Introduction
Rastreo de ruta anatómica es una de las herramientas más comúnmente utilizadas para descifrar la relación entre el cerebro y el comportamiento 1. El avance en las tecnologías de circuitos neuronales rastreo ha otorgado neurocientíficos con la capacidad de rastrear los circuitos neuronales de poblaciones de neuronas identificadas genéticamente en ratones 2. A pesar de estos avances técnicos que sigue siendo un reto para desentrañar la formación de circuitos neuronales especialmente durante la maduración embrionaria. Esto es porque la mayoría de los métodos de rastreo desarrolladas hasta la fecha se basan en la inyección estereotáxica de trazadores transsynaptic o virus neurotróficos modificados genéticamente (Figura 1) 2,3. Si bien estas técnicas de lograr la resolución espacial y temporal de la conectividad, varias limitaciones inherentes, tales como inyecciones de trazadores técnicamente desafiantes en el cerebro en desarrollo, la reproducibilidad de la sitio de la inyección, inflamación potencial en el sitio de la inyección y lo más importante citotoxicidad causada por los virus neurotróficos limitar su uso 4.
Un método alternativo consiste en expresar los trazadores transsynaptic como transgenes en ratones genéticamente alterados. Recientemente hemos modificado esta técnica y ha desarrollado un sistema de rastreo transsynaptic genética binaria para mapear los circuitos neurales de una población neuronal identificado genéticamente 5. Nuestra estrategia experimental se basa en dos nuevas cepas de ratón knock-in, que expresan ya sea la lectina de cebada trazador bidireccional (BL) 6 o el trazador retrógrado fragmento de la toxina tetánica C fusionado a GFP (GTT) 7 desde el locus ROSA 26 después mediada por Cre recombinación. Aquí hemos utilizado estas cepas de ratón para expresar selectivamente BL y GTT en las neuronas que producen kisspectina, un neuropéptido que está implicada en la regulación de la maduración del eje reproductivo 8,9. Se demuestra que esta técnica es adecuado para visualizar el desarrollo y maduración del besocircuitos neuronales peptina durante el desarrollo embrionario del cerebro del ratón hembra 5.
Estrategia de cría
El R26-BL-IRES-τlacZ (BIZ) y los R26-GFP-TTC (GTT) líneas trazadoras son ronda en cepas 5 que llevan alelos ROSA26 recombinantes. El R26-BIZ y los alelos R26-GTT son transcripcionalmente silencioso debido a la presencia de una fuerte señal de parada transcripcional, que está flanqueado por dos sitios loxP 5. Expresión del transgén BIZ GTT y se activa por la eliminación mediada por Cre de la señal de parada transcripcional. Los alelos R26 y R26-BIZ-GTT se pueden utilizar independientemente con sólo cruzar con una línea piloto Cre. Para los animales de análisis de heterocigotos para los alelos respectivos Cre y R26 pueden ser utilizados. Littermates que llevan uno Cre o un alelo R26, respectivamente, deben ser utilizados como controles. Alternativamente, también es posible generar tRiple ronda en animales portadores de los alelos Cre, R26 y R26-BIZ-GTT, sin embargo esto requerirá una cruz adicional.
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Protocol
NOTA: Declaración de Ética: Los procedimientos que implican sujetos animales fueron aprobados por el Comité de Bienestar Animal de la Universidad de Hamburgo y la Universidad de Saarland.
1. Preparación y fijación de tejido embrionario
- Organizar todos los equipos necesarios para diseccionar los embriones y preparar soluciones para la posterior fijación de los tejidos antes de sacrificar a los animales.
NOTA: Siempre preparar una solución fresca 4% de paraformaldehído (PFA) (4% PFA en 0,1 M tampón fosfato salino (PBS), ajustar el pH a 7,4). - La eutanasia cronometrado ratón hembra embarazada con un procedimiento éticamente aprobado.
- Transferir el ratón sobre una plataforma. Humedezca la cara ventral del abdomen con etanol al 70% y hacer una incisión vertical con unas tijeras afiladas para exponer la cavidad abdominal.
- Identificar la cadena embrionario y tire de ella con cuidado aplicando fórceps romos y colocarlo en helado de PBS.
- Retire los embriones individuales dela cadena de embriones utilizando finas tijeras y pinzas. Quitar el tejido extra alrededor de los embriones y lávelos con helado de PBS.
- Tomar una pequeña biopsia de cola (antes de transferir el embrión en PFA) y se incuba en tampón de lisis de la cola para la identificación de género y genotipado alelo trazador PCR.
- Iniciar en el embrión en el lado más lateral y transferir cada embrión por separado en un tubo que contiene helado 4% PFA en el hielo en una coctelera.
- Remojar los embriones a la edad de E13.5 o menos durante 1,5 h en hielo con agitación constante. Remojar los embriones en E14.5 E15.5 edad y durante 2,5 horas en hielo con agitación constante.
- Por E16.5 embriones edad o más, decapitar y quitar la piel exterior antes de remojar la cabeza en una solución de PFA. Jefes de embriones E16.5 pueden ser remojados durante 4,5 horas en hielo con agitación constante.
- Después de la fijación apropiada, lavar los embriones tres veces con PBS enfriado con hielo. La transferencia de los embriones en 30% de sacarosa en solución de PBS a 4 ° C hasta que se hundena la parte inferior.
2. Congelación
- Organizar todos los materiales necesarios antes de iniciar el proceso de congelación: crio-moho, crio-guantes, pinzas entomología peso pluma, rotulador y compuestas temperatura óptima de corte (OCT)
- Etiquetar el molde crio con un marcador permanente resistente al alcohol (mencionar la orientación del tejido, la fecha y genotipo). Preparar un granizado de hielo seco triturado y etanol al 100% en un cubo de hielo. Coloque un vaso de vidrio en el interior contiene isopentano. Espere 10 minutos para el isopentano se enfríe.
- Mientras tanto eliminar el tejido de la solución de sacarosa, limpie el exceso de sacarosa en todo el tejido utilizando toallitas de laboratorio. Transferir el tejido en un crio-molde previamente etiquetado con suficiente octubre para cubrir el tejido. Evite las burbujas de aire en los PTU; especialmente alrededor del tejido.
- Oriente el tejido en octubre utilizando pinzas entomología peso pluma para evitar daños en los tejidos. Iniciar la congelación mediante la transferencia de la crio-mold en el baño de isopentano enfriado previamente. No salpique isopentano en el octubre, ya que no se congele correctamente. Envuelva las muestras en papel de aluminio y guardar a -80 ° C.
3. cryosectioning
- Cortar 14 m de serie de secciones delgadas en serie de cinco usando un criostato y recoger en portaobjetos de vidrio SuperFrost® Plus para inmunofluorescencia análisis (SI). Guarde las diapositivas a -80 ° C hasta su utilización.
4. trazador visualización utilizando el protocolo (TSA) tiramida amplificación de señal
- Preparar los tampones y reactivos necesarios para la tinción. Siempre recién preparar el tampón Tris-NaCl-Tween (TNT) en el día de uso.
- Preparar tampón TNT utilizando 100 ml de M Tris-HCl 1 pH 7,5, 30 ml de NaCl 5 M y ddH 2 O hasta un volumen final de 1 L. Añadir 500 l de Tween 20 utilizando una pipeta de 1 ml. Añadir el Tween 20 lentamente y lave la pipeta hacia arriba y abajo varias veces para asegurarse de que todo está en Tween 20solución.
- Prepare Tris-NaCl-bloqueo (TNB) buffer usando 100 ml de M Tris-HCl 1 pH 7,5, 30 ml de NaCl 5 M y ddH 2 O hasta un volumen final de 1 L. Añadir 5 g de reactivo de bloqueo (proporcionado con el kit) lentamente en pequeños incrementos a la memoria intermedia mientras se agitaba. Calentar la solución gradualmente a 55 ° C con agitación continua para disolver completamente el reactivo de bloqueo (esto no debería llevar más de 30 a 60 min). Para conseguir un calentamiento homogéneo utilizar un baño de agua a 55 ° C. La solución aparecerá lechoso. Llevar la solución a temperatura ambiente antes de usar. Alícuota y almacenar a -20 ° C para el almacenamiento a largo plazo.
- Reconstituir el reactivo tiramida biotina (suministrado con el kit) en Biología Molecular / grado HPLC DMSO. Dependiendo de qué kit se utiliza la cantidad apropiada de DMSO puede variar. La solución madre, a 4 ° C.
NOTA: Las secciones de los animales heterocigotos para los alelos respectivos Cre y R26 pueden ser utilizados para el análisis de circuitos. Uso sreflexiones de los compañeros de camada que llevan uno Cre o un alelo R26, respectivamente, como controles negativos. Tratar portaobjetos controles negativos exactamente como diapositivas de animales dobles heterocigotos. Además, incluyen una corredera de control de un animal heterocigota doble, pero dejar de lado el reactivo TSA (control sin amplificar).
- Con un bisturí afilado fresco eliminar el exceso de octubre en torno a los cortes de tejido y marca la frontera alrededor de las secciones con un lápiz PAP.
- Secar los portaobjetos durante 2-3 min a temperatura ambiente (RT). Se lavan los portas a TA 3x con TNT durante 5 minutos cada uno. Incubar los portaobjetos a TA durante 30 min en 0,3% de H 2 O 2 solución en metanol enfriado con hielo para apagar la actividad de la peroxidasa endógena.
- Lavar 3x con PBS durante 5 min cada uno a TA. Incubar durante 10 min en 0,5% de Triton X-100 en PBS para la permeabilización del tejido. Se lavan los portas a TA 3x con TNT durante 5 minutos cada uno.
- Bloquear con TNB (solución de bloqueo, 200-300 l por diapositiva) para 30min a RT en una cámara humidificada. Asegúrese de que todas las secciones están completamente cubiertas por TNB. No deje que los portaobjetos se sequen entre los pasos.
- Escurrir el exceso de tampón de bloqueo y aplicar el antisuero primario reconocer el trazador (1: 1000 de cabra anti-WGA para BL, 1: 15.000 de conejo anti-GFP para GTT) diluido en TNB durante 2 horas a RT o durante la noche a 4 ° C. Asegúrese de utilizar un volumen suficiente para cubrir completamente la sección de tejido (200-300 l por diapositiva).
NOTA: Las diluciones de antisueros primarios recomendados aquí pueden tener que ser ajustada. - Se lavan los portas a TA 3x con TNT durante 5 minutos cada uno con agitación.
- Se incuban las secciones con antisuero secundario biotinilado que reconocen el anfitrión de la primera antisuero (1: 500 caballo anti-IgG de cabra anti-WGA, 1: 5.000 de cabra anti-IgG de conejo anti-GFP en TNB durante 1 hora a temperatura ambiente).
- Lavar 3 veces con TNT a TA durante 5 min cada uno con agitación. Incubar en 1: 100 de estreptavidina (SA) y conjugado con peroxidasa de rábano picante (SA-HRP, wi proporcionadoth el kit) en TNB durante 30 min a RT en una cámara humidificada. Se lavan los portas a TA 3x con TNT durante 5 minutos cada uno. Mientras tanto descongelar la TSA.
- Diluir 1:50 en TSA TSA diluyente de amplificación (suministrado con el kit, que utilicen el kit TSA para la visualización de BL y el kit TSA + para GTT). Incubar las secciones de tejido en diluido TSA precisamente por 10 min a RT. Diluir TSA justo antes de su uso, idealmente durante la etapa de lavado anterior, no utilice ningún restante diluida reactivo TSA para futuros experimentos; prepare siempre fresco.
- Se lavan los portas a TA 3x con TNT durante 5 minutos cada uno con agitación. Incubar con 1: 500 Alexa Fluor® 546 de estreptavidina conjugada en TNB durante 30 min a RT. Se lavan los portas a TA 3x con TNT durante 5 minutos cada uno con agitación.
- Incubar durante 10 min en solución bisbenzimide 5% en PBS a RT para la tinción nuclear. Se lavan los portas a TA 3x con TNT durante 5 minutos cada uno con agitación. Montar con Fluromount G y realizar epifluorescencia o microscopía confocal.
5. τlacZ tinción de secciones embrionarias
- Preparar los tampones y reactivos necesarios para la tinción. Siempre recién preparar el tampón de LacZ C antes de su uso.
- Preparar 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido (X-gal) solución madre (40 mg / ml) mediante la adición de 40 g de X-gal a 1 ml 70% de dimetilformamida (DMF). Cubra con papel aluminio y almacenar a -20 ° C para el almacenamiento a largo plazo.
- Preparar nitro azul tetrazolio (NBT) stock solución (50 mg / ml) mediante la adición de 50 g de NBT a 1 ml 70% de DMF. Cubra con papel aluminio y almacenar a -20 ° C para el almacenamiento a largo plazo.
- Prepare LacZ fijador utilizando 80 l de glutaraldehído al 25%, 5 ml de PFA al 4%, 20 l de 1 M de MgCl 2, 100 l de EGTA 500 mM, 1 ml de 1 M de tampón fosfato pH 7,4 y ddH 2 O hasta una final volumen de 10 ml.
- Prepare LacZ tampón A utilizando 1 ml de 1 M de MgCl 2, 5 ml de EGTA 500 mM, 50 ml de 1 M tampón fosfato pH 7,4 y ddH 2 O hasta un volumen final de 500 ml.
- Preparar tampón B LacZ usando 1 ml de 1 M de MgCl 2, 5 ml de EGTA 500 mM, 5 ml de 1% de desoxicolato de sodio, 100 ml de 10% de NP-40, 50 ml de tampón de fosfato 1 M pH 7,4 y ddH 2 O hasta un volumen final de 500 ml.
- Prepare el buffer de LacZ C mediante la adición de 10 l de solución de NBT y 12,5 l de X-gal solución madre a 1 ml de tampón LacZ B. Hacer fresco justo antes de su uso y cubrir con papel de aluminio.
- Seque las diapositivas a TA al menos durante 10-15 minutos (mientras tanto preparar las diapositivas con un lápiz PAP).
- Fije la sección con LacZ fijador durante 2 minutos a temperatura ambiente en una cámara húmeda en el interior una sustancia química del humo del capó. Lavar 3 veces con PBS suplementado con 2 mM MgCl2.
- Enjuagar los portaobjetos con tampón LacZ A. Lave los portaobjetos con LacZ tampón A 3 veces durante 10 minutos cada uno a temperatura ambiente. Lavar 2 veces con tampón LacZ B durante 5 minutos cada uno. Incubar los portaobjetos en tampón LacZ C a 30-37 ° C durante 6 horas o toda la noche en una cámara húmeda.
NOTA: Añadir suficiente volumen de tampón LacZ C; diapositivas no debe secarse durante la incubación. - Después de la incubación adecuada lavan los portaobjetos con PBS suplementado con 2 mM MgCl2. Enjuague secciones brevemente con ddH 2 O. Cubreobjetos con glicina gelatina de Mayer. Adecuado para un microscopio de luz equipado con un contraste de interferencia diferencial (DIC) de formación de imágenes set-up.
6. Gender y trazador Genotipado
- Preparar la cola tampón de lisis usando 1 ml de M Tris-HCl pH 8,5 1, 100 l de EGTA 500 mM, 200 l de 10% SDS, 400 l de NaCl 5 M y ddH 2 O para hacer un volumen final de 10 ml.
- Añadir 500 l de tampón de lisis de la cola a cada tubo Eppendorf que contiene una biopsia de la cola. Añadir proteinasa K a una concentración final de 100 mg / ml. Incubar toda la noche en un agitador a 55 ° C.
- Centrifugar las muestras a 17.000 xg durante 10 min a TA. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de centrífuga. Añadir 500 l de isopropanol al sobrenadante. Mezclar durante al menos 5 min invirtiendo los tubos arriba y hacia abajo.
- Girar en centrifugar a 17.000 xg durante 5 min a TA. Retirar el sobrenadante. Añadir 200 l de etanol al 70%. Agitar durante al menos 5 min.
- Se centrifuga a 17.000 xg durante 5 min. Aspirar el sobrenadante con una Pipetman (no vierta apagado). Secar el precipitado en una cámara caliente (37 ° C) durante 15-30 min.
- Resuspender pellet en 100 lde bajo TE pH 8,0 o agua usando puntas de ancho de ánima se filtró. Ponga en 55 ° C durante 1 hora y a 37 ° C durante la noche para disolución adecuada. Almacenar a 4 ° C.
- Utilice 1 l de ADN para la reacción de PCR (mezcla de reacción 50 l que contiene 1 l de ADN de la cola, 2,5 l DMSO, 22:00 de cada cebador, 25 M de cada dNTP, y betaína 1M). Cebadores de PCR para genotipificación y la identificación de género se enumeran en la tabla de Materiales.
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Representative Results
Esta sección muestra los resultados representativos que se pueden obtener a trabajar con el R26-BIZ (B L I RES-τlac Z) y la R26-GTT (G FP-TT C) alelos. Aquí se utiliza el R26-BIZ y los alelos R26-GTT para analizar la maduración de los circuitos neuronales que regulan el eje reproductivo. La reproducción en los vertebrados está controlado por un pequeño grupo de neuronas en el hipotálamo, que secretan la hormona liberadora de gonadotropina (GnRH). Kisspeptina, un potente activador de las neuronas de GnRH, se ha implicado en la regulación de la actividad de las neuronas de GnRH, sin embargo, cuando los circuitos neuronales entre GnRH y las neuronas kisspectina se establecen en el cerebro del ratón hembra en desarrollo no se conocía 5. Primero demostramos que la expresión de los transgenes BIZ GTT y se activan específicamente por recombinación Cre-dependiente en embrionariokisspectina neuronas en el núcleo arqueado (ARC) (Figura 2) utilizando una línea de conductor Cre-kisspectina específica 10. A continuación, demostramos que las neuronas kisspectina en la ARC ya comunicamos con un subconjunto específico de neuronas GnRH en el útero (Figura 3A, B). Además, se muestra que las neuronas del ARC kisspectina están aguas arriba de las neuronas GnRH (Figura 3 A, C). Tomado en conjunto nuestros resultados indican que los circuitos neuronales entre kisspectina y neuronas GnRH están plenamente establecidos y operativa en el cerebro de los ratones hembra antes del nacimiento.
Figura 1:. Transsynaptic transferencia de trazadores utilizando enfoques convencionales o genéticas En el enfoque convencional, un trazador transsynaptic es tomada por todas las neuronas en el sitio de la inyección así potencialmente el etiquetado de vías no relacionadas no específicos. Enel enfoque genético, el trazador se expresa selectivamente por las neuronas genéticamente definidos así visualizar específicamente neuronas conectadas a las células que expresan trazadores. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: activación de Fieles de la BIZ y GTT transgén en las neuronas del ARC kisspectina embrionarias. (A) Estrategia de cría para activar BIZ y expresión GTT en las neuronas kisspectina. Se criaron ratones R26 y R26-BIZ-GTT con Kisspeptina-IRES-Cre (KissIC) ratones 10, en el que Cre-recombinasa se expresa bajo el control del promotor Kiss1. (CE) actividad enzimática β-gal identifica el trazador productoras células y se limita a la ARC en el cerebro de una hembra KissIC / R26-BIZ embrión en el día embrionario (E) 18.5. (FG) inmunofluorescencia doble para kisspectina (verde) y BL (rojo) (F) o GTT (rojo) (G) demuestra la activación de la expresión fiel BL o GTT por Cre mediada recombinación en kisspectina neuronas en KissIC / R26-BIZ o KissIC / R26-GTT embriones de ratones hembra, respectivamente. Las barras de escala (C) 500 micras, (D) 200 micras, (F, G) 50 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: GnRH neuronas están conectadas a sinápticamente y aguas abajo de kisspectina neuronas. (A) Combinatoria genética rastreo transsynaptic bidireccional. Mientras τlacZ se limita a las neuronas que expresan Cre-kisspectina, BL se transfiere transsynaptically a aguas arriba (presináptica) y aguas abajo (neuronas postsinápticas) en ratones KissIC / R26-BIZ. Por el contrario, las buenas prácticas agrarias-TTC se transfiere transsynaptically a las neuronas presinápticas, pero no postsinápticos en ratones KissIC / R26-GTT. Postsináptica neuronas tienen fibras de axones τlacZ-positivos en su estrecha proximidad (B, C) de inmunofluorescencia doble para BL (rojo; B). O GTT (rojo; C) y GnRH (verde) en un corte sagital a través de toda la cabeza de una mujer KissIC / R26-BIZ o KissIC / R26-GTT embriones en E18.5. (B) Tenga en cuenta que algunas, pero no todas las neuronas GnRH contienen BL. Estos datos demuestran que un subconjunto de neuronas de GnRH embrionarias se sinápticamente conectado a ARC neuronas kisspectina. (C) Tenga en cuenta que ninguna de las neuronas GnRH contiene GTT. Transferencia transsynaptic Exclusivo de BL pero no GTT a las neuronas GnRH demuestra que las neuronas GnRHestán aguas abajo de las neuronas kisspectina. Las barras de escala (B, C) 50 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Características | Trazadores transsynaptic | Virus neurotróficos |
| Modo de aplicación | Expresado como un transgén | Mecánicamente inyectado |
| Dirección de difusión | Anterógrada, retrógrada y bidireccional | Retrógrada y anterógrada |
| La eficacia sináptica | Multisinápticos | Multisinápticos o monosináptico (retrógrado solamente) |
| Intensidad de la señal | Débil, disminuye en cada sinapsis | , Amplificación de la señal fuerte en cada sinapsis |
| Respuesta inmune | Ninguno; expresado como proteína endógena | Respuesta inmune fuerte y letal |
| La resolución espacial y temporal | Depende de promotor de elección | Altamente selectiva debido a las inyecciones mecánicas en sitios individuales |
Tabla 1: Comparación de las características de trazadores transsynaptic genéticos y los virus neurotróficos modificados genéticamente
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Discussion
Expresando trazadores transsynaptic como transgenes para rastrear los circuitos neurales de poblaciones neuronales definidas genéticamente tiene varias ventajas en comparación con la inyección estereotáxica de trazadores o virus neurotopic. En primer lugar, el trazador se produce como una proteína endógena y por lo tanto no provoca ninguna respuesta inmune y una vía neural selectiva puede ser analizada en diferentes animales con alta reproducibilidad. En segundo lugar, porque este es un método no invasivo que se puede utilizar para rastrear los circuitos de las neuronas no fácilmente accesible para inyecciones estereotáxicas, por ejemplo en el útero. Las limitaciones incluyen en general una baja eficacia en la transferencia de transsynaptic, que puede resultar en dificultades en la detección del trazador. Además, la molécula de trazador se diluye en cada sinapsis. En contraste, los virus neurotróficos replican y la replicación viral a su vez conduce a la señal de amplificación después de cruzar la sinapsis. Sin embargo, la replicación viral es también un importante limitation del uso de virus neurotrópicos debido a la citotoxicidad viral intrínseca. Algunas funciones de marcadores genéticos y transsynaptic virus neurotróficos modificados genéticamente se comparan en la Tabla 1.
Los alelos R26 y R26-BIZ-GTT se complementan y facilitan la visualización de los circuitos neurales de una población neuronal identificado genéticamente después de la recombinación mediada por Cre. El promotor R 26 está bien caracterizado y media en la expresión ubicua con una fuerza modesta 11,12. El uso de métodos altamente sensibles para la detección de trazador como el sistema de amplificación de la señal de tiramida (TSA) permite la identificación de incluso pequeñas cantidades de moléculas trazadoras transferidos a través de las sinapsis. Otra gran ventaja de usar el promotor R26 para conducir la expresión trazador es que las neuronas que expresan sintetizan continuamente los trazadores largo de su vida. Esto hace que sea posible analizar la maduración circuitodurante períodos de tiempo prolongados 5. Por el contrario, esto no es posible cuando se utiliza virus neurotróficos debido a su citotoxicidad. Es importante destacar que nuestro sistema genético binario y el uso del promotor R26 desacopla producción de trazadores de promotores endógenos potencialmente fuertemente regulados conducción Cre expresión (en este caso, el promotor Kiss1), que pueden ser regulados por una variedad de factores de genética y epigenética 13. Por lo tanto la transferencia transsynaptic de BL y GTT refleja la comunicación sináptica real entre dos poblaciones neuronales.
La recombinación mediada por Cre es un evento irreversible y por lo tanto se convierte desarrollo expresión génica transitoria en la expresión transgénica estable. El uso de un sistema inducible Cre 14 potencialmente puede desenmascarar un efecto de desarrollo debido a la expresión transitoria de Cre.
En conclusión, los dos nuevos R26 y R26-BIZ-GTT cepas de ratón se pueden usar para analizar local y locircuitos ng rango neuronales que podrían estar compuestos de diferentes clases y tipos de neuronas procedentes de cualquier región del cerebro o incluso desde la médula espinal de manera cre-dependiente.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bisbenzimide (Hoechst 33258 dye) | Sigma | 14530-100MG | |
| Ethanol | Sigma | 32205-1L | |
| Cryo mold (Peel-a-way) | Polyscience Inc. | 18646A-1 | 22 x 22 x 20mm |
| DMSO | Sigma | D8418-100ML | |
| Dimethyl Formamide (DMF) | VWR Chemicals | 23470,293 | |
| EGTA | ROTH | 3054.3 | |
| Fluoromount G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | G5882-50ML | |
| Hydrogen peroxide | Sigma | 34988-7 | |
| Isopentane (Methyl 2-butane) | Sigma | M32631-2.5L | |
| Kaiser's glycine gelatin | Merck | 1092420100 | |
| Methanol | Sigma | 494437-1L | |
| MgCl2 | Sigma | M2670-100G | |
| NaCl | ROTH | HN00.2 | |
| NBT | Sigma | 298-83-9 | |
| Nonidet P40 substitute | Fluka | 743.85 | |
| OCT | Leica | 14020108926 | |
| PAP pen | Dako | S2002 | |
| Parafarmaldehyde | Sigma | P6148-1KG | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D6750-25G | |
| Sucrose | Sigma | S7903-1KG | |
| Superfrost slides | Thermo Scientific | FT4981GLPLUS | |
| TSA kit | PerkinElmer | NEL700 | |
| TSA plus kit | PerkinElmer | NEL749A001KT | |
| Tris | ROTH | AE15.2 | |
| Triton-X 100 | ROTH | 3051.2 | |
| Tween 20 | ROTH | 9127.1 | |
| X-gal | ROTH | 2315.1 | |
| Cryostat | Leica | na | |
| Light microscope equipped with DIC imaging | Zeiss | Axioskop2 equipped with Axio Vision software | |
| Fluroscence microscope | Zeiss | Axioskop2 equipped with Axio Vision software | |
| Photoshop | Adobe | PS6 | |
| Goat anti-WGA (recognizes BL) | Vector Laboatories | AS-2024 | |
| Biotinylayted horse anti-goat IgG | Vector Laboatories | BA-9500 | |
| Biotinylated goat anti-rabbit IgG | Vector Laboatories | BA-1000 | |
| Rabbit anti-GFP (recognizes GTT) | Invitrogen | A11122 | |
| Rabbit anti-GnRH | Affinity Bio Reagent | PA1-121 | |
| Dylight488-donkey anti-rabbit IgG | Thermo Scientific | SA5-10038 | |
| SA-Alexa Fluor 546 | Life Technologies | S-11225 | |
| Primers | |||
| BL Fwd (for BIZ genotyping) | Eurofins MWG Operon | ATGAAGATGATGAGCACCAGGGC | |
| BL Rev (for BIZ genotyping) | Eurofins MWG Operon | AGCCCTCGCCGCAGAACTC | |
| Cre Fwd (for Cre genotyping) | Eurofins MWG Operon | GTCGATGCAACGAGTGATGAGGTTCG | |
| Cre Rev (for Cre genotyping) | Eurofins MWG Operon | CCAGGCTAAGTGCCTTCTCTACACCTGC | |
| TTC Fwd (for GTT genotyping) | Eurofins MWG Operon | AGCAAGGGCGAGGAGCTGTT | |
| TTC Rev (for GTT genotyping) | Eurofins MWG Operon | GTCTTGTAGTTGCCGTCGTCCTTGAA | |
| XY Fwd (for gender genotyping) | Eurofins MWG Operon | TGAAGCTTTTGGCTTTGA | |
| XY Rev (for gender genotyping) | Eurofins MWG Operon | CCGCTGCCAAATTCTTTG | |
| ROSA26 Fwd | Eurofins MWG Operon | CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC | |
| ROSA26 Rev | Eurofins MWG Operon | GCAGATGGAGCGGGAGAAAT | |
| SA Rev | Eurofins MWG Operon | CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC | |
References
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