blandingen ble deretter gjennomgår en gryte gløding, etterfulgt av AFM avbildning av de resulterende former. (Dette tallet har blitt forandret fra en tidligere publisert figur 26). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 10
Figur 10. Self-Montering av rektangler og rør på tvers av ulike skalaer. (A) AFM bilder av SST rektangler med følgende designet dimensjoner (fra venstre til høyre):. 4H × 4T, 6 H × 7t, 10H × 10T, 12H × 14T, 18t × 20T, 24T × 28T, og 36h × 34T ( B) Molekylvektene for de strukturer er på en logaritmisk skala. Stjernen indikerer vekten av et typisk M13 DNA origami struktur som referanse. (C) TEM-bilderav SST rør med følgende designet dimensjoner (fra venstre til høyre): 8H × 28T, 8E × 55T, 8E × 84T, 24T × 28T, og 12H × 177T. Alle skala barer viser 100 nm. Dette tallet har blitt forandret fra en tidligere publisert figur 26. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I strukturen dannelsestrinnet, er det viktig å holde en passende konsentrasjon av magnesium-kationer (f.eks., 15 mM) i DNA-tråden blandingen til selv montere DNA nanostrukturer. Tilsvarende, i agarosegelen karakteriser / rensetrinnet, er det viktig å holde en passende konsentrasjon magnesium kation (f.eks., 10 mM) i gelen og gelen rennende buffer for å opprettholde DNA-nanostrukturer under elektroforese. For 24H x 28T rektangel struktur, testet vi gløding i forskjellige konsentrasjoner, og Mg ++ funnet at strukturen typisk dannet i området fra 10 - 30 mM Mg ++ (som har den beste utbyttet med formasjonen rundt 20 mM Mg ++).

I motsetning til stillaset origami struktur, har SST strukturen en modulær arkitektur. Forskjellige former kan være konstruert fra den samme lerretet ved å velge det passende undergruppe av SST fliser. I tillegg er SST struktur sammen from bare korte syntetiske DNA-tråder og ikke innebærer en lang stillaset som brukes i origami tilnærming. Derfor er størrelsen av SST strukturen ikke begrenset av lengden av den tilgjengelige stillaset. Men mens DNA origami tilnærmingen kan ofte være optimalisert for å fremstille enten brettet strukturer eller ubrettede monomerer, kan SST resultere i delvis formede strukturer og kan således kreve gelrensing for senere bruk. I tillegg, på grunn av mangel på et stillas tråd, kan et SST struktur være mer "skjør" enn dens DNA origami motstykke. Både SST tilnærming og DNA origami tilnærming er rask utvikling, og en bruker rådet til å velge en tilnærming som passer best for hans eller hennes spesielle funksjonelle behov.

Det er påfallende at hundrevis av små monomerer mediert kun av lokale forpliktende samhandling kan selv montere inn en foreskrevet global form, som demonstrert av SST tilnærming. De grunnleggende prinsippene som er vist i SST tilnærming should kunne generaliseres til materialer ved siden av DNA-trådene, og den grunnleggende metoden beskrevet i denne artikkelen, etter passende endring, bør gjøre det mulig for konstruksjoner av komplekse strukturer selv sammensatt av ulike materialer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble finansiert av Office of Naval Research Young Investigator Program Award N000141110914, Office of Naval Research Grant N000141010827, NSF KARRIERE Award CCF1054898, NIH direktørens New Innovator Award 1DP2OD007292 og Wyss Institutt for Biologisk Inspirert teknikk Fakultet Startup Fund (til PY) og Tsinghua-Peking Senter for miljø- og biovitenskap Startup Fund (til BW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DNA Strands  Integrated DNA Technology Section 3.1
SYBR Safe DNA gel stain Invitrogen S33102 Section 3.4.2
Freeze'N Squeeze DNA Gel Extraction Spin Columns BIO-RAD 731-6166 Section 3.6
Bruker's Sharp Nitride Lever Probes Bruker AFM Probes SNL10 Section 4.3
Safe Imager 2.0 Blue Light Transilluminator Invitrogen G6600 Section 3.6
Centrifuge 5430R Eppendorf 5428 000.414 Section 3.6
Transmission Electron Microscope  Jeol Jem 1400 Section 7.4
Multimode 8 Veeco Section 4
Typhoon FLA 9000 Laser Scanner GE Heathcare Life Sciences 28-9558-08 Section 3.5
Ultrapure Distilled water Invitrogen 10977-023 Section 3.7.1
Mica disk SPI Supplies 12001-26-2 Section 4.1
Steel mounting disk Ted Pella, Inc. 16218 Section 4.1
carbon coated copper grid for TEM Electron Microscopy Sciences FCF400-Cu Section 7.2
tweezers Dumont 0203-N5AC-PO Section 7.31
glow discharge system Quorum Technologies K100X Section 7.2
DNA Engine Tetrad 2 Peltier Thermal Cycler BIO-RAD PTC–0240G Section 3.3
Owl Easycast B2 Mini Gel Electrophoresis Systems ThermoScientific B2 Section 3.4.3
Seekam LE Agarose 500G Lonza 50004 Section 3.4.1
GeneRuler 1kb Plus DNA Ladder, Ready-To-Use 75-20000bp ThermoScientific SM1333 Section 3.4.4
Nanodrop 2000c UV-vis Spectrophotometer ThermoScientific Section 3.7
0.2 um filter Corning Inc. 431219 Section 7.1.2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Seeman, N. C. Nucleic acid junctions and lattices. J. Theor. Biol. 99 (2), 237-247 (1982).
  2. Fu, T. J., Seeman, N. C. DNA double-crossover molecules. Biochemistry. 32 (13), 3211-3220 (1993).
  3. Winfree, E., Liu, F., Wenzler, L. A., Seeman, N. C. Design and self-assembly of two-dimensional DNA crystals. Nature. 394 (6693), 539-544 (1998).
  4. Yan, H., Park, S. H., Finkelstein, G., Reif, J. H., LaBean, T. H. DNA-templated self-assembly of protein arrays and highly conductive nanowires. Science. 301 (5641), 1882-1884 (2003).
  5. Rothemund, P. W. K., Papadakis, N., Winfree, E. Algorithmic self-assembly of DNA Sierpinski triangles. PLoS Biol. 2 (12), e424 (2004).
  6. Shih, W., Quispe, J., Joyce, G. A 1.7-kilobase single-stranded DNA that folds into a nanoscale octahedron. Nature. 427 (6975), 618-621 (2004).
  7. Chworos, A., et al. Building programmable jigsaw puzzles with RNA. Science. 306 (5704), 2068-2072 (2004).
  8. Park, S. H., et al. Finite-size, fully-addressable DNA tile lattices formed by hierarchical assembly procedures. Angew. Chem. Int. Ed. 45 (5), 735-739 (2006).
  9. Rothemund, P. W. K. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).
  10. Schulman, R., Winfree, E. Synthesis of crystals with a programmable kinetic barrier to nucleation. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 104 (39), 15236-15241 (2007).
  11. He, Y., et al. Hierarchical self-assembly of DNA into symmetric supramolecular polyhedra. Nature. 452 (7184), 198-201 (2008).
  12. Yin, P., et al. Programming DNA tube circumferences. Science. 321 (5890), 824-826 (2008).
  13. Sharma, J., et al. Control of self-assembly of DNA tubules through integration of gold nanoparticles. Science. 323 (5910), 112-116 (2009).
  14. Douglas, S. M., Dietz, H., Liedl, T., Högberg, B., Graf, F., Shih, W. M. Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes. Nature. 459 (7245), 414-418 (2009).
  15. Andersen, E. S., et al. Self-assembly of a nanoscale DNA box with a controllable lid. Nature. 459 (7243), 73-76 (2009).
  16. Dietz, H., Douglas, S. M., Shih, W. M. Folding DNA into twisted and curved nanoscale shapes. Science. 325 (5941), 725-730 (2009).
  17. Zheng, J. P., et al. From molecular to macroscopic via the rational design of self-assembled 3D. DNA crystal. Nature. 461 (7260), 74-77 (2009).
  18. Han, D., et al. DNA origami with complex curvatures in three-dimensional space. Science. 332 (6024), 342-346 (2011).
  19. Liu, W., Zhong, H., Wang, R., Seeman, N. C. Crystalline two-dimensional DNA origami arrays. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (1), 264-267 (2011).
  20. Zhao, Z., Liu, Y., Yan, H. Organizing DNA origami tiles into larger structures using preformed scaffold frames. Nano Lett. 11 (7), 2997-3002 (2011).
  21. Woo, S., Rothemund, P. Programmable molecular recognition based on the geometry of DNA nanostructures. Nat. Chem. 3 (8), 620-627 (2011).
  22. Delebecque, C. J., Lindner, A. B., Silver, P. A., Aldaye, F. A. Organization of intracellular reactions with rationally designed RNA assemblies. Science. 333 (6041), 470-474 (2011).
  23. Lin, C., Liu, Y., Rinker, S., Yan, H. DNA tile based self-assembly: building complex nanoarchitectures. ChemPhysChem. 7 (8), 1641-1647 (2006).
  24. Seeman, N. C. Nanomaterials based on DNA. Annu. Rev. Biochem. 79 (1), 65-87 (2010).
  25. Voigt, N. V., Nangreave, J., Yan, H., Gothelf, K. V. DNA origami: a quantum leap for self-assembly of complex structures. Chem. Soc. Rev. 40 (12), 5636-5646 (2011).
  26. Wei, B., Dai, M., Yin, P. Complex Shapes self-assembled from single stranded DNA tiles. Nature. 485 (7400), 623-626 (2012).
  27. Wei, B., Wang, Z., Mi, Y. Uniquimer: software of de novo DNA sequence generation for DNA self-assembly: an introduction and the related applications in DNA self-assembly. J. Comput. Theor. Nanosci. 4 (1), 133-141 (2007).
  28. Seeman, N. C. De novo design of sequences for nucleic acid structural engineering. J. Biomol. Struct. Dyn. 8 (3), 573-581 (1990).
  29. Hansma, H. G., Laney, D. E. DNA binding to mica correlates with cationic radius: assay by atomic force microscopy. Biophys. J. 70 (4), 1933-1939 (1996).
  30. Seelig, G., Soloveichik, D., Zhang, D. Y., Winfree, E. Enzyme-free nucleic acid logic circuits. Science. 314 (5805), 1585-1588 (2006).
  31. Yin, P., Choi, H. M. T., Calvert, C. R., Pierce, N. A. Programming biomolecular self-assembly pathways. Nature. 451 (7176), 318-322 (2008).

Tags

Kjemi selvbygging DNA fliser enkelt-strandet fliser molekylær lerret molekylær pixel programmerbare nanostrukturer DNA nanoteknologi
Selvbygging av komplekse Todimensjonale figurer fra Single DNA Fliser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wei, B., Vhudzijena, M. K.,… More

Wei, B., Vhudzijena, M. K., Robaszewski, J., Yin, P. Self-assembly of Complex Two-dimensional Shapes from Single-stranded DNA Tiles. J. Vis. Exp. (99), e52486, doi:10.3791/52486 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter