Introduction
解剖パストレースは、脳と行動1との間の関係を解読するための最も一般的に使用さツールの一つです。神経回路のトレース技術の進歩は、マウス2における遺伝的に特定されニューロン集団から神経回路をトレースする能力を持つ神経科学を授けている。これらの技術的進歩にもかかわらず、それは特に、胚成熟中の神経回路の形成を解明するために依然として厳しい。現在までに開発さトレースの方法の多くは経シナプストレーサーまたは遺伝的に改変された神経向性ウイルスの定位注射（ 図1）2,3に基づいているためである。これらの技術は、発達中の脳、注射部位の再現性、注射部位の電位の炎症と最もimporに、接続性の空間的および時間的分解能を達成するような技術的に困難なトレーサー注射などのいくつかの固有の制限ものの神経向性ウイルスによるtantlyの細胞毒性は、それらの使用4を制限する。
別の方法は、遺伝子改変マウスでの導入遺伝子として経シナプストレーサーを表明することにある。我々は最近、この手法を変更し、すべての遺伝的に特定されニューロン集団5の神経回路をマッピングするために、バイナリ遺伝経シナプストレーシングシステムを開発した。 Cre介在した後に私たちの実験的な戦略は、双方向のトレーサー大麦レクチン（BL）6またはROSA 26座からGFP（GTT）7に融合した逆行性トレーサー破傷風毒素フラグメントCのいずれかを発現する二つの新しいノックインマウス系統に基づいており、再結合。ここでは、選択的にキスペプチンを作る神経細胞のBLとGTT、生殖軸8,9の成熟の調節に関与している神経ペプチドを表現するために、これらのマウス系統を使用していました。我々は、この技術は、キスの発達および成熟を可視化するために適していることを証明する雌マウスの脳5の胚発生時にpeptin神経回路。
育種戦略
R26-BL-IRES-τlacZ（BIZ）とR26-GFP-TTC（GTT）トレーサーラインがノックインされた組換えROSA26対立遺伝子を運ぶ菌株5。 R26-BIZとR26-GTT対立遺伝子は、2つのloxP部位5が隣接している強力な転写停止信号の存在に転写的に沈黙している。 BIZとGTT導入遺伝子の発現は、転写停止信号のCre媒介除去により活性化される。 R26-BIZとR26-GTT対立遺伝子は、単にのCreドライバラインと交配することによって独立して使用することができる。分析動物についてそれぞれCreおよびR26対立遺伝子についてヘテロ接合を使用することができる。 1 のCreまたは1 R26対立遺伝子を有する同腹仔は、それぞれ、対照として使用されるべきである。あるいは、トンを生成することも可能であるノックインriple のCre、R26-BIZとR26-GTT対立遺伝子を有する動物が、これは一つの追加のクロスが必要になります。
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Protocol
注：倫理声明：動物を対象とする手順は、ハンブルク大学とザールラント大学の動物福祉委員会によって承認された。
1.準備と胚組織の固定
- 胚を解剖し、動物を犠牲にする前に、組織のその後の固定のためのソリューションを準備するために必要なすべての機器を配置します。
注：常に（pHを7.4に調整し、0.1 Mリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中4％PFA）新鮮な4％パラホルムアルデヒド（PFA）溶液を調製する。 - 倫理的に承認された手順とタイミングを妊娠したメスのマウスを安楽死させる。
- プラットフォーム上にマウスを転送します。 70％エタノールで腹部の腹側を湿らせ、腹腔を露出させ、鋭いハサミを使って垂直切開する。
- 胚チェーンを特定し、慎重に鈍鉗子を使用してそれを引き出し、氷冷PBSにそれを配置します。
- から個々の胚を削除する細かいハサミとピンセットを用いて、胚チェーン。胚の周りに余分な組織を除去し、氷冷PBSでそれらを洗ってください。
- （PFAに胚を転送する前に）小さな尾の生検を取り、性別の識別とトレーサー対立遺伝子の遺伝子型決定PCR用テール溶解バッファーでそれをインキュベートする。
- ほとんどの側面に胚から開始し、シェーカー上で氷の上の氷冷4％PFAを含むチューブに別々に各胚を移す。
- 一定に振盪しながら氷上で1.5時間E13.5歳以下の年齢で胚を浸す。一定に振盪しながら氷上で2.5時間、年齢E14.5とE15.5で胚を浸す。
- 胚の年齢E16.5歳以上の場合は、首を切るとPFA溶液に頭を浸漬する前に、外側の皮膚を除去。 E16.5胚の頭部が一定に振盪しながら氷上で4.5時間浸漬することができます。
- 適切な固定後、氷冷PBSで胚を3回洗浄する。それらは沈むまで4℃でPBS溶液中の30％スクロース中に胚を移し下へ。
2.凍結
- クライオ金型、クライオ手袋、フェザー級昆虫学鉗子、マーカーペン、最適切削温度化合物（OCT）：凍結プロセスを開始する前に必要なすべての材料を配置
- （組織、日付と遺伝子型の向きに言及）恒久的なアルコール耐性マーカーでクライオモールドラベルを付けます。砕いたドライアイスのスラッシュとアイスバケットで100％エタノールを準備します。イソペンタンを含む内部のガラスビーカーを置きます。イソペンタンを冷却するために10分間待ちます。
- 一方、ショ糖溶液から組織を除去する実験室のワイプを用いて組織の周りに余分なショ糖を拭き取る。組織をカバーするために十分な10月で予め標識低温金型に組織を移す。 10月中に気泡を避ける。特に組織の周りに。
- 組織の損傷を避けるために、フェザー級昆虫学の鉗子を使用して、OCTで組織を向けます。クライオモルを転送することによって、凍結開始予め冷却したイソペンタン浴中dは。それが適切に凍結しないように10月にイソペンタンをかけないでください。 -80℃でアルミ箔とストア内のサンプルを包みます。
3.凍結切片化
- クライオスタットを用いて、5のシリーズの中で14μmの薄い連続切片をカットし、免疫蛍光（IF）分析のためのSuperFrost®プラスガラススライド上に収集する。使用するまで-80℃でスライドを保管してください。
チラミドシグナル増幅（TSA）プロトコルを使用して4トレーサーの可視化
- 染色に必要なバッファーと試薬を準備します。常に新鮮に利用当日にトリスNaClのトゥイーン（TNT）のバッファを準備します。
- 1 Lの最終容量までのNaClとのddH 2 O 5の1 Mトリス塩酸pH7.5の、30ミリリットルの100ミリリットルを使用して、TNT緩衝液を準備する1ミリリットルピペットを用いてのTween 20の500を添加する。すべてのTween 20であることを保証するためにゆっくりとツイーン20を加え、上下に数回ピペットをフラッシュソリューション。
- ブロッキング試薬5グラムを追加1 Lの最終容量まで1 Mトリス塩酸pH7.5の、30のNaClとのddH 5 mlの2 Oの100ミリリットルを使用してトリスのNaClブロッキング（TNB）のバッファを準備します（付属キット）をゆっくりバッファに少しずつ攪拌しながら。 （これは30〜60分より長い時間がかかるべきではありません）完全にブロッキング試薬を溶解するために連続的に撹拌しながら55℃まで徐々にソリューションを熱し。均質な加熱は55℃の水浴を使用し達成するために。ソリューションは、乳白色に表示されます。使用する前に室温にソリューションを持参してください。長期保存のために-20℃で小分けし、保存。
- 分子生物学/ HPLCグレードDMSO中（キットに付属）ビオチンチラミド試薬を再構成する。これに応じて、キットは、DMSOの適切な量は変化し得るために使用される。 4℃で保存溶液を保管してください。
注：それぞれのCreおよびR26対立遺伝子についてヘテロ接合性動物からの切片は、回路解析のために使用することができる。使用Sネガティブコントロールとして、それぞれ1 のCreまたは1 R26対立遺伝子を運ぶ同腹仔からections、。正確にダブルヘテロ接合動物からのスライドのようなネガティブコントロールスライドを扱います。また、ダブルヘテロ接合動物から一つの制御スライドを含むが、TSA試薬（増幅されていないコントロール）を除外。
- 鋭い新鮮なメスは、組織切片の周囲の過剰なOCTを除去し、PAPペンでセクションの周りに境界をマークする使用。
- 室温（RT）で2〜3分間、スライドを乾燥させる。 5分ごとにTNTでRT 3Xでスライドを洗う。内因性ペルオキシダーゼ活性をクエンチし、氷冷メタノール中で0.3％H 2 O 2溶液中に室温で30分間スライドをインキュベートする。
- 室温で5分間ごとに、PBSで洗浄3X。組織透過性のためにPBS中0.5％トリトンX-100で10分間インキュベートする。 5分ごとにTNTでRT 3Xでスライドを洗う。
- TNBとのブロック30（スライドあたり、200〜300μlのブロッキング溶液）加湿チャンバー中室温で分。すべてのセクションが完全にTNBでカバーされていることを確認してください。スライドはステップ間で完全に乾くせてはいけない。
- 過剰のブロッキングバッファーを切るとトレーサー認識する一次抗血清を適用するRTまたは一晩、4℃で2時間、TNB中に希釈し（1：1,000ヤギ抗WGA BLのため、1 15000ウサギGTT抗GFP）を。完全に組織切片（スライドあたり200〜300μl）をカバーするために十分なボリュームを使用してください。
注：ここで推奨プライマリ抗血清希釈液を調整しなければならないことがある。 - 5分で攪拌しながらそれぞれのTNTでRT 3Xでスライドを洗う。
- （：抗WGAのための500ウマ抗ヤギIgG、1：RTで1時間TNBにおける抗GFPのために5000ヤギ抗ウサギIgG 1）最初の抗血清のホストを認識し、ビオチン化二次抗血清でのセクションをインキュベートします。
- 5分で撹拌しながら、各RTでTNTを洗浄3X。 100ストレプトアビジン（SA）結合西洋ワサビペルオキシダーゼ（SA-HRP、提供のWi：1でインキュベートする加湿チャンバー内で室温で30分間、TNB中キット）番目。 5分ごとにTNTでRT 3Xでスライドを洗う。一方、TSAを解凍。
- （キットに付属、BLの可視化とGTTのためのTSA +キット用TSAキットを使用）TSA増幅希釈剤中TSA 1:50に希釈する。 RTで正確に10分間、希釈したTSAでの組織切片をインキュベートします。使用直前にTSAを希釈し、理想的に前の洗浄工程の間に、将来の実験のために、残りの希釈されたTSA試薬を使用しないでください。常に新鮮な準備。
- 5分で攪拌しながらそれぞれのTNTでRT 3Xでスライドを洗う。 RTで30分間TNBで500のAlexa Fluor（登録商標）546ストレプトアビジンコンジュゲート：1でインキュベートする。 5分で攪拌しながらそれぞれのTNTでRT 3Xでスライドを洗う。
- 核染色のために室温でPBS中の5％ビスベンズイミド溶液中で10分間インキュベートする。 5分で攪拌しながらそれぞれのTNTでRT 3Xでスライドを洗う。 Fluromount Gでマウントし、エピ蛍光または共焦点顕微鏡法を行う。
胚セクション5.τlacZ染色
- 染色に必要なバッファーと試薬を準備します。常に新鮮に使用前のLacZバッファーCを準備します。
- 1ミリリットルの70％ジメチルホルムアミド（DMF）のX-galを40gのを添加することにより5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルβ-D-ガラクトピラノシド（X-galの）ストック溶液（40 mg / mlの）を調製。長期保存のために-20℃でアルミホイルや店舗で覆い。
- 準備し、ニトロブルーテトラゾリウム（NBT）番目1ミリリットルの70％DMFにNBTを50g添加することによりOCK溶液（50 mg / mlで）。長期保存のために-20℃でアルミホイルや店舗で覆い。
- LacZの25％グルタルアルデヒドを80μl、4％PFAの5ミリリットル、1 MのMgCl 2、最終的に最大500のEGTAを100μl、1ミリリットルM 1のリン酸緩衝液pH7.4とのddH 2 O20μlのを使用して固定液の準備容量10ml。
- LacZを500 mMのEGTAを用いて、1 mlの1 MのMgCl 2、5ミリリットル、500ミリリットルの最終容量までの1 Mリン酸緩衝液（pH7.4）とのddH 2 Oを50mlのバッファ準備する。
- 1mlのMののMgCl 2、500 mMのEGTA 5mlの5mlの1％デオキシコール酸ナトリウム、10％のNP-40を100ml、50 1 Mリン酸緩衝液（pH7.4）の溶液とのddH 2 Oを使用してLacZのバッファBを準備500ミリリットルの最終容量まで。
- 使用直前に新鮮な作り、アルミホイルで覆ったLacZ緩衝液Bの1mlにNBTストック溶液10μlおよびX-galストック溶液12.5μLを添加することにより、LacZの緩衝液Cを調製する。
- （その間PAPペンでスライドを準備する）は、少なくとも10〜15分間室温でスライドを乾燥させます。
- LacZのセクションでは、化学ヒュームフード内部の加湿チャンバー内で室温で2分間固定液固定する。 PBSで3回洗浄を、2mMのMgCl 2を補った。
- LacZを持つスライドを室温で10分間、3回ずつ洗浄緩衝液のLacZ緩衝液Aでスライドを洗浄します。 5分間ずつのLacZ緩衝液Bで2回洗浄する。加湿チャンバー内で6時間または一晩30〜37℃でのLacZ緩衝液Cでスライドをインキュベートする。
注：LacZのバッファCの十分なボリュームを追加します。スライドは、インキュベーション中に完全に乾くべきではありません。 - 適切なインキュベーションの後、PBSでスライドを洗浄は、2のMgCl 2を補った。のddH 2 Oで簡単にセクションをすすぐマイヤーのグリシンゼラチンでカバースリップ。微分干渉コントラスト（DIC）イメージング·セットアップを搭載した光学顕微鏡に適しています。
6. GENDERおよびトレーサージェノタイピング
- 10ミリリットルの最終容量を補うために、1Mトリス塩酸pH8.5の、500 mMのEGTA、10％SDS、5 M NaClおよびのddH 2 O400μlの200μlの100μlを1ミリリットルを使用してテール溶解バッファーを準備します。
- 尾の生検を含む各エッペンドルフチューブにテール溶解バッファー500μlのを追加します。を100mg / mlの最終濃度にプロテイナーゼKを加える。 55℃でシェーカー上で一晩インキュベートする。
- RTで10分間、17000×gで遠心分離サンプル。新しい遠心チューブに上清を移し。上清に500μlのイソプロパノールを加える。アップ及びダウンチューブを反転させて、少なくとも5分間混ぜる。
- RTで5分間17000×gで遠心機でスピン。上清を注ぐ。 70％エタノール200μlを追加します。少なくとも5分間振る。
- 5分間17000×gで遠心分離する。ピペットマン（オフかけないでください）で上清を取り除きます。 15〜30分間のウォーム室（37℃）でペレットを乾燥させる。
- 100μlの再懸濁ペレット低TE pHが8.0または水の広口径フィルターチップを使用。適切な溶解に一晩で1時間、55℃に入れ、37℃で。 4℃で保存。
- PCR反応（尾DNA1μlの、各プライマー2.5μlのDMSO、10 PM、25の各dNTPμM、及び1Mベタインを含む50μlの反応混合物）のためのDNA1μlのを使用してください。ジェノタイピングと性別識別のためのPCRプライマーは、 マテリアルの表に記載されている。
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Representative Results
このセクションでは、R26-BIZ（B L-I RES-τlacのZ）とR26-GTT（G FP-TT C）の対立と協力を得ることができる代表的な結果を示している。ここでは、生殖軸を調整する神経回路の成熟を 分析するためにR26-BIZとR26-GTT対立遺伝子を使用しています。脊椎動物で複製することは、中央ゴナドトロピン放出ホルモン（GnRH）を分泌する視床下部ニューロンの小さなサブセットによって制御されます。キスペプチン、のGnRHニューロンの強力な活性化は、しかしのGnRHとキスペプチンニューロン間の神経回路が発達メスのマウスの脳内で確立されたときに5を知られていなかった、のGnRHニューロンの活性を調節に関与している。まず、BIZとGTT導入遺伝子の発現を特異的胚におけるCre依存組換えによって活性化されることを示しているキスペプチン固有のCreドライバライン10を使用して、弓状核（ARC）におけるキスペプチンニューロン（ 図2）。次に、すでにARCでそのキスペプチンニューロンを実証する子宮内でのGnRHニューロンの特定のサブセット（ 図3A、B）と通信する。さらに、我々はARCのキスペプチンニューロンのGnRHニューロン（ 図3A、C）の上流にあることを示している。まとめると、我々の調査結果は、キスペプチンとのGnRHニューロン間の神経回路が完全に出生前に雌マウスの脳に設立され、動作可能であることを示している。
図1：従来の、または遺伝的アプローチを使用して、トレーサーの経シナプス伝達は 、従来のアプローチでは、経シナプストレーサーは、潜在的に非特異的な無関係な経路を標識し、注入部位でのすべてのニューロンによって取り込まれる。で遺伝的アプローチは、トレーサーは選択的に、具体的ト レーサー発現細胞に接続されたニューロンを可視化し、遺伝的に定義されたニューロンで表現される。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：胚のARCキスペプチンニューロンにおけるBIZとGTTジーンの忠実な活性化。 （A）繁殖戦略は、キスペプチンニューロンにおけるBIZとGTTの発現を活性化する。我々は、CreリコンビナーゼがKISS1プロモーターの制御下で発現されるキスペプチン-IRES-Creリコンビナーゼ（KissIC）マウス10とR26-BIZとR26-GTTマウスを交配させ、（CE）のβ-gal酵素活性を識別トレーサー産細胞と女性KissIC / Rの脳内にARCに制限されている胚日（E）18.5。（FG）キスペプチン（緑）のための二重免疫蛍光およびBL（赤）（F）またはGTT（赤）（G）の26-BIZ胚は、Cre媒介によってBLまたはGTT表現の忠実な活性化を示していますそれぞれ、KissIC / R26-BIZまたはKissIC / R26-GTT雌マウス胚においてニューロンをキスペプチンでの再結合。スケールバー（C）が500μm、（D）が200μm、（F、G）は50μm。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：のGnRHニューロンはシナプスに接続し、キスペプチンニューロンの下流ている。 （A） コンビナトリアル遺伝双方向経シナプスのトレース。 τlaながらCZは、BLはtranssynaptically KissIC / R26-BIZマウスの（シナプス前）と下流（シナプス後）ニューロンを上流に転送され、Creを発現キスペプチンニューロンに限定されている。これとは対照的に、GFP-TTCはtranssynaptically KissIC / R26-GTTマウスのシナプス前が、シナプス後ニューロンではないに転送されます。シナプス後ニューロンは、その近傍にτlacZ陽性軸索繊維を持っているBL（赤; B）のために（B、C）二重免疫蛍光。またはGTT（赤; C）とのGnRH（緑）矢状断面上の女性の頭全体を通してKissIC / R26-BIZまたはKissIC / R26-GTT胚E18.5で。（B）は 、いくつかが、すべてのGnRHニューロンはBLが含まれていないことに注意してください。これらのデータは、胚のGnRHニューロンのサブセットは、シナプスキスペプチンニューロンARCに接続されていることを示している。 （C）は、GnRHのニューロンのいずれもGTTを含まないことに注意してください。のGnRHニューロンにBLはなく、GTTの独占経シナプス伝達は、そののGnRHニューロンを示していますキスペプチンニューロンの下流にある。スケールバー（B、C）は50μm。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| 特徴 | 経シナプストレーサー | 神経向性ウイルス |
| アプリケーションのモード | 導入遺伝子として表現 | 機械的に注入された |
| スプレッドの方向 | 順行、逆行＆双方向 | レトログラード＆順行 |
| シナプス効力 | Multisynaptic | Multisynapticまたは単シナプス（逆行のみ） |
| 信号強度 | 弱い、すべてのシナプスで減少 | すべてのシナプスの強い、信号増幅 |
| 免疫応答 | なし。内因性タンパク質として発現 | 強い免疫応答、致死 |
| 空間と時間分解能 | 選択したプロモーターに依存します | 原因個々のサイトでの機械的注射に対する選択性の高い |
表1：遺伝経シナプストレーサーの特徴の比較と遺伝的に改変された神経向性ウイルス
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Discussion
遺伝的に定義されたニューロン集団の神経回路をトレースする導入遺伝子として経シナプストレーサーを発現するトレーサーまたはneurotopicウイルスの定位注射と比較していくつかの利点を有する。まず、トレーサーは、内因性タンパク質として産生されるので、任意の免疫応答を誘発しないと選択的な神経経路は、再現性の高い別の動物で分析することができる。これは、非侵襲的な方法であるため、第二に、それは、 子宮内で 、例えば、定位注射のために容易にアクセスできないニューロンから回路をトレースするために利用することができる。制限は、トレーサの検出が困難になる可能性経シナプス転送における一般的に低い有効性を含む。さらに、トレーサー分子は、すべてのシナプスに希釈されます。対照的に、神経向性ウイルスが複製し、ひいてはウイルス複製は、次にシナプスを横断した後に信号増幅をもたらす。しかし、ウイルス複製にも主要なlimitatです本質的なウイルスの細胞毒性による神経向性ウイルスの使用のイオン。遺伝的にいくつかの遺伝的経シナプストレーサーの特徴とは、神経向性ウイルスは、表1において比較される修正された。
R26-BIZとR26-GTT対立遺伝子は、お互いを補完し、Cre介在組換えの際に、遺伝的に特定されニューロン集団の神経回路の可視化を促進する。 R 26プロモーターは、十分に特徴付けされ、控えめな強11,12とユビキタス表現を仲介する。そのようなチラミドシグナル増幅（TSA）システムなどのトレーサー検出のための高感度な方法を使用して、トレーサー分子であっても微量の同定は、シナプスを介して転送可能にする。トレーサーの発現を駆動するためR26プロモーターを使用することのもう一つの大きな利点は、発現するニューロンは、継続的に一生トレーサーを合成することである。これにより、回路の成熟を分析することを可能にする長時間の期間5。それらの細胞毒性による神経向性ウイルスを使用する場合とは対照的に、これは不可能である。重要なことは、我々のバイナリ遺伝系及びR26プロモーターの使用は、遺伝的およびエピジェネティックな要因13の様々によって調節され得る（この場合、KISS1プロモーター ）Cre発現を駆動する潜在厳しく規制され、内因性プロモーターからのトレーサーの生産を脱共役。したがって、BLとGTTの経シナプス伝達は2ニューロン集団間の実際のシナプス通信を反映している。
Cre介在組換えは、不可逆的な事象であるため、安定した導入遺伝子の発現に発達一過性の遺伝子発現に変換する。誘導性のCreシステム14の使用は、潜在的に起因する一過性Cre発現に発達効果をアンマスクすることができる。
結論として、2つの新規R26-BIZとR26-GTTマウス系統は、ローカルおよび見よを分析するために使用することができる異なるクラス及び任意の脳領域から、あるいはCre依存様式で脊髄由来の神経細胞の種類から構成されることがありngの範囲神経回路。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bisbenzimide (Hoechst 33258 dye) | Sigma | 14530-100MG | |
| Ethanol | Sigma | 32205-1L | |
| Cryo mold (Peel-a-way) | Polyscience Inc. | 18646A-1 | 22 x 22 x 20mm |
| DMSO | Sigma | D8418-100ML | |
| Dimethyl Formamide (DMF) | VWR Chemicals | 23470,293 | |
| EGTA | ROTH | 3054.3 | |
| Fluoromount G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | G5882-50ML | |
| Hydrogen peroxide | Sigma | 34988-7 | |
| Isopentane (Methyl 2-butane) | Sigma | M32631-2.5L | |
| Kaiser's glycine gelatin | Merck | 1092420100 | |
| Methanol | Sigma | 494437-1L | |
| MgCl2 | Sigma | M2670-100G | |
| NaCl | ROTH | HN00.2 | |
| NBT | Sigma | 298-83-9 | |
| Nonidet P40 substitute | Fluka | 743.85 | |
| OCT | Leica | 14020108926 | |
| PAP pen | Dako | S2002 | |
| Parafarmaldehyde | Sigma | P6148-1KG | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D6750-25G | |
| Sucrose | Sigma | S7903-1KG | |
| Superfrost slides | Thermo Scientific | FT4981GLPLUS | |
| TSA kit | PerkinElmer | NEL700 | |
| TSA plus kit | PerkinElmer | NEL749A001KT | |
| Tris | ROTH | AE15.2 | |
| Triton-X 100 | ROTH | 3051.2 | |
| Tween 20 | ROTH | 9127.1 | |
| X-gal | ROTH | 2315.1 | |
| Cryostat | Leica | na | |
| Light microscope equipped with DIC imaging | Zeiss | Axioskop2 equipped with Axio Vision software | |
| Fluroscence microscope | Zeiss | Axioskop2 equipped with Axio Vision software | |
| Photoshop | Adobe | PS6 | |
| Goat anti-WGA (recognizes BL) | Vector Laboatories | AS-2024 | |
| Biotinylayted horse anti-goat IgG | Vector Laboatories | BA-9500 | |
| Biotinylated goat anti-rabbit IgG | Vector Laboatories | BA-1000 | |
| Rabbit anti-GFP (recognizes GTT) | Invitrogen | A11122 | |
| Rabbit anti-GnRH | Affinity Bio Reagent | PA1-121 | |
| Dylight488-donkey anti-rabbit IgG | Thermo Scientific | SA5-10038 | |
| SA-Alexa Fluor 546 | Life Technologies | S-11225 | |
| Primers | |||
| BL Fwd (for BIZ genotyping) | Eurofins MWG Operon | ATGAAGATGATGAGCACCAGGGC | |
| BL Rev (for BIZ genotyping) | Eurofins MWG Operon | AGCCCTCGCCGCAGAACTC | |
| Cre Fwd (for Cre genotyping) | Eurofins MWG Operon | GTCGATGCAACGAGTGATGAGGTTCG | |
| Cre Rev (for Cre genotyping) | Eurofins MWG Operon | CCAGGCTAAGTGCCTTCTCTACACCTGC | |
| TTC Fwd (for GTT genotyping) | Eurofins MWG Operon | AGCAAGGGCGAGGAGCTGTT | |
| TTC Rev (for GTT genotyping) | Eurofins MWG Operon | GTCTTGTAGTTGCCGTCGTCCTTGAA | |
| XY Fwd (for gender genotyping) | Eurofins MWG Operon | TGAAGCTTTTGGCTTTGA | |
| XY Rev (for gender genotyping) | Eurofins MWG Operon | CCGCTGCCAAATTCTTTG | |
| ROSA26 Fwd | Eurofins MWG Operon | CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC | |
| ROSA26 Rev | Eurofins MWG Operon | GCAGATGGAGCGGGAGAAAT | |
| SA Rev | Eurofins MWG Operon | CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC | |
References
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