Introduction
Chemin tracé anatomique est l'un des outils les plus couramment utilisés pour déchiffrer la relation entre le cerveau et le comportement 1. Progrès dans les technologies de circuits neuronaux traçage a accordé neuroscientifiques avec la capacité de retracer les circuits neuronaux de populations de neurones génétiquement identifiés chez la souris deux. En dépit de ces progrès techniques, il reste difficile de démêler la formation des circuits neuronaux en particulier pendant la maturation embryonnaire. Ce est parce que la plupart des méthodes de traçage développées à ce jour sont basées sur l'injection de traceurs transsynaptique stéréotaxique ou des virus neurotropes génétiquement modifiés (Figure 1) 2,3. Bien que ces techniques d'atteindre la résolution spatiale et temporelle de la connectivité, plusieurs limitations inhérentes telles que les injections traçantes techniquement difficiles dans le cerveau en développement, la reproductibilité du point d'injection, inflammation au potentiel du point d'injection et le plus imporcytotoxicité tantly causée par des virus neurotropes limiter leur utilisation 4.
Une méthode alternative consiste à exprimer que les traceurs transsynaptique transgènes dans des souris génétiquement modifiées. Nous avons récemment modifié cette technique et développé un système binaire de transsynaptique génétique traçage de cartographier les circuits neuronaux de toute population neuronale génétiquement identifié cinq. Notre stratégie expérimentale est basée sur deux nouvelles souches de souris knock-in, qui expriment soit la bidirectionnel traceur orge lectine (BL) 6 ou le traceur rétrograde toxine tétanique fragment C fusionnée à la GFP (GTT) 7 à partir du locus ROSA 26 après à médiation par Cre recombinaison. Ici, nous avons utilisé ces souches de souris pour exprimer sélectivement et BL GTT dans les neurones qui produisent kisspeptin, un neuropeptide qui est impliquée dans la régulation de la maturation de l'axe de reproduction 8,9. Nous démontrons que cette technique est apte à visualiser le développement et la maturation des bisoucircuits neuronaux peptine pendant le développement embryonnaire du cerveau de la souris femelle 5.
Stratégie d'élevage
Le R26-BL-IRES-τlacZ (BIZ) et les R26-GFP-TTC (GTT) lignes de traçage sont knock-in 5 souches qui portent allèles ROSA26 recombinantes. La R26-BIZ et les allèles R26-GTT sont transcriptionnellement silencieux en raison de la présence d'un signal d'arrêt de transcription fort, qui est flanquée par deux sites loxP 5. L'expression du transgène et BIZ GTT est activé par l'élimination médiée par Cre du signal d'arrêt de la transcription. Les allèles R26 et R26-BIZ-GTT peuvent être utilisés indépendamment par simple croisement avec une ligne de pilote Cre. Pour les animaux d'analyse hétérozygotes pour les allèles Cre et R26 respectifs peuvent être utilisés. Chiens d'un souche portant un allèle Cre ou une R26, respectivement, devraient être utilisés comme témoins. En variante, il est également possible de générer des triple knock-in animaux porteurs des allèles Cre, R26 et R26-BIZ-GTT, mais cela nécessitera une croix supplémentaire.
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Protocol
NOTE: Éthique Déclaration: procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvés par le comité de protection des animaux de l'Université de Hambourg et l'Université de la Sarre.
1. Préparation et fixation du tissu embryonnaire
- Disposer tout l'équipement nécessaire pour disséquer les embryons et préparer des solutions pour la fixation ultérieure du tissu avant de sacrifier les animaux.
REMARQUE: Toujours préparer une nouvelle paraformaldéhyde 4% (PFA) solution (PFA 4% dans 0,1 M de tampon phosphate salin (PBS), ajuster le pH à 7,4). - Euthanasier chronométré souris femelle enceinte avec une procédure éthique approuvé.
- Transférer la souris sur une plate-forme. Mouiller la face ventrale de l'abdomen avec 70% d'éthanol et faire une incision verticale à l'aide des ciseaux bien aiguisés pour exposer la cavité abdominale.
- Identifier la chaîne embryonnaire et tirez-le soigneusement à l'aide de pince émoussée et le placer dans PBS glacé.
- Retirez les embryons individuels dela chaîne embryonnaire avec des ciseaux et des pinces fines. Retirer le tissu supplémentaire autour des embryons et les laver dans PBS glacé.
- Prenez une petite queue biopsie (avant de transférer l'embryon dans PFA) et incuber dans la queue du tampon de lyse pour l'identification de genre et le traceur allèle génotypage PCR.
- À partir de l'embryon au côté le plus latérale et transférer chaque embryon séparément dans un tube contenant glacée PFA 4% sur de la glace sur un agitateur.
- Faire tremper les embryons à l'âge de E13.5 ou moins pendant 1,5 heure sur la glace avec une agitation constante. Faire tremper les embryons à E14,5 d'âge et E15.5 pendant 2,5 heures sur la glace avec une agitation constante.
- Pour E16,5 embryons d'âge ou plus, décapiter et enlever la peau extérieure avant de tremper la tête dans une solution PFA. Chefs d'embryons E16,5 peuvent être trempées pendant 4,5 heures sur la glace avec une agitation constante.
- Après fixation échéant, laver les embryons trois fois avec PBS glacé. Transférer les embryons dans 30% de saccharose dans une solution PBS à 4 ° C jusqu'à ce qu'ils coulentvers le bas.
2. congélation
- Disposer tous les matériaux nécessaires avant de commencer le processus de congélation: cryo-moules, cryo-gants, pinces plume d'entomologie, stylo marqueur et composés de température de coupe optimale (OCT)
- Etiqueter le cryo-moule avec un marqueur résistant à l'alcool permanent (mentionner l'orientation du tissu, la date et le génotype). Préparer une bouillie de glace sèche pilée et 100% d'éthanol dans un seau à glace. Placez un récipient en verre à l'intérieur contenant isopentane. Attendez 10 min pour le isopentane refroidir.
- Pendant ce temps retirer le tissu de la solution de saccharose, essuyer l'excès de saccharose dans le tissu en utilisant des lingettes de laboratoire. Transférer le tissu dans un cryo-moule pré-étiquetés avec suffisamment octobre pour couvrir le tissu. Éviter les bulles d'air dans les PTOM; en particulier autour du tissu.
- Orientez le tissu dans l'OCT aide d'une pince d'entomologie plume pour éviter des dommages aux tissus. Un début de congélation en transférant la cryo-moled dans le bain isopentane pré-refroidi. Ne pas éclabousser isopentane dans les PTOM comme il ne gèlera pas correctement. Envelopper les échantillons dans du papier d'aluminium et conserver à -80 ° C.
3. Cryosectioning
- Couper 14 sections um série minces en série »de cinq utilisant un cryostat et de recueillir sur des lames de verre SuperFrost® Plus pour immunofluorescence (IF) analyse. Conserver les diapositives à -80 ° C jusqu'à leur utilisation.
4. Tracer la visualisation Utilisation du (TSA) Protocole tyramide amplification du signal
- Préparer les tampons et les réactifs nécessaires pour la coloration. Toujours fraîchement préparer le tampon Tris-NaCl-Tween (TNT), le jour de l'utilisation.
- Préparer du tampon TNT en utilisant 100 ml de 1 M Tris-HCl pH 7,5, 30 ml de NaCl 5 M et ddH 2 O jusqu'à un volume final de 1 L. Ajouter 500 pi de Tween 20 en utilisant une pipette de 1 ml. Ajoutez le Tween 20 lentement et rincer la pipette de haut en bas à plusieurs reprises pour se assurer que tous Tween 20 est ensolution.
- Préparez Tris-NaCl-blocage (TNB) tampon en utilisant 100 ml de 1 M Tris-HCl pH 7,5, 30 ml de NaCl 5 M et ddH 2 O jusqu'à un volume final de 1 L. Ajouter 5 g de réactif de blocage (fourni avec le kit) lentement par petits incréments à la mémoire tampon, tout en agitant. Chauffer la solution progressivement à 55 ° C avec agitation continue pour dissoudre complètement le réactif de blocage (cela ne devrait pas prendre plus de 30 à 60 min). Pour obtenir un chauffage homogène utiliser un bain d'eau à 55 ° C. La solution apparaît laiteux. Porter la solution à la température ambiante avant l'utilisation. Aliquoter et conserver à -20 ° C pour le stockage à long terme.
- Reconstituer la biotine réactif tyramide (fourni avec le kit) dans Molecular Biology / HPLC DMSO. En fonction du kit est utilisé, la quantité appropriée de DMSO peut varier. Conserver la solution d'achat d'actions à 4 ° C.
NOTE: Les sections des animaux hétérozygotes pour les allèles CRE et R26 respectifs peuvent être utilisés pour l'analyse des circuits. Utilisation sréflexions à partir de la même portée transportant une Cre ou un allèle R26, respectivement, comme témoins négatifs. Traiter lames de contrôle négatives exactement comme diapositives provenant d'animaux doubles hétérozygotes. En outre, inclure une lame de contrôle d'un animal à double hétérozygote mais laisse de côté le réactif TSA (contrôle non amplifiée).
- Avec un scalpel frais forte enlever l'excès octobre entourant les coupes de tissu et marquer la frontière autour de sections avec un stylo de PAP.
- Sécher les diapositives pendant 2-3 min à température ambiante (RT). Laver les lames à la température ambiante 3x avec TNT pendant 5 minutes chacun. Incuber les lames à la température ambiante pendant 30 minutes dans 0,3% de H 2 O 2 solution dans du methanol glacé à étancher activité de peroxydase endogène.
- Laver 3x avec du PBS pendant 5 min chacun à RT. Incuber pendant 10 minutes dans 0,5% de Triton X-100 dans du PBS pendant perméabilisation des tissus. Laver les lames à la température ambiante 3x avec TNT pendant 5 minutes chacun.
- Bloc avec TNB (solution de blocage, 200-300 pi par diapo) pour 30min à température ambiante dans une chambre humidifiée. Assurez-vous que toutes les sections sont complètement couverts par TNB. Ne laissez pas les diapositives sécher entre les étapes.
- Égoutter l'excès de tampon de blocage et d'appliquer l'antisérum primaire reconnaissant le traceur (1: 1000 de chèvre anti-WGA pour BL, 1: 15,000 de lapin anti-GFP pour GTT) dilué dans TNB pendant 2 heures à la température ambiante ou une nuit à 4 ° C. Veillez à utiliser un volume suffisant pour couvrir complètement la section de tissu (200-300 pi par diapositive).
NOTE: Les dilutions d'antisérums primaires recommandés ici peuvent être ajustés. - Laver les lames à la température ambiante 3x avec TNT pendant 5 min chacun avec agitation.
- Incuber les sections avec un antisérum biotinylé secondaire reconnaissant l'hôte du premier antisérum (1: 500 cheval anti-IgG de chèvre anti-WGA, 1: 5000 de chèvre anti-IgG de lapin anti-GFP dans TNB pendant 1 heure à température ambiante).
- Laver 3x avec TNT à température ambiante pendant 5 min chacun avec agitation. Incuber dans 1: 100 streptavidine (SA) conjugué à la peroxydase de raifort (SA-HRP, à condition with le kit) dans TNB pendant 30 min à température ambiante dans une chambre humidifiée. Laver les lames à la température ambiante 3x avec TNT pendant 5 minutes chacun. Pendant ce temps dégeler la TSA.
- Diluer TSA 01h50 dans le CST amplification diluant (fourni avec le kit; utiliser le kit TSA pour la visualisation de BL et le kit TSA + pour GTT). Incuber les coupes de tissus dans dilué TSA précisément pour 10 min à température ambiante. Diluer TSA juste avant l'utilisation, idéalement au cours de l'étape de lavage précédente, ne pas utiliser de réactif dilué TSA restant pour de futures expériences; toujours se préparer frais.
- Laver les lames à la température ambiante 3x avec TNT pendant 5 min chacun avec agitation. Incuber à 1: 500 Alexa Fluor® 546 de la streptavidine conjugué à TNB pendant 30 min à température ambiante. Laver les lames à la température ambiante 3x avec TNT pendant 5 min chacun avec agitation.
- Incuber pendant 10 min dans une solution bisbenzimide 5% dans du PBS à température ambiante pendant une coloration nucléaire. Laver les lames à la température ambiante 3x avec TNT pendant 5 min chacun avec agitation. Montez avec Fluromount G et effectuer épifluorescence ou microscopie confocale.
5. τlacZ coloration pour les sections embryonnaires
- Préparer les tampons et les réactifs nécessaires pour la coloration. Toujours fraîchement préparer le tampon LacZ C avant utilisation.
- Préparation de 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal) de solution stock (40 mg / ml) en ajoutant 40 g de X-gal à 1 ml de 70% de diméthylformamide (DMF). Couvrir de papier d'aluminium et conserver à -20 ° C pour le stockage à long terme.
- Préparer nitro bleu de tétrazolium (NBT) stock solution (50 mg / ml) en ajoutant 50 g de NBT à 1 ml de 70% de DMF. Couvrir de papier d'aluminium et conserver à -20 ° C pour le stockage à long terme.
- Préparez LacZ fixateur en utilisant 80 ul de glutaraldéhyde à 25%, 5 ml de PFA 4%, 20 pl de 1 M de MgCl2, 100 ul de 500 mM d'EGTA, 1 ml de 1 M de tampon phosphate pH 7,4 et ddH 2 O jusqu'à une finale volume de 10 ml.
- Préparez LacZ en utilisant le tampon A 1 ml de 1 M de MgCl2, 5 ml de 500 mM d'EGTA, 50 ml de 1 M de tampon phosphate pH 7,4 et ddH 2 O jusqu'à un volume final de 500 ml.
- Préparer LacZ tampon B en utilisant 1 ml de 1 M de MgCl2, 5 ml d'mM d'EGTA 500, 5 ml de 1% de désoxycholate de sodium, 100 ml de 10% de NP-40, 50 ml de 1 M de tampon phosphate pH 7,4 et ddH 2 O jusqu'à un volume final de 500 ml.
- Préparer LacZ tampon C en ajoutant 10 pi de NBT solution stock et 12,5 pi de X-gal solution stock à 1 ml de tampon B. Faire LacZ frais juste avant utilisation et couvrir de papier d'aluminium.
- Sécher les lames à la température ambiante au moins pendant 10-15 min (temps préparer les diapositives avec un stylo PAP).
- Fixer la section avec LacZ fixateur pendant 2 min à température ambiante dans une chambre humidifiée à l'intérieur un produit chimique hotte aspirante. Laver 3 fois avec du PBS supplémenté avec 2 mM de MgCl2.
- Rincer les lames avec LacZ tampon A. laver les lames avec LacZ tampon A 3 fois pendant 10 min chacune à la température ambiante. Laver deux fois avec LacZ tampon B pendant 5 minutes chacun. Incuber les lames dans LacZ tampon C à 30-37 ° C pendant 6 heures ou toute la nuit dans une chambre humidifiée.
NOTE: Ajouter un volume suffisant de LacZ tampon C; diapositives ne doivent pas sécher pendant l'incubation. - Après une incubation appropriée laver les lames avec du PBS additionné MgCl2 2 mM. Rincer les sections brièvement avec ddH 2 O. Lamelle avec la glycine de la gélatine de Mayer. Convient pour un microscope optique équipé d'un contraste d'interférence différentiel (DIC) imagerie set-up.
6. Gender et Tracer génotypage
- Préparer du tampon de lyse de queue en utilisant 1 ml de 1 M Tris-HCl pH 8,5, 100 ul d'mM d'EGTA 500, 200 ul de SDS à 10%, 400 ul de NaCl 5 M et ddH 2 O pour obtenir un volume final de 10 ml.
- Ajouter 500 pi de tampon de lyse queue à chaque tube Eppendorf contenant une biopsie de la queue. Ajouter la proteinase K à une concentration finale de 100 mg / ml. Incuber une nuit sur un agitateur à 55 ° C.
- Centrifuger les échantillons à 17 000 g pendant 10 min à température ambiante. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de centrifugation. Ajouter 500 ul d'isopropanol au surnageant. Mélanger pendant au moins 5 minutes en inversant les tubes de haut en bas.
- Spin dans la centrifugeuse à 17 000 g pendant 5 min à température ambiante. Verser le surnageant. Ajouter 200 ul d'éthanol à 70%. Agiter pendant au moins 5 min.
- Centrifuger à 17 000 g pendant 5 min. Retirer le surnageant avec un Pipetman (ne pas verser off). Sécher la pastille dans une chambre chaude (37 ° C) pendant 15 à 30 min.
- Resuspendre le culot dans 100 pifaible pH 8,0 TE ou de l'eau à l'aide des conseils de gros calibre filtré. Mettre en 55 ° C pendant 1 h et à 37 ° C pendant la nuit pour une bonne dissolution. Conserver à 4 ° C.
- Utiliser une pi d'ADN pour la réaction PCR (mélange réactionnel de 50 pi contenant 1 pi de l'ADN de queue, 2,5 pi de DMSO, 22 heures de chaque amorce, 25 uM de chaque dNTP et 1 M de bétaïne). Amorces de PCR pour le génotypage et l'identification de genre sont énumérés dans le tableau des matériaux.
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Representative Results
Cette section montre des résultats représentatifs qui peuvent être obtenus en collaboration avec le R26-BIZ (B L I RES-τlac Z) et la R26-GTT (G FP TT C) allèles. Ici, nous utilisons la R26-BIZ et les allèles R26-GTT pour analyser la maturation des circuits neuronaux qui régissent l'axe de la reproduction. Reproduction chez les vertébrés est centralisé par un petit sous-ensemble de neurones dans l'hypothalamus, qui sécrètent l'hormone de libération des gonadotrophines (GnRH). Kisspeptin, un puissant activateur des neurones à GnRH, a été impliquée dans la régulation de l'activité des neurones à GnRH, mais quand les circuits neuronaux entre GnRH et les neurones de kisspeptine sont établis dans le cerveau de souris femelle en développement ne était pas connu 5. Premièrement, nous montrons que l'expression des transgènes BIZ et GTT sont spécifiquement activé par recombinaison Cre-dépendante embryonnairekisspeptin neurones dans le noyau arqué (ARC) (Figure 2) en utilisant une ligne de 10 Cre pilote spécifique de kisspeptin. Nous démontrons alors que les neurones dans le kisspeptin ARC déjà communiquer avec un sous-ensemble spécifique de neurones à GnRH in utero (figure 3A, B). En outre, nous montrons que les neurones de l'ARC sont kisspeptin amont des neurones à GnRH (figure 3A, C). Pris dans leur ensemble, nos résultats montrent que les circuits neuronaux entre kisspeptin et les neurones à GnRH sont pleinement établis et opérant dans le cerveau de souris femelle avant la naissance.
Figure 1:. Transfert transsynaptique des traceurs utilisant des approches classiques ou génétiques Dans l'approche classique, un traceur transsynaptique est repris par tous les neurones au niveau du site d'injection ainsi potentiellement étiquetage voies indépendantes non-spécifiques. Enl'approche génétique, le traceur est sélectivement exprimée par les neurones génétiquement définies ainsi visualisation spécifiquement neurones connectés aux cellules exprimant traceurs. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: activation Fidèle du BIZ et GTT transgène dans les neurones de l'ARC kisspeptin embryonnaires. (A) Stratégie d'élevage pour activer BIZ et d'expression dans les neurones de GTT kisspeptin. Nous avons élevé des souris R26 et R26-BIZ-GTT avec kisspeptine-IRES-Cre (KissIC) souris 10, dans lequel Cre recombinase est exprimée sous le contrôle du promoteur KISS1. (CE) l'activité β-gal enzymatique identifie le traceur-production cellules et est limitée à l'ARC dans le cerveau d'une femme KissIC / R26-BIZ embryon au jour embryonnaire (E) 18.5. (FG) Double immunofluorescence pour kisspeptin (vert) et BL (rouge) (F) ou GTT (rouge) (G) montre fidèle activation de l'expression BL ou GTT par Cre-médiation recombinaison dans kisspeptin neurones dans KissIC / R26-BIZ ou KissIC / R26-GTT embryons de souris femelle, respectivement. Barres d'échelle (C) 500 um, (D) 200 um, (F, G) 50 um. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: GnRH neurones sont reliés par des synapses et en aval de kisspeptin neurones. (A) Génétique bidirectionnel traçage des transsynaptique combinatoire. Alors que τlaCZ est limité aux neurones exprimant Cre-kisspeptin, BL transsynaptically est transféré vers l'amont (présynaptiques) et en aval des neurones post-synaptiques (chez la souris) KissIC / R26-BIZ. En revanche, la GFP-TTC est transsynaptically transféré aux neurones présynaptiques, mais pas chez les souris post-synaptiques KissIC / R26-GTT. Neurones post-synaptiques ont des fibres axonales τlacZ-positifs dans leur voisinage immédiat (B, C) Double de immunofluorescence pour BL (rouge; B). Ou GTT (rouge; C) et la GnRH (vert) sur une coupe sagittale à travers toute la tête d'une femme KissIC / R26-BIZ ou KissIC / R26-GTT embryon à a 18,5. (B) Notez que certains, mais pas tous les neurones à GnRH contiennent BL. Ces données démontrent qu'un sous-ensemble de neurones embryonnaires de la GnRH est relié à ARC synapses des neurones kisspeptin. (C) Notez qu'aucune des neurones à GnRH contient GTT. Transfert de transsynaptique exclusive de BL mais pas GTT pour les neurones à GnRH démontre que les neurones à GnRHsont en aval de neurones kisspeptin. Barres d'échelle (B, C) de 50 um. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Caractéristiques | Traceurs transsynaptique | Virus neurotropes |
| Mode de demande | Exprimé en un transgène | Mécaniquement injecté |
| Direction de propagation | Antérograde, rétrograde et bidirectionnelle | Rétrograde et antérograde |
| L'efficacité synaptique | Multisynaptiques | Multisynaptiques ou monosynaptique (rétrograder seulement) |
| La force du signal | Faible, diminue à chaque synapse | Strong, l'amplification du signal à chaque synapse |
| Réponse immunitaire | Aucun; exprimé en protéine endogène | Forte réponse immunitaire, mortelle |
| Résolution spatiale et temporelle | Dépend de promoteur de choix | Très sélectif en raison de injections mécaniques sur des chantiers individuels |
Tableau 1: Comparaison des caractéristiques des traceurs transsynaptique génétiques et des virus neurotropes génétiquement modifiés
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Discussion
Exprimant traceurs transsynaptique comme transgènes pour tracer les circuits neuronaux de populations neuronales génétiquement définies présente plusieurs avantages par rapport à l'injection stéréotaxique de traceurs ou des virus neurotopic. Tout d'abord, le traceur est produit comme une protéine endogène et donc ne provoque pas de réponse immunitaire et une voie neuronale sélective peut être analysé en différents animaux avec une reproductibilité élevée. Deuxièmement, parce que ce est un procédé non invasif, il peut être utilisé pour tracer les circuits de neurones pas facilement accessibles aux injections stéréotaxiques, par exemple in utero. Les limites comprennent une manière générale une faible efficacité dans le transfert transsynaptique, ce qui peut entraîner des difficultés dans la détection du traceur. En outre, la molécule traceur est dilué à chaque synapse. En revanche, les virus neurotropes reproduisent et la réplication virale à son tour conduit alors à amplification de signal après la traversée de la synapse. Cependant, la réplication virale est aussi un grand limitation de l'utilisation de virus neurotropes en raison de la cytotoxicité virale intrinsèque. Certaines fonctions de traceurs transsynaptique génétiques et des virus neurotropes génétiquement modifiées sont comparées dans le tableau 1.
Les allèles R26 et R26-BIZ-GTT se complètent mutuellement et facilitent la visualisation des circuits neuronaux d'une population neuronale génétiquement identifiés lors de la recombinaison Cre-médiation. Le promoteur R 26 est bien caractérisé et médiatise expression ubiquitaire avec une force modeste 11,12. En utilisant des procédés hautement sensibles pour la détection du traceur, tels que l'amplification du signal de tyramide système (TSA) permet l'identification de quantités infimes de molécules traceur transférés à travers les synapses. Un autre avantage majeur de l'utilisation du promoteur pour diriger l'expression R26 traceur est que les neurones exprimant la synthèse des traceurs en continu tout au long de leur vie. Il est ainsi possible d'analyser circuit maturationpour des périodes prolongées 5. En revanche, ce ne est pas possible pour l'utilisation de virus neurotropes en raison de leur cytotoxicité. Surtout, notre système génétique binaire et l'utilisation du promoteur R26 découple la production traceur de promoteurs endogènes potentiellement fortement réglementés conduite expression Cre (dans ce cas, le promoteur KISS1), qui peuvent être réglementés par une variété de facteurs de génétique et épigénétique 13. Ainsi transsynaptique transfert de BL et GTT reflète la communication synaptique réelle entre deux populations neuronales.
Recombinaison Cre-médiation est un événement irréversible et par conséquent, il convertit l'expression des gènes de développement transitoire dans l'expression du transgène stable. L'utilisation d'un système Cre inductible 14 peut potentiellement démasquer un effet sur le développement en raison de l'expression transitoire Cre.
En conclusion, les deux nouvelles souches de souris R26 et R26-BIZ-GTT peuvent être utilisés pour analyser locale et logamme circuits neuronaux ng qui pourraient être composés de différentes classes et types de neurones provenant de ne importe quelle région du cerveau ou même de la moelle épinière d'une manière Cre dépendant.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bisbenzimide (Hoechst 33258 dye) | Sigma | 14530-100MG | |
| Ethanol | Sigma | 32205-1L | |
| Cryo mold (Peel-a-way) | Polyscience Inc. | 18646A-1 | 22 x 22 x 20mm |
| DMSO | Sigma | D8418-100ML | |
| Dimethyl Formamide (DMF) | VWR Chemicals | 23470,293 | |
| EGTA | ROTH | 3054.3 | |
| Fluoromount G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | G5882-50ML | |
| Hydrogen peroxide | Sigma | 34988-7 | |
| Isopentane (Methyl 2-butane) | Sigma | M32631-2.5L | |
| Kaiser's glycine gelatin | Merck | 1092420100 | |
| Methanol | Sigma | 494437-1L | |
| MgCl2 | Sigma | M2670-100G | |
| NaCl | ROTH | HN00.2 | |
| NBT | Sigma | 298-83-9 | |
| Nonidet P40 substitute | Fluka | 743.85 | |
| OCT | Leica | 14020108926 | |
| PAP pen | Dako | S2002 | |
| Parafarmaldehyde | Sigma | P6148-1KG | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D6750-25G | |
| Sucrose | Sigma | S7903-1KG | |
| Superfrost slides | Thermo Scientific | FT4981GLPLUS | |
| TSA kit | PerkinElmer | NEL700 | |
| TSA plus kit | PerkinElmer | NEL749A001KT | |
| Tris | ROTH | AE15.2 | |
| Triton-X 100 | ROTH | 3051.2 | |
| Tween 20 | ROTH | 9127.1 | |
| X-gal | ROTH | 2315.1 | |
| Cryostat | Leica | na | |
| Light microscope equipped with DIC imaging | Zeiss | Axioskop2 equipped with Axio Vision software | |
| Fluroscence microscope | Zeiss | Axioskop2 equipped with Axio Vision software | |
| Photoshop | Adobe | PS6 | |
| Goat anti-WGA (recognizes BL) | Vector Laboatories | AS-2024 | |
| Biotinylayted horse anti-goat IgG | Vector Laboatories | BA-9500 | |
| Biotinylated goat anti-rabbit IgG | Vector Laboatories | BA-1000 | |
| Rabbit anti-GFP (recognizes GTT) | Invitrogen | A11122 | |
| Rabbit anti-GnRH | Affinity Bio Reagent | PA1-121 | |
| Dylight488-donkey anti-rabbit IgG | Thermo Scientific | SA5-10038 | |
| SA-Alexa Fluor 546 | Life Technologies | S-11225 | |
| Primers | |||
| BL Fwd (for BIZ genotyping) | Eurofins MWG Operon | ATGAAGATGATGAGCACCAGGGC | |
| BL Rev (for BIZ genotyping) | Eurofins MWG Operon | AGCCCTCGCCGCAGAACTC | |
| Cre Fwd (for Cre genotyping) | Eurofins MWG Operon | GTCGATGCAACGAGTGATGAGGTTCG | |
| Cre Rev (for Cre genotyping) | Eurofins MWG Operon | CCAGGCTAAGTGCCTTCTCTACACCTGC | |
| TTC Fwd (for GTT genotyping) | Eurofins MWG Operon | AGCAAGGGCGAGGAGCTGTT | |
| TTC Rev (for GTT genotyping) | Eurofins MWG Operon | GTCTTGTAGTTGCCGTCGTCCTTGAA | |
| XY Fwd (for gender genotyping) | Eurofins MWG Operon | TGAAGCTTTTGGCTTTGA | |
| XY Rev (for gender genotyping) | Eurofins MWG Operon | CCGCTGCCAAATTCTTTG | |
| ROSA26 Fwd | Eurofins MWG Operon | CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC | |
| ROSA26 Rev | Eurofins MWG Operon | GCAGATGGAGCGGGAGAAAT | |
| SA Rev | Eurofins MWG Operon | CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC | |
References
- Vercelli, A., Repici, M., Garbossa, D., Grimaldi, A. Recent techniques for tracing pathways in the central nervous system of developing and adult mammals. Brain. Res. Bull. 51, 11-28 (2000).
- Huang, Z. J., Zeng, H. Genetic approaches to neural circuits in the mouse. Annu. Rev. Neurosci. 36, 183-215 (2013).
- Lanciego, J. L., Wouterlood, F. G. A half century of experimental neuroanatomical tracing. J. Chem. Neuroanat. 42, 157-183 (2011).
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