Introduction
تتبع مسار التشريحية هي واحدة من الأدوات المستخدمة الأكثر شيوعا فك العلاقة بين الدماغ والسلوك 1. التقدم في تقنيات تتبع الدائرة العصبية أسبغها علماء الأعصاب لديهم القدرة على تتبع الدوائر العصبية من الخلايا العصبية التي تم تحديدها السكان وراثيا في الفئران 2. وعلى الرغم من هذه التطورات التقنية التي لا يزال تحديا لكشف تشكيل الدوائر العصبية وخاصة أثناء نضوج الجنينية. وذلك لأن معظم طرق تتبع ضعت حتى الآن تعتمد على حقن التجسيمي من استشفاف عبر التشابك أو الفيروسات موجه للعصب المعدلة وراثيا (الشكل 1) 2،3. في حين أن هذه التقنيات في تحقيق قرار المكاني والزماني للاتصال، العديد من القيود المتأصلة مثل الحقن تحديا تقنيا التتبع في الدماغ النامية، استنساخ موقع الحقن، والتهاب محتمل في موقع الحقن والأكثر المجمدةسمية الخلايا tantly التي تسببها الفيروسات موجه للعصب تحد من استخدامها 4.
طريقة بديلة هو للتعبير عن استشفاف عبر التشابك كما الجينات المحورة في الفئران المعدلة وراثيا. لقد تم تعديلها مؤخرا هذه التقنية، ووضع عبر التشابك الجيني النظام الثنائي تتبع لرسم خريطة الدوائر العصبية من الخلايا العصبية التي تم تحديدها أية مجموعة من السكان وراثيا 5. ويستند لدينا استراتيجية تجريبية على اثنين من سلالات جديدة الضربة القاضية في الماوس والتي تعبر إما كتين ثنائي الاتجاه التتبع الشعير (BL) 6 أو التتبع الوراء الكزاز السمية جزء C تنصهر إلى GFP (GTT) 7 من موضع ROSA 26 بعد بوساطة لجنة المساواة العرقية- إعادة التركيب. نحن هنا تستخدم هذه السلالات الماوس للتعبير عن انتقائي BL وGTT في الخلايا العصبية التي تنتج kisspeptin، وهو نيوروببتيد الذي تورط في تنظيم نضوج محور الإنجاب 8،9. علينا أن نظهر أن هذه التقنية هي مناسبة لتصور تنمية ونضوج قبلةالدوائر العصبية peptin أثناء التطور الجنيني للدماغ الفأر الإناث 5.
استراتيجية تربية
وR26-BL-IRES-τlacZ (BIZ) وR26-GFP-TTC (GTT) خطوط التتبع هي الضربة القاضية في سلالات 5 التي تحمل أليل ROSA26 المؤتلف. وR26-BIZ والأليلات R26-GTT صامتون transcriptionally بسبب وجود إشارة توقف النسخي قوية، والتي يحيط بها موقعين loxP 5. يتم تنشيط تعبير عن BIZ وGTT التحوير عن طريق إزالة لجنة المساواة العرقية بوساطة إشارة توقف النسخي. الأليلات R26-R26-BIZ وGTT يمكن استخدامها بشكل مستقل من قبل ببساطة الحدودي مع خط سائق لجنة المساواة العرقية. يمكن للحيوانات تحليل متخالف لجنة المساواة العرقية وR26 الأليلات منها استخدامها. تتزاحم تحمل لجنة المساواة العرقية واحد أو واحدة R26 أليل، على التوالي، وينبغي أن تستخدم والضوابط. بدلا من ذلك، فمن الممكن أيضا لتوليد رriple الضربة القاضية في الحيوانات التي تحمل لجنة المساواة العرقية، R26-R26-BIZ وGTT الأليلات، ولكن هذا سيتطلب واحد عبر إضافية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وتمت الموافقة على إجراءات التي تجرى على الحيوانات من قبل لجنة رعاية الحيوان من جامعة هامبورغ وجامعة سارلاند: ملاحظة: أخلاقيات الإعلان.
1. إعداد وتثبيت من الأنسجة الجنينية
- ترتيب جميع المعدات اللازمة لتشريح من الأجنة وإعداد الحلول لتثبيت لاحق من الأنسجة قبل التضحية الحيوانات.
ملاحظة: إعداد دائما الطازجة بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) حل (4٪ PFA في 0.1 M الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، وضبط درجة الحموضة إلى 7.4). - الموت ببطء توقيت الماوس الإناث الحوامل مع إجراء الموافقة أخلاقيا.
- نقل الماوس في الصعود إلى المنصة. الرطب الجانب البطني من البطن مع الايثانول 70٪ وجعل شق عمودي باستخدام مقص حاد لفضح تجويف البطن.
- تحديد سلسلة الجنينية والخروج به باستخدام ملقط بعناية حادة ووضعه في برنامج تلفزيوني الجليد الباردة.
- إزالة الأجنة الفردية منسلسلة الجنينية باستخدام مقص الجميلة وملقط. إزالة الأنسجة الزائدة حول الأجنة وغسلها في برنامج تلفزيوني الجليد الباردة.
- أخذ خزعة ذيل صغير (قبل نقل الجنين إلى PFA)، واحتضان في ذيل العازلة تحلل لتحديد نوع الجنس والتتبع أليل التنميط الجيني PCR.
- نبدأ من الجنين في الجانب الأكثر الجانبي ونقل كل جنين منفصل في أنبوب يحتوي على الجليد الباردة PFA 4٪ على الجليد على شاكر.
- نقع الأجنة في سن E13.5 أو أقل مقابل 1.5 ساعة على الجليد مع الهز المستمر. نقع الأجنة في E14.5 العمر وE15.5 مقابل 2.5 ساعة على الجليد مع الهز المستمر.
- لE16.5 الأجنة العمر أو كبار السن، وقطع رأس وإزالة الجلد الخارجي قبل تمرغ رأسه في حل PFA. رؤساء الأجنة E16.5 يمكن أن تكون غارقة ل 4.5 ساعة على الجليد مع الهز المستمر.
- بعد تثبيت المناسب، وغسل الأجنة ثلاث مرات مع PBS الجليد الباردة. نقل الأجنة إلى 30٪ السكروز في حل PBS في 4 درجات مئوية حتى تغرقإلى أسفل.
2. التجميد
- ترتيب كل المواد المطلوبة قبل البدء في عملية التجميد: البرد العفن، والبرد القفازات، وملقط وزن الريشة علم الحشرات، علامة من ركلة جزاء والقطع الأمثل درجة حرارة مجمع (OCT)
- تسمية العفن البرد مع مقاومة للكحول دائمة علامة (ناهيك عن التوجه من الأنسجة، وتاريخ وراثى). إعداد طين من سحق الثلج الجاف، و 100٪ من الإيثانول في دلو الجليد. وضع دورق زجاجي داخل تحتوي على isopentane. الانتظار لمدة 10 دقيقة لisopentane ليبرد.
- وفي الوقت نفسه إزالة الأنسجة من محلول السكروز، تمحو السكروز الزائدة حول الأنسجة باستخدام مناديل المختبر. نقل الأنسجة إلى صفت ما قبل البرد العفن مع ما يكفي من أكتوبر لتغطية الأنسجة. تجنب أي فقاعات الهواء في OCT. وخصوصا حول الأنسجة.
- توجيه الأنسجة في أكتوبر باستخدام ملقط علم الحشرات وزن الريشة لتجنب تلف الأنسجة. بدء التجميد عن طريق نقل البرد مولد في حمام isopentane تبريد مسبقا. لا دفقة isopentane في OCT لأنها لن تجمد بشكل صحيح. التفاف العينات في رقائق الألومنيوم وتخزينها في -80 ° C.
3. Cryosectioning
- قطع 14 ميكرون أقسام مسلسل رقيقة في سلسلة 'من خمسة باستخدام ناظم البرد وجمع على الشرائح الزجاجية SuperFrost® زائد لالمناعي (IF) التحليل. تخزين الشرائح في -80 ° C لحين الاستفادة منها.
4. الراسم التصور عن طريق بروتوكول (TSA) Tyramide الإشارة التضخيم
- إعداد مخازن والكواشف اللازمة لتلطيخ. دائما طازجة إعداد عازلة تريس، كلوريد الصوديوم-توين (تي ان تي) في يوم من الاستخدام.
- إعداد TNT عازلة باستخدام 100 مل من 1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك 7.5 درجة الحموضة، 30 مل من 5 M كلوريد الصوديوم وده 2 O تصل إلى الحجم النهائي من 1 L. إضافة 500 ميكرولتر من توين 20 باستخدام ماصة 1 مل. إضافة توين 20 ببطء وتدفق ماصة صعودا وهبوطا عدة مرات للتأكد من أن جميع توين 20 فيالحل.
- إعداد تريس، كلوريد الصوديوم-حجب (TNB) عازلة باستخدام 100 مل من 1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك 7.5 درجة الحموضة، 30 مل من 5 M كلوريد الصوديوم وده 2 O تصل إلى الحجم النهائي من 1 L. إضافة 5 ز حجب الكاشف (المتوفرة مع طقم) ببطء بزيادات صغيرة إلى المخزن المؤقت مع التحريك. تسخين حل تدريجيا إلى 55 درجة مئوية مع التحريك المستمر بحل تماما الكاشف حجب (هذا لا ينبغي أن يستغرق وقتا أطول من 30-60 دقيقة). لتحقيق التدفئة متجانسة استخدام حمام مائي عند 55 ° C. فإن الحل يبدو حليبي. جلب الحل لدرجة حرارة الغرفة قبل استخدام. قسامة وتخزينها في -20 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى الطويل.
- إعادة البيوتين tyramide كاشف (المقدمة مع عدة) في علم الأحياء الجزيئية / HPLC الصف DMSO. اعتمادا على أساسها يستخدم عدة كمية مناسبة من DMSO قد تختلف. تخزين الحل السهم عند 4 درجات مئوية.
ملاحظة: أقسام من الحيوانات متخالف لجنة المساواة العرقية وR26 الأليلات منها يمكن استخدامها لتحليل الدوائر. استخدام الصورةections من تتزاحم تحمل لجنة المساواة العرقية واحد أو واحدة R26 أليل، على التوالي، وضوابط السلبية. علاج الشرائح سيطرة سلبية تماما مثل الشرائح من الحيوانات متخالف مزدوجة. وبالإضافة إلى ذلك، تشمل شريحة واحدة تحكم من حيوان متخالف مزدوجة ولكن يستبعد الكاشف TSA (مراقبة unamplified).
- باستخدام مشرط حاد الطازجة إزالة الزائد أكتوبر المحيطة أقسام الأنسجة وعلامة الحدود حول أقسام بالقلم PAP.
- تجف الشرائح لمدة 2-3 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). تغسل الشرائح في RT 3X مع تي ان تي لمدة 5 دقائق لكل منهما. احتضان الشرائح في RT لمدة 30 دقيقة في 0.3٪ H 2 O 2 حل في الميثانول الجليد الباردة لإرواء النشاط البيروكسيداز الذاتية.
- غسل 3X مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق كل في RT. احتضان لمدة 10 دقيقة في 0.5٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني عن permeabilization الأنسجة. تغسل الشرائح في RT 3X مع تي ان تي لمدة 5 دقائق لكل منهما.
- كتلة مع TNB (عرقلة الحل، 200-300 ميكرولتر لكل شريحة) لمدة 30دقيقة في RT في غرفة ترطيب. تأكد من تغطية جميع الأقسام بالكامل من قبل TNB. لا تدع الشرائح تجف بين الخطوات.
- تصريف عازلة تمنع الزائد وتطبيق مصل الأساسي الاعتراف التتبع (1: 1،000 الماعز المضادة للWGA لBL، 1: 15،000 أرنب مكافحة GFP لGTT) مخففة في TNB لمدة 2 ساعة على RT أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. تأكد من استخدام حجم ما يكفي لتغطية كامل قسم الأنسجة (200-300 ميكرولتر لكل شريحة).
ملاحظة: والتخفيفات أمصال مضادة الأولية الموصى بها هنا قد تضطر إلى تعديل. - تغسل الشرائح في RT 3X مع تي ان تي لمدة 5 دقائق مع كل الانفعالات.
- احتضان المقاطع مع مصل الثانوي المعقدة البيروكسيديز الاعتراف المضيف للمصل الأول (1: 500 حصان مكافحة الماعز مفتش لمكافحة WGA، 1: 5،000 الماعز مفتش المضادة للأرنب لمكافحة GFP في TNB لمدة 1 ساعة على RT).
- غسل 3X مع TNT في RT لمدة 5 دقائق مع كل الانفعالات. احتضان في 1: 100 streptavidin (SA) -conjugated الفجل البيروكسيديز (SA-HRP، شريطة وايث طقم) في TNB لمدة 30 دقيقة في RT في غرفة ترطيب. تغسل الشرائح في RT 3X مع تي ان تي لمدة 5 دقائق لكل منهما. وفي الوقت نفسه ذوبان الجليد في TSA.
- تمييع TSA 01:50 في TSA التضخيم مخفف (تقدم مع عدة، واستخدام عدة TSA لتصور BL وعدة TSA + لGTT). احتضان أقسام الأنسجة في المخفف TSA للبالضبط 10 دقيقة في RT. تمييع TSA فقط قبل الاستخدام، من الناحية المثالية خلال الخطوة غسل السابقة، لا تستخدم أي المتبقية المخفف كاشف TSA للتجارب في المستقبل؛ إعداد دائما الطازجة.
- تغسل الشرائح في RT 3X مع تي ان تي لمدة 5 دقائق مع كل الانفعالات. احتضان مع 1: 500 اليكسا Fluor® 546 streptavidin المتقارن في TNB لمدة 30 دقيقة في RT. تغسل الشرائح في RT 3X مع تي ان تي لمدة 5 دقائق مع كل الانفعالات.
- احتضان لمدة 10 دقيقة في 5٪ محلول bisbenzimide في برنامج تلفزيوني في RT لتلطيخ النووي. تغسل الشرائح في RT 3X مع تي ان تي لمدة 5 دقائق مع كل الانفعالات. جبل مع Fluromount G وأداء epifluorescence أو المجهري متحد البؤر.
5. τlacZ تلطيخ لأقسام الجنينية
- إعداد مخازن والكواشف اللازمة لتلطيخ. دائما طازجة إعداد LacZ عازلة C قبل الاستخدام.
- إعداد 5-برومو-4-كلورو-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-غال) حل سهم (40 ملغ / مل) وذلك بإضافة 40 غرام من X-غال إلى 1 مل 70٪ ثنائي ميثيل الفورماميد (DMF). يغطى الطبق بورق الألمنيوم وتخزينها في -20 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى الطويل.
- إعداد نتروبلو الأزرق نيترو (NBT) شارعاوك الحل (50 ملغ / مل) وذلك بإضافة 50 غرام من NBT إلى 1 مل 70٪ DMF. يغطى الطبق بورق الألمنيوم وتخزينها في -20 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى الطويل.
- إعداد LacZ تثبيتي باستخدام 80 ميكرولتر من 25٪ غلوتارالدهيد، 5 مل من 4٪ PFA، 20 ميكرولتر من 1 M MgCl 2، 100 ميكرولتر من 500 ملي EGTA، 1 مل من 1 M الفوسفات عازلة درجة الحموضة 7.4 و ده 2 O ما يصل الى المباراة النهائية حجم 10 مل.
- إعداد LacZ العازلة وباستخدام 1 مل من 1 M MgCl 2، 5 مل من 500 ملي EGTA، 50 مل من 1 M عازلة الفوسفات ودرجة الحموضة 7.4 و ده 2 O تصل إلى الحجم النهائي من 500 مل.
- إعداد LacZ عازلة B باستخدام 1 مل من 1 M MgCl 2، 5 مل من 500 ملي EGTA، 5 مل من 1٪ deoxycholate الصوديوم، و 100 مل من 10٪ NP-40، 50 مل من 1 M الفوسفات عازلة درجة الحموضة 7.4 و ده 2 O تصل إلى الحجم النهائي من 500 مل.
- إعداد LacZ عازلة C من خلال إضافة 10 ميكرولتر من NBT حل الأسهم و 12.5 ميكرولتر من X-غال حل الأسهم إلى 1 مل من LacZ عازلة B. جعل الطازجة قبل استخدامها، وتغطي بورق الألمنيوم.
- تجفيف الشرائح في RT على الأقل لمدة 10-15 دقيقة (في الوقت نفسه إعداد الشرائح مع PAP القلم).
- إصلاح القسم مع LacZ تثبيتي لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في غرفة ترطيب داخل مادة كيميائية الدخان هود. يغسل 3 مرات مع PBS تستكمل مع 2 مم MgCl 2.
- شطف الشرائح مع LacZ عازلة A. تغسل الشرائح مع LacZ العازلة و3 مرات لمدة 10 دقيقة لكل منهما في RT. اغسل 2 مرات مع LacZ عازلة B لمدة 5 دقائق لكل منهما. احتضان الشرائح في LacZ عازلة C في 30-37 درجة مئوية لمدة 6 ساعات أو طوال الليل في غرفة ترطيب.
ملاحظة: إضافة كمية كافية من LacZ عازلة C. يجب أن الشرائح لا تجف أثناء الحضانة. - بعد مرور فترة الحضانة المناسبة غسل الشرائح مع PBS تستكمل مع 2 مم MgCl 2. شطف أقسام لفترة وجيزة مع DDH 2 O. ساترة مع الجلايسين الجيلاتين ماير. مناسبة للمجهر الضوء مجهزة تدخل الفرق النقيض (DIC) تصوير مجموعة المتابعة.
6. Gendإيه والراسم انماط
- إعداد ذيل العازلة تحلل باستخدام 1 مل من 1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.5، 100 ميكرولتر من 500 ملي EGTA، 200 ميكرولتر من 10٪ SDS، 400 ميكرولتر من 5 M كلوريد الصوديوم وده 2 O لتعويض الحجم النهائي من 10 مل.
- إضافة 500 ميكرولتر من العازلة ذيل تحلل لكل أنبوب إيبندورف تحتوي على خزعة الذيل. إضافة بروتين K إلى التركيز النهائي من 100 ملغ / مل. احتضان بين عشية وضحاها على شاكر في 55 ° C.
- عينات الطرد المركزي في 17،000 x ج لمدة 10 دقيقة في RT. نقل طاف لأنبوب الطرد المركزي الجديدة. إضافة 500 ميكرولتر من الأيزوبروبانول لطاف. مزيج لمدة 5 دقائق على الأقل قبل قلب الأنابيب صعودا وهبوطا.
- تدور في أجهزة الطرد المركزي في 17،000 x ج لمدة 5 دقائق على RT. تخلصي من طاف. إضافة 200 ميكرولتر من الايثانول 70٪. يهز لمدة 5 دقائق على الأقل.
- أجهزة الطرد المركزي في 17،000 x ج لمدة 5 دقائق. إزالة طاف مع Pipetman (لا صب إيقاف). تجفيف بيليه في غرفة دافئة (37 درجة مئوية) لمدة 15-30 دقيقة.
- بيليه resuspend في 100 ميكرولترمن انخفاض TE الرقم الهيدروجيني 8.0 أو المياه باستخدام نصائح واسعة الجوف تصفيتها. وضعت في 55 درجة مئوية لمدة 1 ساعة وعند 37 درجة مئوية خلال الليل لتذويب المناسب. تخزينها في 4 ° C.
- استخدام 1 ميكرولتر من الحمض النووي للتفاعل PCR (50 ميكرولتر خليط التفاعل تحتوي على 1 ميكرولتر من الحمض النووي الذيل، 2.5 ميكرولتر DMSO، 10 مساء من كل التمهيدي، 25 ميكرومتر لكل dNTP، و1M البيتين). وترد الاشعال PCR لالتنميط الجيني وتحديد نوع الجنس في جدول المواد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يعرض هذا القسم نتائج ممثلة التي يمكن الحصول عليها العمل مع R26-BIZ (B L- I RES-τlac Z) وR26-GTT (G FP- TT C) الأليلات. نحن هنا استخدام R26-BIZ والأليلات R26-GTT لتحليل نضوج الدوائر العصبية التي تنظم محور الإنجاب. يتم التحكم الاستنساخ في الفقاريات مركزيا من قبل مجموعة فرعية صغيرة من الخلايا العصبية في منطقة ما تحت المهاد، التي تفرز هرمون إفراز الغدد التناسلية (نره]). Kisspeptin، منشط قوي من الخلايا العصبية نره]، وقد تورط في تنظيم نشاط الخلايا العصبية نره]، ولكن عندما يتم تأسيس الدوائر العصبية بين الخلايا العصبية نره] وkisspeptin في تطوير دماغ الفأر الإناث لم يكن معروفا 5. لأول مرة وتبين لنا أن التعبير عن BIZ وGTT الجينات المحورة يتم تنشيط تحديدا إعادة التركيب لجنة المساواة العرقية التي تعتمد في الجنينيةالخلايا العصبية kisspeptin في النواة المقوسة (ARC) (الشكل 2) باستخدام لجنة المساواة العرقية خط سائق kisspeptin محددة 10. نحن ثم إثبات أن الخلايا العصبية kisspeptin في ARC بالفعل التواصل مع مجموعة فرعية معينة من الخلايا العصبية نره] في الرحم (الشكل 3A، B). وعلاوة على ذلك، وتبين لنا أن ARC kisspeptin الخلايا العصبية هي المنبع من الخلايا العصبية نره] (الشكل 3A، C). معا تؤخذ النتائج التي توصلنا إليها تشير إلى أن الدوائر العصبية بين الخلايا العصبية وkisspeptin نره] وتنشأ بشكل كامل وفعال في مخ الفأر الأنثى قبل الولادة.
الشكل 1: نقل عبر التشابك من استشفاف باستخدام الأساليب التقليدية أو الوراثية في النهج التقليدي، يتم أخذ التتبع عبر التشابك من قبل جميع الخلايا العصبية في موقع الحقن مما يحتمل وصفها مسارات لا علاقة غير محددة. فيالنهج الجيني، وأعرب عن التتبع انتقائي من قبل الخلايا العصبية المحددة وراثيا وبالتالي تصور تحديدا الخلايا العصبية المتصلة الخلايا، معربا عن التتبع. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تفعيل الأمين لBIZ وGTT التحوير في ARC kisspeptin الخلايا العصبية الجنينية. (A) استراتيجية تربية لتفعيل BIZ GTT والتعبير في الخلايا العصبية kisspeptin. نحن ولدت R26-R26-BIZ وGTT الفئران مع Kisspeptin-IRES-لجنة المساواة العرقية (KissIC) الفئران 10، والتي يتم التعبير عن لجنة المساواة العرقية-recombinase تحت سيطرة المروج Kiss1. ويحدد (CE) النشاط β-غال الأنزيمية للإنتاج التتبع الخلايا ويقتصر على ARC في الدماغ من الإناث KissIC / R26-BIZ الجنين في اليوم الجنينية (E) 18.5. (FG) المناعي مزدوج لkisspeptin (الخضراء) وBL (أحمر) (F) أو GTT (أحمر) (G) يوضح تفعيل المؤمنين التعبير BL أو GTT من قبل لجنة المساواة العرقية بوساطة إعادة التركيب في kisspeptin الخلايا العصبية في KissIC / R26-BIZ أو KissIC / R26-GTT أجنة الفئران الإناث، على التوالي. الحانات مقياس (C) 500 ميكرومتر، (D) 200 ميكرومتر، (F، G) 50 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
وترتبط نره] الخلايا العصبية synaptically لوالمصب من kisspeptin الخلايا العصبية: الرقم 3. (A) اندماجي الجيني تتبع عبر التشابك ثنائي الاتجاه. في حين τlaيقتصر تشيكوسلوفاكيا إلى الخلايا العصبية kisspeptin لجنة المساواة العرقية، معربا عن، يتم نقل BL transsynaptically إلى المنبع (قبل المشبكي) والمصب (بعد المشبكي) الخلايا العصبية في الفئران KissIC / R26-BIZ. في المقابل، يتم نقل GFP-TTC transsynaptically إلى الخلايا العصبية قبل المشبكي، ولكن ليس بعد المشبكي في الفئران KissIC / R26-GTT. الخلايا العصبية بعد المشبكي لها الألياف محور عصبي τlacZ إيجابية في الأماكن القريبة منها وثيقة (B، C) المناعي مزدوج لBL (أحمر؛ ب). أو GTT (أحمر، C) ونره] (الأخضر) على مقطع سهمي من خلال الرأس كله من الإناث KissIC / R26-BIZ أو KissIC / R26-GTT الجنين في E18.5. (B) لاحظ أن بعض، ولكن ليس كل الخلايا العصبية نره] تحتوي BL. وتظهر هذه البيانات أن مجموعة فرعية من الخلايا العصبية الجنينية نره] متصل synaptically إلى قوس الخلايا العصبية kisspeptin. (C) لاحظ أن أيا من الخلايا العصبية نره] يحتوي GTT. نقل عبر التشابك الحصري لBL لكن ليس GTT إلى الخلايا العصبية نره] يوضح أن الخلايا العصبية نره]هي المصب من الخلايا العصبية kisspeptin. الحانات النطاق (B، C) 50 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
| الميزات | استشفاف عبر التشابك | الفيروسات موجه للعصب |
| طريقة تطبيق | التعبير عن التحوير | حقن ميكانيكيا |
| اتجاه انتشار | تقدمي، إلى الوراء وثنائية الاتجاه | إلى الوراء وتقدمي |
| فعالية متشابك | متعدد المشابك | متعدد المشابك أو أحادي المشبك (الوراء فقط) |
| قوة الإشارة | الضعيف، وانخفاض في كل المشبك | قوية، والتضخيم إشارة في كل المشبك |
| الاستجابة المناعية | لا شيء؛ التعبير عن بروتين الذاتية | استجابة مناعية قوية، قاتلة |
| التحليل المكاني والزماني | يعتمد على مروج للاختيار | انتقائي للغاية نظرا لحقن الميكانيكية في المواقع الفردية |
الجدول 1: مقارنة بين ميزات من استشفاف عبر التشابك الوراثية والفيروسات موجه للعصب المعدلة وراثيا
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
معربا عن استشفاف عبر التشابك كما الجينات المحورة لتتبع الدوائر العصبية من السكان العصبية محددة وراثيا ديها العديد من المزايا مقارنة مع الحقن التجسيمي من استشفاف أو الفيروسات neurotopic. أولا، يتم إنتاج التتبع باعتبارها بروتين الذاتية، وبالتالي لا تثير أي رد فعل مناعي ويمكن تحليل مسار العصبي انتقائية في الحيوانات المختلفة مع استنساخ عالية. ثانيا، لأن هذا هو أسلوب غير الغازية فإنه يمكن استخدامها لتتبع الدوائر من الخلايا العصبية لا يمكن الوصول إليها بسهولة لحقن التجسيمي، على سبيل المثال في الرحم. وتشمل القيود على فعالية منخفضة عموما في نقل عبر التشابك، مما قد يؤدي إلى صعوبات في الكشف عن التتبع. وعلاوة على ذلك، ويحصل المخفف جزيء التتبع في كل المشبك. في المقابل، الفيروسات موجه للعصب تكرار وتكاثر الفيروس بدوره ثم يؤدي إلى تضخيم إشارة بعد عبور المشبك. ومع ذلك، تكاثر الفيروس هو أيضا limitat الرئيسيةأيون لاستخدام الفيروسات موجه للعصب بسبب سمية الخلايا الفيروسية الذاتية. تتم مقارنة بعض ملامح استشفاف عبر التشابك الوراثية والفيروسات موجه للعصب المعدلة وراثيا في الجدول 1.
الأليلات R26-R26-BIZ وGTT تكمل بعضها البعض وتسهيل التصور من الدوائر العصبية من الخلايا العصبية التي تم تحديدها وراثيا السكان على إعادة التركيب لجنة المساواة العرقية بوساطة. المروج R 26 وتتميز بشكل جيد ويتوسط التعبير في كل مكان مع قوة متواضعة 11،12. باستخدام أساليب حساسة للغاية للكشف التتبع مثل تضخيم إشارة tyramide (TSA) نظام يسمح بتحديد كميات ضئيلة حتى من الجزيئات التتبع نقلها عبر نقاط الاشتباك العصبي. آخر الميزة الرئيسية لاستخدام المروج R26 لدفع التتبع التعبير هي أن الخلايا العصبية معربا عن توليف باستمرار استشفاف طوال حياتهم. هذا يجعل من الممكن لتحليل الدوائر النضجلفترات زمنية طويلة 5. في المقابل، لم يكن ذلك ممكنا عند استخدام الفيروسات موجه للعصب بسبب السمية الخلوية الخاصة بهم. الأهم من ذلك، لدينا نظام وراثي ثنائي واستخدام المروج R26 uncouples إنتاج التتبع من المروجين الذاتية يحتمل أن ينظم بشكل كبير يقود لجنة المساواة العرقية التعبير (في هذه الحالة، المروج Kiss1)، والتي يمكن تنظيمها من قبل مجموعة متنوعة من وراثية وجينية عوامل 13. نقل عبر التشابك بالتالي من BL وGTT يعكس الاتصالات متشابك الفعلي بين اثنين من السكان العصبية.
إعادة التركيب لجنة المساواة العرقية بوساطة هو حدث لا رجعة فيه، وبالتالي فإنه يحول عابرة تنمويا التعبير الجيني في مستقر التعبير التحوير. استخدام نظام لجنة المساواة العرقية محرض 14 يمكن أن يحتمل كشف القناع عن تأثير تنموي بسبب عابرة التعبير لجنة المساواة العرقية.
في الختام، وهما رواية R26-R26-BIZ وGTT سلالات الفئران يمكن استخدامها لتحليل المحلية والصغرىنانوغرام نطاق الدوائر العصبية التي يمكن أن تتألف من فئات وأنواع من الخلايا العصبية القادمة من أي منطقة في الدماغ أو حتى من الحبل الشوكي بطريقة لجنة المساواة العرقية التي تعتمد مختلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bisbenzimide (Hoechst 33258 dye) | Sigma | 14530-100MG | |
| Ethanol | Sigma | 32205-1L | |
| Cryo mold (Peel-a-way) | Polyscience Inc. | 18646A-1 | 22 x 22 x 20mm |
| DMSO | Sigma | D8418-100ML | |
| Dimethyl Formamide (DMF) | VWR Chemicals | 23470,293 | |
| EGTA | ROTH | 3054.3 | |
| Fluoromount G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | G5882-50ML | |
| Hydrogen peroxide | Sigma | 34988-7 | |
| Isopentane (Methyl 2-butane) | Sigma | M32631-2.5L | |
| Kaiser's glycine gelatin | Merck | 1092420100 | |
| Methanol | Sigma | 494437-1L | |
| MgCl2 | Sigma | M2670-100G | |
| NaCl | ROTH | HN00.2 | |
| NBT | Sigma | 298-83-9 | |
| Nonidet P40 substitute | Fluka | 743.85 | |
| OCT | Leica | 14020108926 | |
| PAP pen | Dako | S2002 | |
| Parafarmaldehyde | Sigma | P6148-1KG | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D6750-25G | |
| Sucrose | Sigma | S7903-1KG | |
| Superfrost slides | Thermo Scientific | FT4981GLPLUS | |
| TSA kit | PerkinElmer | NEL700 | |
| TSA plus kit | PerkinElmer | NEL749A001KT | |
| Tris | ROTH | AE15.2 | |
| Triton-X 100 | ROTH | 3051.2 | |
| Tween 20 | ROTH | 9127.1 | |
| X-gal | ROTH | 2315.1 | |
| Cryostat | Leica | na | |
| Light microscope equipped with DIC imaging | Zeiss | Axioskop2 equipped with Axio Vision software | |
| Fluroscence microscope | Zeiss | Axioskop2 equipped with Axio Vision software | |
| Photoshop | Adobe | PS6 | |
| Goat anti-WGA (recognizes BL) | Vector Laboatories | AS-2024 | |
| Biotinylayted horse anti-goat IgG | Vector Laboatories | BA-9500 | |
| Biotinylated goat anti-rabbit IgG | Vector Laboatories | BA-1000 | |
| Rabbit anti-GFP (recognizes GTT) | Invitrogen | A11122 | |
| Rabbit anti-GnRH | Affinity Bio Reagent | PA1-121 | |
| Dylight488-donkey anti-rabbit IgG | Thermo Scientific | SA5-10038 | |
| SA-Alexa Fluor 546 | Life Technologies | S-11225 | |
| Primers | |||
| BL Fwd (for BIZ genotyping) | Eurofins MWG Operon | ATGAAGATGATGAGCACCAGGGC | |
| BL Rev (for BIZ genotyping) | Eurofins MWG Operon | AGCCCTCGCCGCAGAACTC | |
| Cre Fwd (for Cre genotyping) | Eurofins MWG Operon | GTCGATGCAACGAGTGATGAGGTTCG | |
| Cre Rev (for Cre genotyping) | Eurofins MWG Operon | CCAGGCTAAGTGCCTTCTCTACACCTGC | |
| TTC Fwd (for GTT genotyping) | Eurofins MWG Operon | AGCAAGGGCGAGGAGCTGTT | |
| TTC Rev (for GTT genotyping) | Eurofins MWG Operon | GTCTTGTAGTTGCCGTCGTCCTTGAA | |
| XY Fwd (for gender genotyping) | Eurofins MWG Operon | TGAAGCTTTTGGCTTTGA | |
| XY Rev (for gender genotyping) | Eurofins MWG Operon | CCGCTGCCAAATTCTTTG | |
| ROSA26 Fwd | Eurofins MWG Operon | CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC | |
| ROSA26 Rev | Eurofins MWG Operon | GCAGATGGAGCGGGAGAAAT | |
| SA Rev | Eurofins MWG Operon | CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC | |
References
- Vercelli, A., Repici, M., Garbossa, D., Grimaldi, A. Recent techniques for tracing pathways in the central nervous system of developing and adult mammals. Brain. Res. Bull. 51, 11-28 (2000).
- Huang, Z. J., Zeng, H. Genetic approaches to neural circuits in the mouse. Annu. Rev. Neurosci. 36, 183-215 (2013).
- Lanciego, J. L., Wouterlood, F. G. A half century of experimental neuroanatomical tracing. J. Chem. Neuroanat. 42, 157-183 (2011).
- DeFalco, J., et al. Virus-assisted mapping of neural inputs to a feeding center in the hypothalamus. Science. 291, 2608-2613 (2001).
- Kumar, D., et al. Murine arcuate nucleus kisspeptin neurons communicate with GnRH neurons in utero. J. Neurosci. 34, 3756-3766 (2014).
- Horowitz, L. F., Montmayeur, J. P., Echelard, Y., Buck, L. B. A genetic approach to trace neural circuits. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 3194-3199 (1999).
- Maskos, U., Kissa, K., ST Cloment, C., Brulet, P. Retrograde trans-synaptic transfer of green fluorescent protein allows the genetic mapping of neuronal circuits in transgenic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 10120-10125 (2002).
- De Roux, N., et al. Hypogonadotropic hypogonadism due to loss of function of the KiSS1-derived peptide receptor GPR54. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 10972-10976 (2003).
- Seminara, S. B., et al. The GPR54 gene as a regulator of puberty. N. Engl. J. Med. 349, 1614-1627 (2003).
- Mayer, C., et al. Timing and completion of puberty in female mice depend on estrogen receptor alpha-signaling in kisspeptin neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 22693-22698 (2010).
- Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nat. Genet. 21, 70-71 (1999).
- Seibler, J., et al. Single copy shRNA configuration for ubiquitous gene knockdown in mice. Nucleic Acids Res. 33, e67 (2005).
- Semaan, S. J., Kauffman, A. S. Emerging concepts on the epigenetic and transcriptional regulation of the Kiss1 gene. Int. J. Dev. Neurosci. 31, 452-462 (2013).
- Feil, R., et al. Ligand-activated site-specific recombination in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 10887-10890 (1996).
