Introduction
Anatomisk bana spårning är en av de mest vanligen använda verktyg för att dechiffrera förhållandet mellan hjärnan och beteende 1. Avancemang inom neurala krets spåra teknik har skänkt neuroforskare med förmågan att spåra nervbanor från genetiskt identifierade neuron populationer i möss 2. Trots dessa tekniska framsteg det förblir utmanande att riva upp bildandet av neurala kretsar särskilt under embryonala mognad. Detta beror på att de flesta av de spårnings metoder som utvecklats hittills är baserade på stereotaxisk injektion av transsynaptisk spårämnen eller genetiskt modifierade neurotropa virus (Figur 1) 2,3. Även om dessa tekniker uppnår rumslig och tidsmässig upplösning av anslutningsmöjligheter, flera inneboende begränsningar såsom tekniskt utmanande spår injektioner i den växande hjärnan, reproducerbarhet injektions, potentiella inflammation vid injektionsstället och mest viktantly cytotoxicitet orsakad av neurotropa virus begränsa deras användning 4.
En alternativ metod är att uttrycka de transsynaptisk spårämnen som transgener i genetiskt förändrade möss. Vi har nyligen ändrat denna teknik och utvecklat en binär genetiskt transsynaptisk spåra system för att kartlägga de nervbanor i alla genetiskt identifierade neuronala befolkningen 5. Vår experimentella strategi bygger på två nya knock-in mus stammar, som uttrycker antingen den dubbelriktade tracer korn lektin (BL) 6 eller bakåtsträvande spårämne tetanustoxin fragment C smält till GFP (GTT) 7 från ROSA 26 locus efter Cre-medierad rekombination. Här har vi använt dessa musstammar att selektivt uttrycka BL och GTT i nervceller som producerar Kisspeptin, en neuropeptid som är inblandad i regleringen mognaden av reproduktiva axeln 8,9. Vi visar att denna teknik är lämplig för att visualisera utvecklingen och mognaden av kysspeptin neurala kretsar under fosterutvecklingen av den kvinnliga musen hjärnan 5.
Avelsstrategi
Den K26-BL-IRES-τlacZ (BIZ) och K26-GFP-TTC (GTT) spårlinjer är knock-i stammar 5 som bär rekombinanta ROSA26 alleler. Den R26-BIZ och R26-GTT alleler är transkriptionellt tyst på grund av närvaron av en stark transkriptionsstoppsignal, som flankeras av två loxP-ställen 5. Uttryck av BIZ och GTT transgen aktiveras av Cre-medierad avlägsnande av transkriptionsstoppsignalen. De K26-BIZ och R26-GTT alleler kan användas oberoende genom att helt enkelt korsa med en Cre förare linje. För analysdjur heterozygot för respektive Cre och R26 alleler kan användas. Kull bär en Cre eller en R26-allel, respektive, bör användas som kontroller. Alternativt är det också möjligt att alstra triple knock-in djur som bär på Cre, R26-BIZ och R26-GTT alleler, men detta kommer att kräva ytterligare en kors.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Etik uttalande: Rutiner som involverar djurförsök godkändes av djurskyddskommitté Hamburgs universitet och universitetet i Saarland.
1. Upprättande och Fixering av embryonal vävnad
- Ordna all utrustning som behövs för att dissekera ut embryona och förbereda lösningar för efterföljande fixering av vävnaden innan offra djuren.
OBS: Alltid förbereda en färsk 4% paraformaldehyd (PFA) lösning (4% PFA i 0,1 M fosfatbuffrad saltlösning (PBS), justera pH till 7,4). - Euthanize tt gravid kvinnlig mus med ett etiskt godkänd procedur.
- Överför musen på en plattform. Blöt den ventrala sidan av buken med 70% etanol och göra ett vertikalt snitt med vassa sax för att exponera bukhålan.
- Identifiera den embryonala kedjan och dra ut den försiktigt med hjälp av trubbig pincett och placera den i iskallt PBS.
- Ta bort de enskilda embryon frånden embryonala kedjan med fina sax och pincett. Ta bort extra vävnad runt embryona och tvätta dem i iskallt PBS.
- Ta en liten svans biopsi (innan du överför embryot till PFA) och inkubera den i svansen lyseringsbuffert för identifiering kön och tracer allel genotypning PCR.
- Börja från embryot vid den mest laterala sidan och överföra varje embryo separat i ett rör innehållande iskall 4% PFA på is på en skakapparat.
- Blöt embryon vid en ålder av E13.5 eller yngre i 1,5 h på is med konstant skakning. Blöt embryon vid ålders E14.5 och E15.5 i 2,5 h på is med konstant skakning.
- För embryon ålder E16.5 eller äldre, halshugga och ta bort det yttre huden innan blötläggning huvudet i PFA-lösning. Chefer E16.5 embryon kan läggas i blöt för 4,5 tim på is med konstant skakning.
- Efter lämplig fixering, tvätta embryona tre gånger med iskall PBS. Överför embryon i 30% sukros i PBS-lösning vid 4 ° C tills de sjunkertill botten.
2. Frysning
- Ordna alla material som krävs innan frysprocessen: Cryo-mögel, Cryo-handskar, fjäderlätt entomologi pincett, märkpenna och optimal skärtemperatur förening (OCT)
- Märk kryo-formen med en permanent alkoholbeständigt markör (nämner orienteringen av vävnad, datum och genotyp). Förbered en slask av krossad torris och 100% etanol i en ishink. Placera en glasbägare inne innehåller isopentan. Vänta 10 min för isopentan svalna.
- Samtidigt bort vävnad från sackaroslösningen, torka av överflödig sackaros runt vävnad med hjälp av laboratorie våtservetter. Överför vävnaden till en i förväg märkt Cryo-formen med tillräcklig oktober för att täcka vävnaden. Undvik eventuella luftbubblor i ULT; speciellt runt vävnaden.
- Orientera vävnaden i OCT använder fjäderlätta entomologi pincett för att undvika vävnadsskada. Börja frysning genom att överföra Cryo-mold in i den nedkylda isopentan bad. Stänk inte isopentan i ULT eftersom det inte kommer att frysa ordentligt. Linda proverna i aluminiumfolie och förvara vid -80 ° C.
3. cryosectioning
- Skär 14 nm tunna seriella sektioner i serie "av fem med hjälp av en kryostat och samla på SuperFrost® Plus glas för immunofluorescens (IF) analys. Förvara objektglasen vid -80 ° C tills de användes.
4. Tracer visualisering Använda tyramide Signal Amplification (TSA) Protokoll
- Förbered buffertar och reagens som krävs för färgning. Alltid fräscha förbereda Tris-NaCl-Tween (TNT) buffert på användningsdagen.
- Bered TNT buffert med användning av 100 ml 1 M Tris-HCl pH 7,5, 30 ml av 5 M NaCl och DDH 2 O upp till en slutlig volym på 1 L. Lägg 500 | il Tween 20 med användning av en 1 ml pipett. Lägg Tween 20 långsamt och spola pipetten upp och ned flera gånger för att säkerställa att all Tween 20 är ilösning.
- Förbered Tris-NaCl-Blocking (TNB) buffert med användning av 100 ml av en M Tris-HCl, pH 7,5, 30 ml av 5 M NaCl och DDH 2 O upp till en slutlig volym på 1 L. Lägg 5 g Blocking Reagent (försedd med kit) långsamt i små steg till bufferten under omrörning. Värm lösningen gradvis till 55 ° C under kontinuerlig omröring för att fullständigt lösa blockeringsreagens (detta bör inte ta längre tid än 30-60 min). För att uppnå homogen uppvärmning använda ett vattenbad vid 55 ° C. Lösningen kommer att visas mjölkig. Koka upp lösningen till rumstemperatur innan du använder. Alikvotera och förvara vid -20 ° C för långtidsförvaring.
- Bered biotin tyramide reagens (medföljer kitet) i molekylärbiologi / HPLC-kvalitet DMSO. Beroende på vilken sats används den lämpliga mängden av DMSO kan variera. Förvara stamlösning vid 4 ° C.
OBS: Sektioner från djur heterozygota för respektive Cre och R26 alleler kan användas för kretsanalys. Använd stningar från kullsyskon som bär en Cre eller en R26 allel respektive som negativa kontroller. Behandla negativa kontrollglas precis som diabilder från dubbla heterozygota djur. Dessutom ingår en central bild från en dubbel heterozygot djur men utelämnar TSA reagens (oamplifierat kontroll).
- Använd en vass fräsch skalpell avlägsna överskott oktober omger vävnadssnitt och markerar gränsen runt sektionerna med en PAP penna.
- Torka objektglasen i 2-3 min vid rumstemperatur (RT). Tvätta bilderna vid RT 3x med TNT för 5 min vardera. Inkubera objektglasen vid RT i 30 min i 0,3% H2O 2-lösning i iskall metanol för att släcka endogen peroxidasaktivitet.
- Tvätta 3x med PBS under 5 min vardera vid RT. Inkubera under 10 min i 0,5% Triton-X 100 i PBS för vävnads permeabilization. Tvätta bilderna vid RT 3x med TNT för 5 min vardera.
- Block med TNB (blockerande lösningen, 200-300 l per bild) för 30min vid RT i en fuktad kammare. Se alla avsnitt är helt täckta av TNB. Låt inte bilderna torka ut mellan stegen.
- Tappa av överskott blockeringsbufferten och applicera den primära antiserumet erkänner tracer (1: 1000 av get-anti-WGA för BL, ett: 15000 kanin-anti-GFP för GTT) utspätt i TNB för 2 h vid RT eller över natten vid 4 ° C. Se till att använda tillräckligt med volym för att helt täcka vävnadssnittet (200-300 l per bild).
OBS: De primära sera späd rekommenderas här kan behöva justeras. - Tvätta bilderna vid RT 3x med TNT för 5 min vardera med omröring.
- Inkubera sektioner med biotinylerad sekundär antiserum som igenkänner den mottagande av den första antiserum (1: 500 häst-anti-get-IgG för anti-WGA, ett: 5000 get anti-kanin-IgG för anti-GFP i TNB under 1 h vid RT).
- Tvätta 3x med TNT vid RT under 5 min vardera med omröring. Inkubera i 1: 100 streptavidin (SA) -konjugerad pepparrotsperoxidas (SA-HRP, förutsatt with kitet) i TNB för 30 min vid RT i en fuktad kammare. Tvätta bilderna vid RT 3x med TNT för 5 min vardera. Samtidigt tina TSA.
- Späd TSA 1:50 i TSA-förstärkning spädningsmedel (medföljer kitet, använda TSA kit för visualisering av BL och TSA + kit för GTT). Inkubera vävnadssnitt i utspädd TSA för att exakt 10 min vid RT. Späd TSA strax före användning, helst under det föregående tvättsteget, använd inte någon kvar utspätt TSA reagens för framtida experiment; alltid förbereda färska.
- Tvätta bilderna vid RT 3x med TNT för 5 min vardera med omröring. Inkubera med en: 500 Alexa Fluor® 546 streptavidinkonjugat i TNB för 30 min vid RT. Tvätta bilderna vid RT 3x med TNT för 5 min vardera med omröring.
- Inkubera i 10 minuter i 5% bisbenzimide lösning i PBS vid RT under nukleär färgning. Tvätta bilderna vid RT 3x med TNT för 5 min vardera med omröring. Montera med Fluromount G och utföra epifluorescence eller konfokalmikroskopi.
5. τlacZ Färgning för Embryonala Sektioner
- Förbered buffertar och reagens som krävs för färgning. Alltid fräscha förbereda LacZ buffert C före användning.
- Bered 5-brom-4-klor-3-indolyl-β-D-galaktopyranosid (X-gal) förrådslösning (40 mg / ml) genom att tillsätta 40 g av X-gal till en ml 70% dimetylformamid (DMF). Täck med aluminiumfolie och förvara vid -20 ° C för långtidsförvaring.
- Förbered nitroblåttetrazolium (NBT) stOck-lösning (50 mg / ml) genom att tillsätta 50 g av NBT till en ml 70% DMF. Täck med aluminiumfolie och förvara vid -20 ° C för långtidsförvaring.
- Förbered LacZ fixativ att använda 80 pl 25% glutaraldehyd, 5 ml 4% PFA, 20 pl 1 M MgCl2, 100 ^ 500 mM EGTA, 1 ml av 1 M fosfatbuffert pH 7,4 och DDH 2 O upp till en slutlig volym av 10 ml.
- Förbered LacZ buffert A med 1 ml av 1 M MgCl2, 5 ml av 500 mM EGTA, 50 ml 1 M fosfatbuffert pH 7,4 och DDH 2 O upp till en slutlig volym av 500 ml.
- Bered LacZ buffert B med användning av 1 ml 1 M MgCl2, 5 ml av 500 mM EGTA, 5 ml 1% natriumdeoxikolat, 100 ml 10% NP-40, 50 ml 1 M fosfatbuffert pH 7,4 och DDH 2 O upp till en slutlig volym av 500 ml.
- Förbered LacZ buffert C genom att tillsätta 10 pl NBT stamlösning och 12,5 pl X-gal stamlösning till 1 ml LacZ buffert B. Gör färska strax före användning och täcker med aluminiumfolie.
- Torka glasen vid RT åtminstone i 10-15 min (tiden förbereda glasen med PAP penna).
- Fäst sektionen med LacZ fixativ under 2 minuter vid rumstemperatur i en fuktad kammare inuti en kemisk rök-huva. Tvätta tre gånger med PBS kompletterad med 2 mM MgCl2.
- Skölj objektglasen med LacZ buffert A. Tvätta bilderna med LacZ buffert A tre gånger under 10 min vardera vid RT. Tvätta två gånger med LacZ buffert B under 5 minuter vardera. Inkubera objektglasen i LacZ buffert C vid 30-37 ° C under 6 h eller över natten i en fuktig kammare.
OBS: Lägg tillräcklig volym av LacZ buffert C; diabilder bör inte torka ut under inkubation. - Efter lämplig inkubation tvätta glasen med PBS kompletterad med 2 mM MgCl2. Skölj avsnitt kortfattat med DDH 2 O. Täckglas med Mayers glycin gelatin. Lämplig för ett ljusmikroskop utrustad med en differential interferens kontrast (DIC) imaging set-up.
6. Gender och Tracer Genotypning
- Förbered svans lysbuffert med användning 1 ml av 1 M Tris-HCl pH 8,5, 100 ^ il 500 mM EGTA, 200 | il 10% SDS, 400 | il 5 M NaCl och DDH 2 O för att ge en slutlig volym av 10 ml.
- Lägg 500 pl av svans lysbuffert till varje Eppendorf-rör innehållande en svans biopsi. Lägg proteinas K till en slutlig koncentration av 100 mg / ml. Inkubera över natten på en skakanordning vid 55 ° C.
- Centrifugera proverna vid 17.000 xg under 10 min vid rumstemperatur. Överför supernatanten till ett nytt centrifugrör. Lägg 500 | il isopropanol till supernatanten. Blanda under minst 5 minuter genom att vända rören upp och ner.
- Spin i centrifugera vid 17.000 xg under 5 min vid RT. Häll av supernatanten. Lägg 200 pl av 70% etanol. Skaka under minst 5 minuter.
- Centrifugera vid 17000 xg under 5 minuter. Avlägsna supernatanten med en Pipetman (inte häll bort). Torka pelleten i en varm kammare (37 ° C) under 15 till 30 minuter.
- Resuspendera pelleten i 100 | illåg TE pH 8,0 eller vatten med hjälp av breda-bore filtrerade tips. Sätt i 55 ° C under 1 timme och vid 37 ° C över natten för korrekt upplösning. Förvaras vid 4 ° C.
- Använd 1 l av DNA för PCR-reaktion (50 pl reaktionsblandning innehållande en pl svans DNA, 2,5 pl DMSO, 10:00 av varje primer, 25 nm av varje dNTP, och 1M betain). PCR-primrar för genotypning och identifiering genus listas i tabellen Materials.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta avsnitt visar representativa resultat som kan erhållas arbeta med R26-BIZ (B L- I RES-τlac Z) och R26-GTT (G FP- TT C) alleler. Här använder vi R26-BIZ och R26-GTT alleler att analysera mognaden av de nervbanor som reglerar reproduktiva axeln. Kopiering ryggradsdjur styrs centralt av en liten delmängd av neuroner i hypotalamus, vilka utsöndrar gonadotropinfrisättande hormon (GnRH). Kisspeptin, en potent aktivator av GnRH nervceller, har varit inblandad i regleringen av aktiviteten av GnRH nervceller, men när de nervbanor mellan GnRH och Kisspeptin nervceller är etablerade i utvecklings kvinnliga musen hjärnan var inte känt 5. Först visar vi att uttrycket av BIZ och GTT transgener är specifikt aktiveras av Cre-beroende rekombination i embryonalaKisspeptin nervceller i den bågformade kärnan (ARC) (Figur 2) med hjälp av en Kisspeptin specifik Cre förare linje 10. Vi visar då att Kisspeptin neuroner i ARC redan kommunicerar med en särskild undergrupp av GnRH-neuroner i livmodern (figur 3A, B). Dessutom visar vi att ARC Kisspeptin nervceller är uppströms GnRH nervceller (Figur 3A, C). Sammantaget våra resultat tyder på att de nervbanor mellan Kisspeptin och GnRH nervceller är fullt etablerad och verksam i den kvinnliga musen hjärnan före födseln.
Figur 1:. Transsynaptisk överföring av spårämnen som använder konventionella eller genetiska metoder I det konventionella sättet, är en transsynaptisk tracer tas upp av alla nervceller vid injektionsstället därmed potentiellt märkning ospecifika obesläktade vägar. Iden genetiska tillvägagångssätt, är spårämnet selektivt uttrycks av genetiskt definierade nervceller därmed specifikt visualisera nervceller anslutna till spår-uttryckande celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Faithful aktivering av BIZ och GTT transgen i embryonala ARC Kisspeptin nervceller. (A) Avel strategi för att aktivera BIZ och GTT uttryck i Kisspeptin nervceller. Vi uppfödda K26-BIZ och R26-GTT-möss med Kisspeptin-IRES-Cre (KissIC) möss 10, där Cre-rekombinaset uttrycks under kontroll av den Kiss1 promotorn. (CE) β-gal-enzymatisk aktivitet identifierar spårämne-producerande celler och är begränsad till ARC i hjärnan hos en kvinnlig KissIC / R26-BIZ embryo på embryonala dag (E) 18.5. (FG) Dubbel immunofluorescens för Kisspeptin (grön) och BL (röd) (F) eller GTT (röd) (G) visar trogen aktivering av BL eller GTT uttryck av Cre-medierad rekombination i Kisspeptin nervceller i KissIC / R26-BIZ eller KissIC / R26-GTT embryon kvinnliga mus, respektive. Skala barer (C) 500 pm, (D) 200 nm, (F, G) 50 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: GnRH neuroner synaptiskt ansluten till och nedströms om Kisspeptin neuroner. (A) Kombinato genetiska dubbelriktad transsynaptisk spårning. Medan τlaCZ är begränsad till de Cre-uttryck Kisspeptin nervceller, är BL transsynaptically överförs till uppströms (presynaptiska) och nedströms (postsynaptiska) nervceller i KissIC / R26-BIZ möss. I motsats härtill är GFP-TTC transsynaptically överföras till presynaptiska, men inte postsynaptiska neuroner i KissIC / K26-GTT-möss. Postsynaptiska neuroner har τlacZ-positiva axon fibrerna under sin närhet (B, C) Dubbel immunofluorescens för BL (röd, B). Eller GTT (röd; C) och GnRH (grön) på en sagittal snitt genom hela huvudet av en kvinnlig KissIC / R26-BIZ eller KissIC / R26-GTT embryo vid E18.5. (B) Observera att vissa, men inte alla GnRH nervceller innehåller BL. Dessa data visar att en delmängd av embryonala GnRH nervceller är synaptically ansluten till ARC Kisspeptin nervceller. (C) Notera att ingen av de GnRH nervceller innehåller GTT. Exklusiv transsynaptisk överföring av BL men inte GTT till GnRH nervceller visar att GnRH nervcellerär nedströms Kisspeptin neuroner. Skala barer (B, C) 50 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Egenskaper | Transsynaptisk spårämnen | Neurotropa virus |
| ANVÄNDNINGSSÄTT | Uttryckt som en transgen | Mekaniskt injiceras |
| Riktning för spridning | Antero, retrograd & dubbelriktad | Retrograd & antero |
| Synaptiska effekten | Multisynaptic | Multisynaptic eller monosynaptic (endast retrograd) |
| Signalstyrka | Svag, minskar vid varje synaps | Stark, signalförstärkning vid varje synaps |
| Immunsvar | Ingen; uttryckt som endogent protein | Starkt immunsvar, dödliga |
| Rumslig och tidsmässig upplösning | Beror på promotor val | Mycket selektiva på grund av mekaniska injektioner vid enskilda platser |
Tabell 1: Jämförelse av funktioner i genetiska transsynaptisk spårämnen och genmodifierade neurotropa virus
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Att uttrycka transsynaptisk spårämnen som transgener för att spåra de nervbanor av genetiskt definierade neuronala populationer har flera fördelar jämfört med stereotaktisk injektion av spårämnen eller neurotopic virus. Först tracern produceras som ett endogent protein och därför inte framkallar någon immunrespons och en selektiv nervbana kan analyseras i olika djur med hög reproducerbarhet. För det andra, eftersom detta är en icke-invasiv metod kan användas för att spåra kretsarna från nervceller inte lättillgängliga för stereotaktiska injektioner, till exempel i livmodern. Begränsningar inkluderar en generellt låg effekt i transsynaptisk överföring, vilket kan resultera i svårigheter att upptäcka spår. Vidare blir den spårmolekyl utspäddes vid varje synaps. Däremot neurotropa virus replikera och virusreplikation i sin tur leder sedan till signalförstärkning efter att ha korsat synaps. Emellertid är virusreplikation också en stor limitation av användningen av neurotropa virus på grund av inneboende viral cytotoxicitet. Vissa funktioner i genetiska transsynaptisk spårämnen och genetiskt modifierade neurotropa virus jämförs i tabell 1.
De K26-BIZ och R26-GTT alleler kompletterar varandra och underlätta visualisering av neurala kretsar i en genetiskt identifierad neuronal population på Cre-medierad rekombination. R 26 promotorn är väl karakteriserade och förmedlar ubiquitous uttryck med blyg styrka 11,12. Med hjälp av mycket känsliga metoder för spårämne detektering såsom tyramide signalförstärkning (TSA) Systemet möjliggör identifiering av även små mängder av spårmolekyler som överförs mellan synapser. En annan stor fördel med att använda R26 promotorn för att driva tracer uttryck är att de uttrycker nervceller syntetisera kontinuerligt spårämnen under hela sitt liv. Detta gör det möjligt att analysera krets mognadunder längre tidsperioder 5. Däremot är det inte möjligt när man använder neurotropa virus på grund av deras cytotoxicitet. Viktigt vårt binära genetiska systemet och användningen av R26 promotorn kopplas tracer produktion från potentiellt kraftigt reglerade endogena promotorer som driver Cre uttryck (i det här fallet, den Kiss1 promotorn), vilka kan regleras av en mängd olika genetisk och epigenetisk faktorer 13. Därför transsynaptisk överföring av BL och GTT speglar faktiska synaptiska kommunikation mellan två neuronpopulationer.
Cre-medierad rekombination är en oåterkallelig händelse och därför omvandlar utvecklingsmässigt transient genuttryck i stabilt transgenuttryck. Användningen av ett inducerbart Cre-system 14 kan potentiellt demaskera en utvecklingseffekt på grund av övergående Cre uttryck.
Sammanfattningsvis kan de två nya R26-BIZ och R26-GTT musstammar användas för att analysera lokala och long range neurala kretsar som kan bestå av olika klasser och typer av nervceller ursprung från någon hjärnregion eller ens från ryggmärgen i en Cre-beroende sätt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bisbenzimide (Hoechst 33258 dye) | Sigma | 14530-100MG | |
| Ethanol | Sigma | 32205-1L | |
| Cryo mold (Peel-a-way) | Polyscience Inc. | 18646A-1 | 22 x 22 x 20mm |
| DMSO | Sigma | D8418-100ML | |
| Dimethyl Formamide (DMF) | VWR Chemicals | 23470,293 | |
| EGTA | ROTH | 3054.3 | |
| Fluoromount G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | G5882-50ML | |
| Hydrogen peroxide | Sigma | 34988-7 | |
| Isopentane (Methyl 2-butane) | Sigma | M32631-2.5L | |
| Kaiser's glycine gelatin | Merck | 1092420100 | |
| Methanol | Sigma | 494437-1L | |
| MgCl2 | Sigma | M2670-100G | |
| NaCl | ROTH | HN00.2 | |
| NBT | Sigma | 298-83-9 | |
| Nonidet P40 substitute | Fluka | 743.85 | |
| OCT | Leica | 14020108926 | |
| PAP pen | Dako | S2002 | |
| Parafarmaldehyde | Sigma | P6148-1KG | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D6750-25G | |
| Sucrose | Sigma | S7903-1KG | |
| Superfrost slides | Thermo Scientific | FT4981GLPLUS | |
| TSA kit | PerkinElmer | NEL700 | |
| TSA plus kit | PerkinElmer | NEL749A001KT | |
| Tris | ROTH | AE15.2 | |
| Triton-X 100 | ROTH | 3051.2 | |
| Tween 20 | ROTH | 9127.1 | |
| X-gal | ROTH | 2315.1 | |
| Cryostat | Leica | na | |
| Light microscope equipped with DIC imaging | Zeiss | Axioskop2 equipped with Axio Vision software | |
| Fluroscence microscope | Zeiss | Axioskop2 equipped with Axio Vision software | |
| Photoshop | Adobe | PS6 | |
| Goat anti-WGA (recognizes BL) | Vector Laboatories | AS-2024 | |
| Biotinylayted horse anti-goat IgG | Vector Laboatories | BA-9500 | |
| Biotinylated goat anti-rabbit IgG | Vector Laboatories | BA-1000 | |
| Rabbit anti-GFP (recognizes GTT) | Invitrogen | A11122 | |
| Rabbit anti-GnRH | Affinity Bio Reagent | PA1-121 | |
| Dylight488-donkey anti-rabbit IgG | Thermo Scientific | SA5-10038 | |
| SA-Alexa Fluor 546 | Life Technologies | S-11225 | |
| Primers | |||
| BL Fwd (for BIZ genotyping) | Eurofins MWG Operon | ATGAAGATGATGAGCACCAGGGC | |
| BL Rev (for BIZ genotyping) | Eurofins MWG Operon | AGCCCTCGCCGCAGAACTC | |
| Cre Fwd (for Cre genotyping) | Eurofins MWG Operon | GTCGATGCAACGAGTGATGAGGTTCG | |
| Cre Rev (for Cre genotyping) | Eurofins MWG Operon | CCAGGCTAAGTGCCTTCTCTACACCTGC | |
| TTC Fwd (for GTT genotyping) | Eurofins MWG Operon | AGCAAGGGCGAGGAGCTGTT | |
| TTC Rev (for GTT genotyping) | Eurofins MWG Operon | GTCTTGTAGTTGCCGTCGTCCTTGAA | |
| XY Fwd (for gender genotyping) | Eurofins MWG Operon | TGAAGCTTTTGGCTTTGA | |
| XY Rev (for gender genotyping) | Eurofins MWG Operon | CCGCTGCCAAATTCTTTG | |
| ROSA26 Fwd | Eurofins MWG Operon | CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC | |
| ROSA26 Rev | Eurofins MWG Operon | GCAGATGGAGCGGGAGAAAT | |
| SA Rev | Eurofins MWG Operon | CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC | |
References
- Vercelli, A., Repici, M., Garbossa, D., Grimaldi, A. Recent techniques for tracing pathways in the central nervous system of developing and adult mammals. Brain. Res. Bull. 51, 11-28 (2000).
- Huang, Z. J., Zeng, H. Genetic approaches to neural circuits in the mouse. Annu. Rev. Neurosci. 36, 183-215 (2013).
- Lanciego, J. L., Wouterlood, F. G. A half century of experimental neuroanatomical tracing. J. Chem. Neuroanat. 42, 157-183 (2011).
- DeFalco, J., et al. Virus-assisted mapping of neural inputs to a feeding center in the hypothalamus. Science. 291, 2608-2613 (2001).
- Kumar, D., et al. Murine arcuate nucleus kisspeptin neurons communicate with GnRH neurons in utero. J. Neurosci. 34, 3756-3766 (2014).
- Horowitz, L. F., Montmayeur, J. P., Echelard, Y., Buck, L. B. A genetic approach to trace neural circuits. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 3194-3199 (1999).
- Maskos, U., Kissa, K., ST Cloment, C., Brulet, P. Retrograde trans-synaptic transfer of green fluorescent protein allows the genetic mapping of neuronal circuits in transgenic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 10120-10125 (2002).
- De Roux, N., et al. Hypogonadotropic hypogonadism due to loss of function of the KiSS1-derived peptide receptor GPR54. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 10972-10976 (2003).
- Seminara, S. B., et al. The GPR54 gene as a regulator of puberty. N. Engl. J. Med. 349, 1614-1627 (2003).
- Mayer, C., et al. Timing and completion of puberty in female mice depend on estrogen receptor alpha-signaling in kisspeptin neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 22693-22698 (2010).
- Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nat. Genet. 21, 70-71 (1999).
- Seibler, J., et al. Single copy shRNA configuration for ubiquitous gene knockdown in mice. Nucleic Acids Res. 33, e67 (2005).
- Semaan, S. J., Kauffman, A. S. Emerging concepts on the epigenetic and transcriptional regulation of the Kiss1 gene. Int. J. Dev. Neurosci. 31, 452-462 (2013).
- Feil, R., et al. Ligand-activated site-specific recombination in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 10887-10890 (1996).
