Introduction
解剖路径跟踪是最常用的工具,以破译大脑和行为1之间的关系之一。进步的神经回路追踪技术已经赋予与神经科学家从小鼠基因2确定神经元群追踪神经回路的功能。尽管这些技术上的进步仍然具有挑战性解开尤其是在胚胎成熟的神经回路的形成。这是因为大多数开发迄今跟踪方法是基于立体定位注射跨突触示踪剂的或遗传修饰的嗜神经病毒( 图1)2,3。虽然这些技术实现空间和时间分辨率的连通,几个固有的局限性,如技术上具有挑战性示踪剂注射入发育中的大脑中,注射部位的再现性,潜在炎症在注射部位和最祁门功夫,功夫造成嗜神经病毒tantly毒性限制了其使用4。
另一种方法是要表达的跨突触示踪剂如遗传改造的小鼠转基因。我们最近修改了此技术,开发了二进制遗传跨突触跟踪系统,以地图的任何基因鉴定神经元群5的神经回路。我们的试验策略是基于两个新敲入小鼠品系,其表达或者双向示踪剂大麦凝集素(BL)的6或逆行示踪剂破伤风毒素片段C的ROSA 26轨迹融合到绿色荧光蛋白(GTT)7后的Cre介导的重组。在这里,我们用这些小鼠品系选择性表达BL和GTT的产生亲吻促动素的神经元,即牵连调节生殖轴8,9的成熟神经肽。我们表明,这种技术适用于可视吻的发育和成熟在雌性小鼠大脑5的胚胎发育过程中peptin神经电路。
育种策略
在R26-BL-IRES-τlacZ(BIZ)和R26-GFP-TTC(GTT)示踪线敲入5株携带重组ROSA26等位基因。所述R26-BIZ和R26-GTT等位基因是转录沉默由于强烈的转录终止信号,它是由两个loxP序列侧翼5的存在。的BIZ和GTT转基因的表达是通过Cre重组酶介导的切除的转录终止信号的激活。在R26-BIZ和R26-GTT等位基因可以独立通过简单地用酶Cre车手穿越中使用。用于分析动物杂合的各自的Cre和R 26等位基因都可以使用。同窝承载1 的Cre或1 R 26等位基因,分别应用作对照。可替代地,也有可能产生吨riple敲入动物携带的Cre,R26-BIZ和R26-GTT等位基因,然而这将需要一个额外的十字架。
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Protocol
注:伦理学声明:涉及动物对象的程序批准了汉堡萨尔州的大学和大学的动物福利委员会。
1.制备和胚胎组织的固定
- 安排所有解剖出胚胎和牺牲动物前准备组织随后固定解决方案所需的设备。
注:始终制备新鲜的4%多聚甲醛(PFA)溶液(4%PFA的0.1M磷酸盐缓冲盐水(PBS),调节pH至7.4)。 - 安乐死定时怀孕的雌性小鼠与道德批准的程序。
- 转移到小鼠的平台。湿用70%乙醇腹部的腹侧和使用锋利的剪刀,以暴露腹腔的垂直切口。
- 确定胚胎链拉出,用钝钳,将其放入冰冷的PBS。
- 请从单个胚胎胚胎链用细剪刀和镊子。除去多余的组织周围的胚胎和在冰冷的PBS冲洗。
- 取一小尾活检(转移胚胎到PFA之前)和孵化它的性别鉴定和示踪等位基因的基因分型PCR尾巴裂解液。
- 从胚胎开始在最外侧面,并分别传送每个胚胎成含有冰冷的4%PFA在冰上在振荡器上的管。
- 浸泡胚胎E13.5岁或以下1.5小时冰上持续振荡。浸泡胚胎年龄E14.5 E15.5和在冰上与持续振荡2.5小时。
- 对于胚胎年龄E16.5以上,斩首和浸泡头PFA解决方案之前,除去外皮。 E16.5胚胎的头可以浸泡在冰与持续振荡4.5小时。
- 经过适当的固定,用冰冷的PBS洗胚胎三次。直到它们下沉胚胎转移到30%蔗糖的PBS溶液在4℃下底部。
2.冷冻
- 安排所有在开始冻结过程之前所需的材料:低温模,低温手套,轻量级昆虫学镊子,记号笔和最佳切削温度化合物(OCT)
- 标签的低温模具具有永久耐酒精标记(提组织,日期和基因型的方向)。准备粉碎的干冰和100%乙醇的溶雪在冰桶。放置内含有异戊烷的玻璃烧杯中。等待10分钟为异戊烷冷却下来。
- 同时除去来自蔗糖溶液的组织,使用实验室抹布擦去组织周围多余的蔗糖。转移组织成预标记的冷冻模具具有足够的OCT以覆盖组织。避免任何气泡在OCT;特别是在接近组织。
- 使用轻量级昆虫学镊子,避免组织损伤定位在OCT组织。首先转移低温冷冻摩尔D装入预先冷却的异戊烷浴。不要溅进异戊烷华侨城,因为它不会冻结正确。包裹在铝箔和储存的样品在-80℃下。
3. Cryosectioning
- 切用低温恒温器在五大系列“14微米薄连续切片和收集SuperFrost®加玻片进行免疫荧光(IF)的分析。存储的幻灯片在-80℃直到使用。
4.示踪可视化使用高通量筛选(TSA)协议
- 备所需的染色缓冲液和试剂。总是新鲜准备的Tris-氯化钠吐温(TNT)缓冲区上使用的当天。
- 准备使用1M的Tris-HCl为100毫升pH为7.5,将30ml的5M NaCl和DDH 2 O的高达1 L的终体积加入500微升吐温20的使用1毫升吸管的TNT缓冲液中。添加吐温20缓慢并冲洗移液器上下几次,以确保所有的吐温20处于解决方案。
- 制备的Tris-NaCl的阻断用100毫升的1摩尔的Tris-HCl的pH为7.5,将30ml的5M NaCl和DDH 2 O的(TNB)缓冲液达1 L的终体积加入5克封闭试剂(设置有盒)慢慢以小增量的缓冲区,同时搅拌。逐渐加热该溶液至55℃,并连续搅拌,完全溶解封闭试剂(这不应超过30-60分钟需要更长的时间)。以实现均匀加热用水浴在55℃。该解决方案将出现乳白色。在使用前使溶液至室温。等分试样并储存在-20℃下长期贮存。
- 重组生物素酪酰胺试剂(由试剂盒提供)在分子生物学/ HPLC级的DMSO。取决于哪个试剂盒用于DMSO中的适当量可以变化。储存原液于4℃。
可用于电路分析部分从动物杂合的各自的Cre和R 26等位基因:注。采用Sections从同窝承载1 的Cre或1 R 26等位基因,分别作为阴性对照。治疗阴性对照幻灯片酷似双重杂合子动物幻灯片。此外,包括双重杂合子的动物一个控制幻灯片,但离开了TSA试剂(非放大控制)。
- 使用锋利的手术刀清新去除多余华侨城周围的组织切片,并标记周围的部分边界用PAP笔。
- 干燥载玻片在室温下2-3分钟(RT)。洗幻灯片在RT 3倍与TNT,每次5分钟。在0.3%的孵育载玻片在室温进行30分钟,在冰冷的甲醇中的 H 2 O 2溶液以猝灭内源性过氧化物酶的活性。
- 洗涤3次,用PBS进行5分钟,每在RT。孵育在0.5%的Triton-X 100 10分钟的PBS透化组织。洗幻灯片在RT 3倍与TNT,每次5分钟。
- 用TNB块(封闭溶液,每滑动200-300微升)30分在RT在加湿室中。确保所有的部分都完全覆盖TNB。不要让幻灯片干的步骤之间。
- 流掉过量封闭缓冲液,并应用主抗血清识别的示踪剂(1:1000山羊抗WGA对BL,1:15000的兔抗GFP为GTT)在RT或过夜,在4℃稀释在TNB 2小时。一定要使用足够的量来完全覆盖组织切片(每张幻灯片200-300微升)。
注:此处推荐的主要抗血清稀释可能要进行调整。 - 洗幻灯片在RT 3倍与TNT每个搅拌5分钟。
- 孵育生物素化的第二抗血清的部分识别第一抗血清的主机(1:500的马抗山羊IgG抗WGA,1:5000山羊抗兔IgG抗GFP在TNB 1小时在RT)。
- 洗3倍与TNT在室温每搅拌5分钟。孵育在1:100链霉亲(SA)标记的辣根过氧化物酶(SA-HRP,提供WiTH试剂盒)在TNB在室温30分钟,在湿润的腔室中。洗幻灯片在RT 3倍与TNT,每次5分钟。同时解冻TSA。
- TSA稀释1:50 TSA放大稀释剂(试剂盒提供;使用TSA套件BL的可视化和TSA +套件GTT)。孵育组织切片在稀TSA用于精确10分钟,在室温。 TSA稀释使用前,在以往的洗涤步骤理想情况下,不使用任何剩余的稀释TSA试剂未来的实验;始终准备好新鲜。
- 洗幻灯片在RT 3倍与TNT每个搅拌5分钟。孵育,用1:500的AlexaFluor®546链霉抗偶联物在TNB 30分钟,在室温。洗幻灯片在RT 3倍与TNT每个搅拌5分钟。
- 孵育在PBS中5%的双苯甲亚胺溶液在RT核染色10分钟。洗幻灯片在RT 3倍与TNT每个搅拌5分钟。安装与Fluromount G和进行表面荧光或共聚焦显微镜。
ROSA26基因座中产生细胞(由所使用的酶Cre驱动线确定的)的表达水平与神经电路上进行分析(神经元产生的示踪物,收敛等的例如号码)。因此这里推荐初级抗血清稀释度可能需要进行调整,以防止低或过量的信号。背景应该总是使用适当的控制幻灯片(见上文)进行分析。
5.τlacZ染色的胚胎切片
- 备所需的染色缓冲液和试剂。使用之前,请务必刚准备LacZ的缓冲液C。
- 通过加入40克X-gal的1毫升70%二甲基甲酰胺(DMF)中制备的5-溴-4-氯-3-吲哚 - β-D-吡喃半乳糖苷(X-gal的)储备溶液(40毫克/毫升)。用铝箔覆盖,并储存在-20℃下长期贮存。
- 准备硝基四氮唑蓝(NBT)ST玉珠溶液(50毫克/毫升)加入50克的NBT到1ml 70%的DMF。用铝箔覆盖,并储存在-20℃下长期贮存。
- 制备的LacZ定影液用80微升25%的戊二醛,5毫升4%PFA中,20微升的1M MgCl 2的,加入100μl的500mM EGTA,加入1ml的1M磷酸盐缓冲液pH 7.4和DDH 2 O的最多至最终体积为10ml。
- 制备的LacZ缓冲液A用1ml的1M的MgCl 2,5毫升的500mM EGTA 50毫升双蒸的1M磷酸盐缓冲液pH 7.4和2 O最多为500毫升的最终体积。
- 制备用1ml的1M的的MgCl 2,5毫升的500mM EGTA,毫升1%的5脱氧胆酸钠,加入100ml的10%的NP-40,将50ml的1M磷酸盐缓冲液pH 7.4和DDH 2 O的 LacZ的缓冲液B最多为500毫升的最终体积。
- 制备的LacZ缓冲液C中加入10微升的NBT原液和12.5微升X-gal的原液到1ml的LacZ缓冲液B的制作新鲜临使用前和用铝箔覆盖。
- 干的幻灯片在室温至少10-15分钟(同时准备用PAP笔幻灯片)。
- 固定部与LacZ的固定剂2分钟,在室温下,在化学通风橱内的潮湿室中。用PBS洗3次,补充了2mM的MgCl 2。
- 冲洗用的LacZ缓冲A.幻灯片与洗净的LacZ幻灯片缓冲A 3次,在室温每次10分钟。每次5分钟,洗2次,用LacZ的缓冲液B。孵育在LacZ的缓冲液C的幻灯片在30-37℃下进行6小时或过夜,在湿润的腔室中。
注意:添加的LacZ的缓冲液C足够的容积;幻灯片不能孵化过程中干出来的。 - 经过适当的孵育洗涤用PBS幻灯片补充了2mM的MgCl 2。冲洗部分简要双蒸2 O.盖玻片与Mayer的甘氨酸明胶。适合于光学显微镜配备有微分干涉对比(DIC)成像的设置。
6. GENDER和示踪基因分型
- 准备使用1M的Tris-HCl 1毫升pH为8.5,加入100μl的500mM EGTA尾裂解缓冲液,200微升10%SDS,和400微升的5M NaCl和DDH 2 O的以弥补为10ml的最终体积。
- 加入500微升尾裂解缓冲液含有一个尾活检每个Eppendorf管。加入蛋白酶K至100毫克/毫升的最终浓度。孵育过夜在振荡器上在55℃。
- 离心样品在17000×g离心10分钟,在RT。将上清液转移到新的离心管中。加入500微升异丙醇,以上清液。反相管上下混合至少5分钟。
- 旋在离心机在17000×g离心5分钟,在室温。倒掉上清。加入200微升的70%乙醇。摇动至少5分钟。
- 离心在17000×g离心5分钟。用的Pipetman(不要倒掉)上清。干燥温暖的室内(37°C)的颗粒为15-30分钟。
- 在100微升悬浮颗粒使用大口径的过滤技巧的低TE pH值8.0或水。置于55℃1小时,并在37℃下过夜进行适当的溶解。保存在4℃。
- 使用1微升的DNA进行PCR反应(含有1μl的尾DNA,2.5微升DMSO中,下午10点的每种引物,25μM的每种dNTP,和1M甜菜碱50μl的反应混合物)。 PCR引物基因分型和性别鉴定中列出的材料表。
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Representative Results
本节将展示可以得到与R26-BIZ(B L- 我 RES-τlacZ)和R26-GTT(G FP-TT C)等位基因工作代表性的结果。在这里,我们使用了R26-BIZ和R26-GTT等位基因来分析神经回路调节生殖轴的成熟。再生在脊椎动物的中心由神经元的下丘脑,其分泌的促性腺激素释放激素(GnRH)的一小部分进行控制。亲吻促动素,GnRH神经元的一个有力的活化剂,已被牵涉到调节GnRH神经元的活性,然而,当GnRH的和亲吻促动素神经元之间的神经回路建立在显影雌性小鼠大脑没有已知5。首先,我们表明,BIZ和GTT转基因的表达是特别通过在胚胎依赖于Cre的重组活化使用亲吻促动素特异性的Cre驱动线10在弓状核(ARC)( 图2)亲吻促动素的神经元。然后,我们表明,亲吻促动素中的神经元的ARC已经与GnRH神经元的子宫内 ( 图3A,B)中的特定子集通信。此外,我们表明,ARC亲吻促动素神经元是GnRH神经元( 图3A中的C)的上游。两者合计我们的研究结果表明,亲吻促动素和GnRH的神经元之间的神经电路被完全建立和操作的雌性小鼠大脑出生前。
图1:使用常规或遗传方法示踪剂的跨突触传递在传统的方法中,一个跨突触示踪剂是采取了由所有的神经元在注射部位从而可能标记非特异性无关的途径。在遗传方式,示踪剂由基因定义的神经元从而明确可视化连接到示踪表达细胞的神经元选择性地表达。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2:在胚胎ARC亲吻促动素神经元BIZ和GTT转基因的忠实激活。 (A)育种策略来激活BIZ和GTT表达亲吻促动素的神经元。我们育成R26-BIZ和R26-GTT小鼠亲吻促动素-IRES-Cre重组(KissIC)小鼠10,其中Cre重组酶是KISS1启动子的控制下表达。(CE)β半乳糖苷酶的酶活性标识示踪剂产细胞和被限制在ARC中的阴KissIC / R的脑26-BIZ胚胎胚胎天(E)18.5。(FG)双重免疫荧光的亲吻促动素(绿色)和BL(红色)(F)或GTT(红色)(G)由Cre重组酶介导的演示BL或GTT表达的忠实激活重组中,亲吻促动素神经元KissIC / R26-BIZ或KissIC / R26-GTT雌性小鼠胚胎分别。比例尺(C)500微米,(D)200微米,(F,G)50微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3:GnRH神经元突触被连接到并亲吻促动素神经元的下游。 (A) 组合遗传双向跨突触跟踪。 虽然τlaCZ仅限于Cre的表达亲吻促动素神经元,BL的transsynaptically转移到上游(突触前)和在KissIC / R26-BIZ小鼠下游(突触后)的神经元。与此相反,GFP-TTC被transsynaptically转移到KissIC / R26-GTT小鼠突触前,但不是突触后神经元。突触后神经元在他们紧挨τlacZ阳性的轴突纤维(B,C)双重免疫荧光的BL(红色; B);通过女性的整个头部和促性腺激素释放激素(绿色)上矢状切面或GTT(C红) KissIC / R26-BIZ或KissIC / R26-GTT胚胎在E18.5。(B)中请注意,某些,但不是所有的GnRH神经元含有BL上。这些数据表明,胚胎GnRH神经元的一个子集被突触连接到ARC亲吻促动素神经元。 (三)请注意,没有一个GnRH神经元都包含GTT。 BL的但不是GTT专属跨突触传递到GnRH神经元表明,GnRH神经元是亲吻促动素神经元的下游。比例尺(B,C),50微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
产品特点 | 跨突触示踪剂 | 嗜神经病毒 |
申请方式 | 表达为转基因 | 机械注入 |
传播方向 | 顺行,逆行和双向 | 逆行顺行& |
突触效能 | 多突触 | 多突触或突触(仅逆行) |
信号强度 | 弱,降低在每个突触 | 在每个突触强,信号放大 |
免疫反应 | 无;表现为内源性蛋白 | 强烈的免疫反应,致死 |
空间和时间分辨率 | 取决于选择的启动子 | 由于机械注射,个别网站高选择性 |
表1:遗传跨突触示踪剂的功能比较和转基因嗜神经病毒
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Discussion
相比于立体定位注射示踪剂或neurotopic病毒的表达跨突触示踪剂作为转基因跟踪基因定义神经元群体的神经回路具有几个优点。首先,将示踪剂是作为内源蛋白质,因此不引起任何免疫反应和选择性的神经通路可在不同的动物具有较高的再现性进行分析。第二,由于这是一种非侵入性的方法也可用于从神经元用于立体定位注射不容易进入跟踪电路,例如在子宫内 。限制包括在跨突触传递一个普遍较低的功效,这可能会导致在检测所述示踪剂的困难。此外,所述示踪剂分子得到稀释在每个突触。相比之下,嗜神经病毒复制和病毒复制又进而导致穿过突触后信号放大。然而,病毒复制也是一个主要limitat使用嗜神经病毒引起的病毒性内在细胞毒性离子。遗传跨突触示踪剂和遗传修饰的嗜神经病毒的某些特征进行了比较在表1中。
在R26-BIZ和R26-GTT等位基因互补,有利于在Cre重组酶介导的重组遗传鉴定神经元群的神经回路的可视化。在R 26的启动子是很好的特点,并介导无处不表达适度的强度11,12。使用高度敏感的方法检测示踪剂如酪胺信号放大(TSA)系统允许的示踪分子甚至微量跨突触传递的标识。使用R26启动子来驱动表达示踪剂的另一个主要优点是,表达神经元持续整个生命合成示踪剂。这使得能够分析电路成熟长时间的时间段5。与此相反,使用由于它们的细胞毒性的亲神经的病毒时,这是不可能的。重要的是,我们的二进制的遗传系统和使用R26的启动子脱开示踪剂的生产从潜在严重调节内源性的启动子驱动的Cre表达(在此情况下,KISS1启动子),其可以通过多种遗传和表观遗传因子13来调节。 BL和GTT的跨突触,因此转移反映了两个神经元群体之间的实际突触的沟通。
CRE介导的重组是一种不可逆的事件,因此,将其转换发育瞬时基因表达成稳定的转基因表达。使用一种可诱导酶Cre系统14可能会揭露发育的影响,由于瞬时表达Cre的。
总之,这两个新的R26-BIZ和R26-GTT小鼠品系可用于分析本地和LO纳克范围的神经回路不同类别和类型的神经元从任何脑部区域或甚至在一个依赖于Cre的方式脊髓始发的可能组成。
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Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Bisbenzimide (Hoechst 33258 dye) | Sigma | 14530-100MG | |
Ethanol | Sigma | 32205-1L | |
Cryo mold (Peel-a-way) | Polyscience Inc. | 18646A-1 | 22 x 22 x 20mm |
DMSO | Sigma | D8418-100ML | |
Dimethyl Formamide (DMF) | VWR Chemicals | 23470,293 | |
EGTA | ROTH | 3054.3 | |
Fluoromount G | Southern Biotech | 0100-01 | |
Glutaraldehyde | Sigma | G5882-50ML | |
Hydrogen peroxide | Sigma | 34988-7 | |
Isopentane (Methyl 2-butane) | Sigma | M32631-2.5L | |
Kaiser's glycine gelatin | Merck | 1092420100 | |
Methanol | Sigma | 494437-1L | |
MgCl2 | Sigma | M2670-100G | |
NaCl | ROTH | HN00.2 | |
NBT | Sigma | 298-83-9 | |
Nonidet P40 substitute | Fluka | 743.85 | |
OCT | Leica | 14020108926 | |
PAP pen | Dako | S2002 | |
Parafarmaldehyde | Sigma | P6148-1KG | |
Sodium deoxycholate | Sigma | D6750-25G | |
Sucrose | Sigma | S7903-1KG | |
Superfrost slides | Thermo Scientific | FT4981GLPLUS | |
TSA kit | PerkinElmer | NEL700 | |
TSA plus kit | PerkinElmer | NEL749A001KT | |
Tris | ROTH | AE15.2 | |
Triton-X 100 | ROTH | 3051.2 | |
Tween 20 | ROTH | 9127.1 | |
X-gal | ROTH | 2315.1 | |
Cryostat | Leica | na | |
Light microscope equipped with DIC imaging | Zeiss | Axioskop2 equipped with Axio Vision software | |
Fluroscence microscope | Zeiss | Axioskop2 equipped with Axio Vision software | |
Photoshop | Adobe | PS6 | |
Goat anti-WGA (recognizes BL) | Vector Laboatories | AS-2024 | |
Biotinylayted horse anti-goat IgG | Vector Laboatories | BA-9500 | |
Biotinylated goat anti-rabbit IgG | Vector Laboatories | BA-1000 | |
Rabbit anti-GFP (recognizes GTT) | Invitrogen | A11122 | |
Rabbit anti-GnRH | Affinity Bio Reagent | PA1-121 | |
Dylight488-donkey anti-rabbit IgG | Thermo Scientific | SA5-10038 | |
SA-Alexa Fluor 546 | Life Technologies | S-11225 | |
Primers | |||
BL Fwd (for BIZ genotyping) | Eurofins MWG Operon | ATGAAGATGATGAGCACCAGGGC | |
BL Rev (for BIZ genotyping) | Eurofins MWG Operon | AGCCCTCGCCGCAGAACTC | |
Cre Fwd (for Cre genotyping) | Eurofins MWG Operon | GTCGATGCAACGAGTGATGAGGTTCG | |
Cre Rev (for Cre genotyping) | Eurofins MWG Operon | CCAGGCTAAGTGCCTTCTCTACACCTGC | |
TTC Fwd (for GTT genotyping) | Eurofins MWG Operon | AGCAAGGGCGAGGAGCTGTT | |
TTC Rev (for GTT genotyping) | Eurofins MWG Operon | GTCTTGTAGTTGCCGTCGTCCTTGAA | |
XY Fwd (for gender genotyping) | Eurofins MWG Operon | TGAAGCTTTTGGCTTTGA | |
XY Rev (for gender genotyping) | Eurofins MWG Operon | CCGCTGCCAAATTCTTTG | |
ROSA26 Fwd | Eurofins MWG Operon | CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC | |
ROSA26 Rev | Eurofins MWG Operon | GCAGATGGAGCGGGAGAAAT | |
SA Rev | Eurofins MWG Operon | CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC |
References
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