Introduction
Anatomik yol izleme beyin ve davranış arasındaki ilişkiyi deşifre 1 en sık kullanılan araçlardan biridir. Nöral devre izleme teknolojileri İlerleme farelerde 2 genetik tanımlanan nöron nüfus nöral devreleri takip yeteneği ile sinirbilimcileri ihsan etmiştir. Bu teknik gelişmelerin rağmen özellikle embriyonik olgunlaşma sırasında nöral devrelerin oluşumunu çözülmeye zor kalır. Bugüne kadar geliştirilen izleme yöntemlerinin çoğu transsinaptik izleyiciler stereotaksik enjeksiyonu ya da genetik olarak tadil edilmiş nörotropik virüsleri (Şekil 1) 2,3 dayalı olmasıdır. Bu teknikler bağlantı mekansal ve zamansal çözünürlük gibi gelişmekte olan beynin, enjeksiyon yerinde ve en impor enjeksiyon yerinde tekrarlanabilirliği, potansiyel inflamasyon içine teknik açıdan zor izleyici enjeksiyonlar gibi çeşitli içsel sınırlamalar elde ederkennörotrop virüslerin neden rı değerlendirilerek sitotoksisite bunların kullanımını sınırlamak 4.
Alternatif bir yöntem, genetik olarak değiştirilmiş farelerde transgenler olarak transsinaptik izleyiciler bildirmektir. Son zamanlarda bu tekniği modifiye ve herhangi bir genetik tespit nöronal nüfusun 5 nöral devreleri eşleştirmek için bir ikili genetik transsinaptik izleme sistemi geliştirdik. Kre-aracılı sonra Bizim deneysel strateji çift yönlü izleyici arpa lektin (BL) da 6 ya da ROSA 26 lokusundan GFP (GTT) 7 kaynaşmış retrograd izleyici Tetanos Toksin parçası Cı sergileyen iki yeni knock-in fare suşlarının dayanmaktadır rekombinasyon. Burada seçici Kisspeptin üreten nöronlarda BL ve GTT, üreme eksen 8,9 olgunlaşmasını düzenleyen karıştığı bir neuropeptide ifade etmek, bu fare suşları kullanıldı. Biz bu teknik öpücük gelişimini ve olgunlaşmasını görselleştirmek için uygun olduğunu göstermekdişi fare beyninin 5 embriyonik gelişimi sırasında peptin sinir devresi.
Yetiştirme stratejisi
R26-BL-IRES-τlacZ (BIZ) ve R26-GFP-TTC (GTT) izleyici hatları knock-rekombinant ROSA26 alleller taşıyan suşlar 5 vardır. R26-dünyası ve R26-GTT aleller bağlı iki loxP sitelerinin 5 tarafından kuşatılır, güçlü transkripsiyon durdurma sinyali, varlığına bağlı olarak, transkripsiyonel olarak sessizdir. Dünyası ve GTT transgenin sentezlenmesi transkripsiyon durdurma sinyali kre-aracılı çıkarılması ile aktive edilir. R26-R26-BIZ ve GTT alleller sadece Cre sürücü hattı ile geçerek bağımsız olarak kullanılabilir. Ilgili Cre ve R26 aleller için analiz hayvanlar heterozigoz için kullanılabilir. Bir Cre ya da bir R26, aleli taşıyan yavrular, sırasıyla, kontrol olarak kullanılır. Seçenek olarak ise, bu t oluşturmak da mümkündürknock-Riple Kre, R26-R26-BIZ ve GTT alleller taşıyan hayvanlar, ancak bu bir ek haçı gerektirir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Etik Açıklama: hayvan denekleri Prosedürleri Hamburg Üniversitesi ve Saarland Üniversitesi hayvan koruma kurulu tarafından onaylanmıştır.
1. Hazırlık ve Embriyonik Doku Fixation
- Embriyoların teşrih ve hayvanlar kurban edilmeden önce doku sonraki tespiti için çözümler hazırlamak için gerekli tüm ekipman düzenleyin.
NOT: Her zaman (7.4 pH değerinin, 0.1 M fosfat tamponlu salin (PBS) içinde% 4 PFA), taze% 4 paraformaldehit (PFA) solüsyon hazırlanır. - Bir etik onaylı prosedüre zamanlı hamile kadın fare Euthanize.
- Bir platform üzerine fare aktarın. % 70 etanol ile karın ventral tarafı ıslatın ve karın boşluğuna maruz keskin bir makas kullanarak dikey bir kesi yapmak.
- Embriyonik zinciri tanımlamak ve dikkatle kullanarak künt forseps çekin ve buz gibi soğuk PBS içine yerleştirin.
- Bireysel embriyolar çıkarınince makas ve forseps kullanarak embriyonik zinciri. Embriyoların etrafında ekstra doku çıkarın ve buz gibi soğuk PBS yıkayın.
- (PFA içine embriyo transferinden önce) küçük bir kuyruk biyopsisi alın ve cinsiyet tanımlama ve izleyici alel genotiplemesi PCR için kuyruk lizis tamponu içinde kuluçkaya yatmaktadır.
- En dıştaki tarafında embriyodan başlayın ve bir çalkalayıcı üzerinde buz üzerinde buz soğukluğunda% 4 PFA içeren bir tüp içine ayrı ayrı embriyo transferi.
- Sabit sallayarak E13.5 yaş veya buz üzerinde 1.5 saat genç embriyolar bekletin. Sabit sallayarak buz üzerinde 2.5 saat yaş E14.5 ve E15.5 embriyolar bekletin.
- Embriyolar yaş E16.5 veya yaşlı için, başını kesmek ve PFA çözeltisi içinde kafa iliklerine önce dış deri kaldırmak. E16.5 embriyo Başlıkları sürekli çalkalanarak buz üzerinde 4.5 saat süreyle batırılmış olabilir.
- Uygun tespit edildikten sonra, buz gibi soğuk PBS ile embriyolar üç kez yıkayın. Batarlarsa kadar 4 ° C de PBS çözeltisi içinde% 30 sakroz içine embriyo transferinealt.
2. Donma
- Dondurma işlemine başlamadan önce gerekli tüm malzemeleri düzenleyin: cryo-kalıp, cryo-eldivenler, tüy entomolojisi forseps, işaretleyici kalem ve optimal kesim sıcaklığının bileşik (Ekim)
- Kalıcı alkole dirençli işaretleyici ile cryo-kalıp Etiket (doku, tarih ve genotip yönünü söz). Bir buz kovası ezilmiş kuru buz ve% 100 etanol içinde bir çamuru hazırlanır. Izopentanın içeren iç cam beher yerleştirin. İzopentan soğuması için 10 dakika bekleyin.
- Bu arada, sukroz çözeltisi doku kaldırmak laboratuvar mendil kullanarak doku çevresinde aşırı sukroz silin. Doku karşılamak için yeterli Ekim ile önceden etiketlenmiş cryo-kalıba doku aktarın. Ekim herhangi bir hava kabarcıkları kaçının; Özellikle doku etrafında.
- Doku hasarı önlemek için tüy entomoloji forseps kullanarak Ekim doku yönlendirin. Cryo-mol aktararak dondurma başlayınönceden soğutulmuş izopentan banyosuna ö. Düzgün donma olmaz gibi OCT içine izopentanın sıçrama yok. -80 ° C de, alüminyum folyo ve mağaza örnekleri sarın.
3. Cryosectioning
- Bir sirostat kullanılarak beş serisi '14 mikron ince seri bölümleri kesin ve immünofloresan (IF) analizi için Superfrost® Plus cam slaytlar üzerinde toplamak. Kullanılan kadar -80 ° C 'de slaytlar saklayın.
Tyramide Sinyal Amplifikasyon (TSA) Protokolü kullanma 4. Tracer görselleştirme
- Boyama için gerekli olan tamponlar ve reaktifler hazırlayın. Her zaman taze kullanım gününde Tris-NaCI-Tween (TNT) tamponu hazırlayın.
- 1 L'lik bir son hacme kadar 1 ml pipet kullanarak Tween 20 500 ul ekle, 1 M Tris-HCl, pH 7.5, 5 mM NaCl, 30 ml ve GKD 2 O 100 ml ile TNT tamponu hazırlayın. Yavaş yavaş Tween 20 ekleyin ve tüm Tween 20 olmasını sağlamak için yukarı ve aşağı birkaç kez pipet floşÇözelti.
- Tris-NaCI-Blokaj kadar 1 L'lik bir son hacme pH 7.5, 5 mM NaCl, 30 ml ve GKD 2 O, 1 M Tris-HCl, 100 ml kullanılarak (TNB), tampon Engelleme Reaktif 5 g ekleyin hazırlanması ile (Resim yavaş yavaş tampon küçük artışlarla kiti) karıştırılırken. (Bu, 30-60 dakika daha uzun zaman almak gerekir) tamamen bloke edici tepkin madde çözünmesi için sürekli karıştırılarak 55 ° C'ye yavaş yavaş solüsyon ısıtın. Homojen ısıtma 55 ° C'de su banyosu kullanın ulaşmak için. çözüm sütlü görünecektir. Kullanmadan önce oda sıcaklığına getirin çözüm. Uzun süreli depolama için -20 ° C'de kısım saklayın.
- Moleküler Biyolojisi / HPLC-grade DMSO (takımla birlikte verilmektedir), biyotin tiramid reaktifi sulandırın. Bunun üzerine bağlı olarak kit, DMSO uygun miktarı değişebilir kullanılır. 4 ° C 'de stok solüsyonu saklayın.
NOT: İlgili Cre ve R26 allelleri için heterozigot hayvanlardan Bölümler devre analizi için kullanılabilir. Kullanım sveriliş negatif kontrol olarak sırasıyla bir Cre veya bir R26 alel, taşıma littermates. Tam çift heterozigot hayvanlardan slaytlar gibi negatif kontrol slaytlar davranın. Buna ek olarak, bir çift heterozigot hayvandan bir kontrol slayt bunlarla TSA ayıracı (Yükseltilmemiş kontrol) dışarıda bırakın.
- Keskin bir neşter taze doku bölümleri çevreleyen aşırı Ekim kaldırmak ve bir PAP kalemle bölümler etrafında sınır işareti kullanma.
- Oda sıcaklığında 2-3 dakika boyunca (RT) slaytlar kurutun. 5 dakika her TNT RT 3x slaytlar yıkayın. Endojen peroksidaz aktivitesi söndürmek için% 0.3 30 dakika boyunca buz soğukluğunda metanol içinde H2O 2 solüsyonu oda sıcaklığında slaytlar inkübe edin.
- 5 dakika boyunca PBS ile yıkayın 3x oda sıcaklığında her biri. Doku geçirgenliği için PBS içinde% 0.5 Triton-X 100, 10 dakika boyunca inkübe edin. 5 dakika her TNT RT 3x slaytlar yıkayın.
- TNB ile Blok 30 için (slayt başına 200-300 ul engelleme çözümü)nemli bir oda içinde oda sıcaklığında Min. Tüm bölümleri tamamen TNB tarafından karşılanmaktadır emin olun. Slaytlar adımlar arasında kurumasına izin vermeyin.
- Fazla engelleme tamponu süzün ve izleyici kabul primer antiserumun uygulamak oda sıcaklığında ya da gece boyunca 4 ° C 'de 2 saat TNB içinde seyreltildi (1: GTT 15.000 tavşan anti-GFP: BL 1000 keçi anti-WGA, 1). Tamamen doku bölümü (slayt başına 200-300 ul) karşılamak için yeterli hacim kullandığınızdan emin olun.
NOT: Burada önerilen primer antiserumlar dilüsyonları ayarlanması gerekebilir. - 5 dakika ajitasyon ile her TNT RT 3x slaytlar yıkayın.
- (: Anti-WGA 500 at anti-keçi IgG'si, 1: oda sıcaklığında 1 saat TNB içinde, anti-GFP için 5000 keçi anti-tavşan IgG 1), ilk antiserum ana tanıyan biyotinlenmiş sekonder antiserumu ile bölümleri inkübe edin.
- 5 dakika çalkalanarak her biri için oda sıcaklığında, TNT ile yıkayın 3x. 100 streptavidin (SA) ile birleştirilmiş bayır yaban turpu peroksidaz (SA-HRP, Resim wi: 1 inkübenemli bir oda içinde oda sıcaklığında 30 dakika için TNB içinde kiti) th. 5 dakika her TNT RT 3x slaytlar yıkayın. Bu arada TSA eritin.
- (Kit ile sağlanan, BL görselleştirme ve GTT için TSA + kiti için TSA kiti kullanın) TSA amplifikasyon seyreltici içinde TSA 01:50 seyreltin. Oda sıcaklığında tam olarak 10 dakika için seyreltilmiş TSA doku bölümleri inkübe edin. Gelecek deneyler için kalan seyreltilmiş TSA reaktifi kullanmayın, ideal bir önceki yıkama aşamasında, kullanımdan hemen önce TSA Seyreltik; her zaman taze hazırlayın.
- 5 dakika ajitasyon ile her TNT RT 3x slaytlar yıkayın. Oda sıcaklığında 30 dakika için TNB içinde 500 Alexa Fluor® 546 streptavidin: 1 ile inkübe edin. 5 dakika ajitasyon ile her TNT RT 3x slaytlar yıkayın.
- Nükleer boyama için oda sıcaklığında PBS içinde% 5 bisbenzimid çözelti içinde 10 dakika süreyle inkübe edin. 5 dakika ajitasyon ile her TNT RT 3x slaytlar yıkayın. Fluromount G ile monte ve Epifloresans veya konfokal mikroskopi gerçekleştirin.
Embriyonik Bölüm 5. τlacZ Boyama
- Boyama için gerekli olan tamponlar ve reaktifler hazırlayın. Her zaman taze Kullanmadan önce LacZ tampon C hazırlamak.
- 1 mi% 70 dimetilformamit (DMF), X-gal 40 gramı ekleyerek, 5-bromo-4-kloro-3-indolil-β-D-galaktopiranosid (X-gal) stok çözeltisi (40 mg / ml) hazırlayın. Uzun süreli depolama için -20 ° C'de alüminyum folyo ve mağaza ile kaplayın.
- Hazırlayın nitro mavi tetrazolyum (NBT) st1 mi% 70 DMF NBT 50 gramı ekleyerek ock çözeltisi (50 mg / ml). Uzun süreli depolama için -20 ° C'de alüminyum folyo ve mağaza ile kaplayın.
- LacZ% 25 glutaraldehid 80 ul,% 4 5 ml PFA, 1 M 20 ul kullanılarak MgCI2, 500 mM EGTA, 100 ul bir son 1, 1 M fosfat tampon maddesi pH 7.4 içinde çözdürülür ve GKD 2 O kadar tespit maddesi hazırlanması 10 ml hacmi.
- LacZ 500 mM EGTA, 5 ml, 500 ml'lik bir nihai hacme kadar 50 mi ile kombine edilmiştir fosfat tamponu, pH 7.4 ve 1 M, 2, O, MgCl2 1 M A izlenerek ve 1 ml tampon hazırlayın.
- 1 mi 1 M MgCI2, 500 mM EGTA, 5 ml, 5 mi% 1 sodyum deoksikolat,% 10 NP-40, 100 mi, 50 1 M fosfat tampon maddesi pH 7.4 içinde çözdürülür ve GKD 2 O kullanılarak LacZ tampon B hazırlanması 500 ml'lik bir nihai hacme kadar.
- NBT stok çözeltisi 10 ul ve LacZ tampon B, 1 ml X-gal stok çözeltisi 12.5 ul kullanımdan hemen önce taze sağlayın ve alüminyum folyo ile kapak ekleyerek LacZ tampon C hazırlayın.
- (Bu arada, bir PAB kalem ile preparatların hazırlanması), en az 10-15 dakika boyunca oda sıcaklığında slaytlar kurutun.
- LacZ ile bölüm kimyasal buhar-başlığın içinde, nemlendirilmiş bir odacıkta, oda sıcaklığında 2 dakika boyunca tespit maddesi düzeltildi. 3 kez PBS ile yıkayın, 2 mM MgCl2 ile desteklenmesiydi.
- LacZ slaytlar oda sıcaklığında 10 dakika her biri için bir 3 kez yıkama tamponu LacZ tampon A ile slaytlar durulayın. 5 dakika her LacZ tampon B ile 2 kez yıkayın. Nemli bir oda içinde 6 saat veya gece boyunca 30-37 ° C'de LacZ tampon C slaytlar inkübe edin.
NOT: LacZ tampon C yeterli hacmi ekleyin; slaytlar inkübasyon sırasında kurumasına olmamalıdır. - Uygun bir inkübasyon süresinden sonra, PBS ile kayar, 2 mM MgCl2 ile desteklenmesiydi yıkayın. Kısaca GKD 2 O. ile bölümleri durulayın Mayer'in glisin jelatin ile lamel. Bir diferansiyel girişim kontrast (DIC) görüntüleme set-up ile donatılmış bir ışık mikroskobu için uygundur.
6. Gender ve Tracer Genotipleme
- 1 M Tris-HCl, pH 8.5, 500 mM EGTA, 100 ul 1 ml'si kullanılarak kuyruk liziz tamponu,% 10 SDS, 200 ul 5 M NaCl ve GKD 2 O 400 ul, 10 ml lik bir son hacim yapmak için.
- Bir kuyruk biyopsi içeren her Eppendorf tüpüne kuyruk lizis tamponu 500 ul ekleyin. 100 mg / ml 'lik bir nihai konsantrasyona kadar proteinaz K ilave. 55 ° C'de bir çalkalayıcı üzerinde gece boyunca inkübe edin.
- Oda sıcaklığında 10 dakika için 17,000 x g'de santrifüjleyin örnekleri. Yeni bir santrifüj tüpüne süpernatant aktarın. Yüzer izopropanol 500 ul ekle. Yukarı ve aşağı tüpler ters çevrilerek en az 5 dakika boyunca karıştırın.
- Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 17,000 x g'de santrifüj dönerler. Süpernatantı dökün. % 70 etanol içinde 200 ul ekle. En az 5 dakika boyunca çalkalanır.
- 5 dakika için 17,000 x g'de santrifüjleyin. Bir Pipetman (kapalı dökmek değil) ile süpernatantı. 15-30 dakika boyunca bir sıcak oda (37 ° C) pelet kurutun.
- 100 ul süspanse peletgeniş çaplı süzülmüş ipuçlarını kullanarak düşük TE pH 8.0 ya da su. Uygun erimesi için gece boyunca ° C'de 1 saat boyunca ve 37 ° C'de 55 ° C olarak koyun. 4 ° C'de saklayın.
- PCR reaksiyonu (kuyruk DNA'sının 1 ul, her bir primerden 2.5 ul DMSO, 10:00, 25 her dNTP uM ve 1 M betain ihtiva eden 50 ul reaksiyon karışımı) için DNA 1 ul kullanın. Genotipleme ve cinsiyet tespiti için PCR primerleri malzemeleri tabloda listelenmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu bölümde R26-BIZ (B L I RES-τlac Z) ve R26-GTT (G FP- TT C) allelleri ile çalışma elde edilebilir temsilcisi sonuçları gösterir. Burada üreme ekseni düzenleyen nöral devrelerin olgunlaşmasını analiz R26-R26-BIZ ve GTT allellerini kullanın. Omurgalılarda üreme merkezi gonadotropin salgılatıcı hormon (GnRH), hipotalamus salgılayan nöronların, küçük bir alt grubu ile kontrol edilir. Kisspeptin GnRH nöron için güçlü bir aktivatör, GnRH ve Kisspeptin nöronlar arasındaki sinirsel devreleri 5 bilinmiyordu gelişen dişi fare beyin kurulmuştur ancak ne zaman GnRH nöron aktivitesinin düzenlenmesinde implike edilmiştir. Önce dünyası ve GTT transgenlerin sentezlenmesi özellikle embriyonik Cre bağımlı rekombinasyon ile aktive olduğunu göstermiştirBir Kisspeptin özgü Cre sürücüsü satır 10 ile kavisli bir çekirdeğe (ARC) (Şekil 2) Kisspeptin nöronlar. Sonra zaten ARC bu Kisspeptin nöronlar göstermek rahimde GnRH nöronları belirli bir alt kümesi (Şekil 3A, B) ile iletişim. Ayrıca, ARC Kisspeptin nöronlar GnRH nöronları (Şekil 3A, C) üst baş olduğunu göstermektedir. Alınan birlikte bizim bulgular Kisspeptin ve GnRH nöronları arasındaki sinirsel devreler tam olarak kurulan ve dişi fare beyninde ameliyat doğumdan önce olduğunu göstermektedir.
Şekil 1:., Geleneksel ya da genetik yaklaşımlar kullanılarak izleyici transsinaptik transferi geleneksel bir yaklaşım olarak, bir transsinaptik iz böylece potansiyel olarak spesifik olmayan olmayan yollar etiketleme enjeksiyon yerinde tüm nöronlar tarafından alınır. Içindegenetik yaklaşım, izleyici seçici böylece özel tracer-salgılayan hücrelerin bağlı nöronlar görselleştirmek genetik olarak tanımlanmış nöronlar tarafından ifade edilmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: embriyonik ARC Kisspeptin nöronlarda BIZ ve GTT transgen Sadık aktivasyonu. (A) Damızlık stratejisi Kisspeptin nöronlarda BIZ ve GTT ifadesini etkinleştirmek için. Bu Kre-rekombinaz Kiss1 promotörünün kontrolü altında eksprese edildiği Kisspeptin-IRES-Cre (KissIC) fareler 10 ile R26-dünyası ve R26-GTT fareler yetiştirilen. (CE) β-gal enzimatik aktivitesi tanımlayan izleyici üreten Hücreler ve bir dişi KissIC / R beyninde ARC sınırlandırılmıştırEmbriyonik gün (E) 18.5. (FG) Kisspeptin (yeşil) için çift immünfloresans ve BL (kırmızı) (F) veya GTT (kırmızı) (G) 26-BIZ embriyo Cre-aracılı ile BL veya GTT ifade sadık aktivasyonunu gösterir sırasıyla, KissIC / R26-BIZ veya KissIC / R26-GTT dişi fare embriyoları nöronları Kisspeptin rekombinasyon. Ölçek çubukları (C) 500 mikron, (D) 200 mm, (F, G) 50 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: GnRH nöronlar sinaptik bağlı ve nöronlar Kisspeptin mansap olan. (A) Combinatorial genetik çift yönlü transsinaptik izleme. Τla dacZ Cre ifade Kisspeptin nöronlar sınırlıdır BL transsynaptically (presinaptik) akışyukarısına aktarılır ve KissIC / R26-BIZ farelerde alt baş (postsinaptik) nöronları. Bunun tersine GFP-TTC transsynaptically KissIC / R26-GTT farelerde presinaptik ama postsinaptik olmayan nöron aktarılır. Postsinaptik nöronlar kendi yakın çevresinde τlacZ-pozitif akson lifleri var (B, C) BL (kırmızı B) Çift immunofloresan., Bir kadın bütün kafa ile bir sagital bölümünde ve GnRH (yeşil) veya GTT (C kırmızı) KissIC / R26-BIZ veya E18.5 de KissIC / R26-GTT embriyo. (B) bazı Not, ancak tüm GnRH nöronları BL içerirler. Bu veriler, embriyonik GnRH nöronları bir alt sinaptik Kisspeptin nöronlar ARC bağlı olduğunu göstermektedir. (C), GnRH nöronların yok GTT içerdiğine dikkat ediniz. GnRH nöronlara BL değil GTT Exclusive transsinaptik transferi olduğunu GnRH nöronları gösterirKisspeptin nöronların alt baş bulunmaktadır. Ölçek çubukları (B, C) 50 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| Özellikler | Transsinaptik izleyiciler | Nörotopik virüslerdir |
| Uygulamanın Mod | , Bir transgen olarak ifade | Mekanik enjekte |
| Yayılma yönü | İleriye, geriye ve iki yönlü | Retrograd & anterograd |
| Sinaptik etkinliği | Olan çoklu | Olan çoklu veya monosinaptik (sadece retrograd) |
| Sinyal gücü | Zayıf, her sinaps azalır | Her sinaps güçlü sinyal amplifikasyon |
| Bağışıklık yanıtı | Yok; endojen protein olarak ifade edilen | Güçlü bir bağışıklık tepkisi öldürücü |
| Mekansal ve zamansal çözünürlük | Tercih edilen bir promotere bağlıdır | Nedeniyle tek tek siteler mekanik enjeksiyonları son derece seçici |
Tablo 1: Genetik transsinaptik izleyicilerin özelliklerinin karşılaştırılması ve genetiği değiştirilmiş virüsler nörotrop
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Genetik olarak tanımlanmış sinirsel nöral devreleri iz transgenler olarak transsinaptik izleyiciler ifade ajanları veya neurotopic virüs stereotaksik enjeksiyonu ile karşılaştırıldığında bir çok avantaja sahiptir. İlk olarak, izleyici, bir endojen protein olarak üretilir ve bu nedenle herhangi bir bağışıklık karşılığını ortaya etmez ve seçici bir sinir yolu yüksek ölçüde tekrarlanabilirliği farklı hayvanlarda analiz edilebilir. Bu bir non-invaziv bir yöntemdir, çünkü İkincisi, bu utero örneğin, sterotaksik enjeksiyonlar için kolayca erişilebilir değil nöronlardan gelen devreleri izlemek için kullanılabilir. Sınırlamalar izleyici tespit zorluklara neden olabilir transsinaptik transferi genellikle düşük bir etkisi bulunmaktadır. Ayrıca, izleyici molekülü her sinaps seyreltilmiş alır. Bunun aksine, nörotropik virüs çoğaltma ve sırayla, viral replikasyon sonra sinaps geçtikten sonra amplifikasyonlarını yol açar. Ancak, viral replikasyonu da önemli bir limitat olanintrensek virüs sitotoksisiteye nörotropik virüslerin kullanımı iyon. Genetik transsinaptik ajanları ve genetik olarak tadil edilmiş nörotropik virüsler bazı özellikleri Tablo 1 'de karşılaştırılmıştır.
R26-R26-BIZ ve GTT alleller birbirini tamamlar ve Kre-aracılı rekombinasyon üzerine genetik tespit nöronal nüfusun nöral devrelerin görselleştirme kolaylaştırmak. R 26 promotör iyi karakterize olan ve mütevazı gücü 11,12 ile her yerde ifade aracılık. Böyle tiramid sinyal amplifikasyonu olarak izleyici tespiti için son derece hassas yöntemler kullanılarak (TSA) sistemi sinaps boyunca aktarılan izleyici moleküllerinin dahi dakika miktarda belirlenmesini sağlar. İzleyici sentezlenmesini tahrik etmek için, R26 promoteri kullanılarak bir diğer önemli avantajı, ifade nöronların sürekli olarak ömrü boyunca izleyiciler sentez olmasıdır. Bu devre olgunlaşmasını analiz mümkün kılarUzun zaman periyotlarının 5 için. Bunların sitotoksisitesi nedeniyle nörotropik virüslerin kullanıldığı Bunun tersine, bu mümkün değildir. Önemli bir şekilde, ikilik genetik sistemi ve R26 bir habercinin kullanılması, genetik ve epigenetik 13 çeşitli faktörlere göre düzenlenmiş olabilir, Cre ifadesini süren potansiyel ağır düzenlenmiş endojen promotörler (bu durumda, Kiss1 promoteri) gelen izleme üretimi koparan. BL ve GTT dolayısıyla transsinaptik transferi iki nöron popülasyonları arasındaki gerçek sinaptik iletişimi yansıtır.
Kre-aracılı rekombinasyon geri dönüşü olmayan bir olaydır ve bu nedenle kararlı bir transgen ekspresyonu içine gelişimsel olarak, geçici gen ekspresyonunu dönüştürür. Bir uyarılabilir Cre sisteminin 14 kullanımı potansiyel nedeniyle geçici Cre ifadesi bir gelişimsel etkisi maskeleyebilir.
Sonuç olarak, iki yeni R26-dünyası ve R26-GTT fare soyları, yerel ve lo analiz etmek için kullanılabilirfarklı sınıflarının herhangi bir beyin bölgesinden ya da bir Kre-bağımlı bir şekilde, omurilik kökenli nöron türlerinden oluşan olabilir ng aralığı sinir devreleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bisbenzimide (Hoechst 33258 dye) | Sigma | 14530-100MG | |
| Ethanol | Sigma | 32205-1L | |
| Cryo mold (Peel-a-way) | Polyscience Inc. | 18646A-1 | 22 x 22 x 20mm |
| DMSO | Sigma | D8418-100ML | |
| Dimethyl Formamide (DMF) | VWR Chemicals | 23470,293 | |
| EGTA | ROTH | 3054.3 | |
| Fluoromount G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | G5882-50ML | |
| Hydrogen peroxide | Sigma | 34988-7 | |
| Isopentane (Methyl 2-butane) | Sigma | M32631-2.5L | |
| Kaiser's glycine gelatin | Merck | 1092420100 | |
| Methanol | Sigma | 494437-1L | |
| MgCl2 | Sigma | M2670-100G | |
| NaCl | ROTH | HN00.2 | |
| NBT | Sigma | 298-83-9 | |
| Nonidet P40 substitute | Fluka | 743.85 | |
| OCT | Leica | 14020108926 | |
| PAP pen | Dako | S2002 | |
| Parafarmaldehyde | Sigma | P6148-1KG | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D6750-25G | |
| Sucrose | Sigma | S7903-1KG | |
| Superfrost slides | Thermo Scientific | FT4981GLPLUS | |
| TSA kit | PerkinElmer | NEL700 | |
| TSA plus kit | PerkinElmer | NEL749A001KT | |
| Tris | ROTH | AE15.2 | |
| Triton-X 100 | ROTH | 3051.2 | |
| Tween 20 | ROTH | 9127.1 | |
| X-gal | ROTH | 2315.1 | |
| Cryostat | Leica | na | |
| Light microscope equipped with DIC imaging | Zeiss | Axioskop2 equipped with Axio Vision software | |
| Fluroscence microscope | Zeiss | Axioskop2 equipped with Axio Vision software | |
| Photoshop | Adobe | PS6 | |
| Goat anti-WGA (recognizes BL) | Vector Laboatories | AS-2024 | |
| Biotinylayted horse anti-goat IgG | Vector Laboatories | BA-9500 | |
| Biotinylated goat anti-rabbit IgG | Vector Laboatories | BA-1000 | |
| Rabbit anti-GFP (recognizes GTT) | Invitrogen | A11122 | |
| Rabbit anti-GnRH | Affinity Bio Reagent | PA1-121 | |
| Dylight488-donkey anti-rabbit IgG | Thermo Scientific | SA5-10038 | |
| SA-Alexa Fluor 546 | Life Technologies | S-11225 | |
| Primers | |||
| BL Fwd (for BIZ genotyping) | Eurofins MWG Operon | ATGAAGATGATGAGCACCAGGGC | |
| BL Rev (for BIZ genotyping) | Eurofins MWG Operon | AGCCCTCGCCGCAGAACTC | |
| Cre Fwd (for Cre genotyping) | Eurofins MWG Operon | GTCGATGCAACGAGTGATGAGGTTCG | |
| Cre Rev (for Cre genotyping) | Eurofins MWG Operon | CCAGGCTAAGTGCCTTCTCTACACCTGC | |
| TTC Fwd (for GTT genotyping) | Eurofins MWG Operon | AGCAAGGGCGAGGAGCTGTT | |
| TTC Rev (for GTT genotyping) | Eurofins MWG Operon | GTCTTGTAGTTGCCGTCGTCCTTGAA | |
| XY Fwd (for gender genotyping) | Eurofins MWG Operon | TGAAGCTTTTGGCTTTGA | |
| XY Rev (for gender genotyping) | Eurofins MWG Operon | CCGCTGCCAAATTCTTTG | |
| ROSA26 Fwd | Eurofins MWG Operon | CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC | |
| ROSA26 Rev | Eurofins MWG Operon | GCAGATGGAGCGGGAGAAAT | |
| SA Rev | Eurofins MWG Operon | CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC | |
References
- Vercelli, A., Repici, M., Garbossa, D., Grimaldi, A. Recent techniques for tracing pathways in the central nervous system of developing and adult mammals. Brain. Res. Bull. 51, 11-28 (2000).
- Huang, Z. J., Zeng, H. Genetic approaches to neural circuits in the mouse. Annu. Rev. Neurosci. 36, 183-215 (2013).
- Lanciego, J. L., Wouterlood, F. G. A half century of experimental neuroanatomical tracing. J. Chem. Neuroanat. 42, 157-183 (2011).
- DeFalco, J., et al. Virus-assisted mapping of neural inputs to a feeding center in the hypothalamus. Science. 291, 2608-2613 (2001).
- Kumar, D., et al. Murine arcuate nucleus kisspeptin neurons communicate with GnRH neurons in utero. J. Neurosci. 34, 3756-3766 (2014).
- Horowitz, L. F., Montmayeur, J. P., Echelard, Y., Buck, L. B. A genetic approach to trace neural circuits. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 3194-3199 (1999).
- Maskos, U., Kissa, K., ST Cloment, C., Brulet, P. Retrograde trans-synaptic transfer of green fluorescent protein allows the genetic mapping of neuronal circuits in transgenic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 10120-10125 (2002).
- De Roux, N., et al. Hypogonadotropic hypogonadism due to loss of function of the KiSS1-derived peptide receptor GPR54. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 10972-10976 (2003).
- Seminara, S. B., et al. The GPR54 gene as a regulator of puberty. N. Engl. J. Med. 349, 1614-1627 (2003).
- Mayer, C., et al. Timing and completion of puberty in female mice depend on estrogen receptor alpha-signaling in kisspeptin neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 22693-22698 (2010).
- Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nat. Genet. 21, 70-71 (1999).
- Seibler, J., et al. Single copy shRNA configuration for ubiquitous gene knockdown in mice. Nucleic Acids Res. 33, e67 (2005).
- Semaan, S. J., Kauffman, A. S. Emerging concepts on the epigenetic and transcriptional regulation of the Kiss1 gene. Int. J. Dev. Neurosci. 31, 452-462 (2013).
- Feil, R., et al. Ligand-activated site-specific recombination in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 10887-10890 (1996).
