We describe here a combination of the glass-supported lipid bilayer technique of forming immunological synapses with the super-resolution imaging technique of stimulated emission depletion (STED) microscopy. The goal of this protocol is to provide users with the instructions necessary to successfully carry out these two techniques.
The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has been in the study of immunological synapse formation, due to the ability of the glass-supported planar lipid bilayers to mimic the surface of a target cell while forming a horizontal interface. The recent advances in super-resolution imaging have further allowed scientists to better view the fine details of synapse structure. In this study, one of these advanced techniques, stimulated emission depletion (STED), is utilized to study the structure of natural killer (NK) cell synapses on the supported lipid bilayer. Provided herein is an easy-to-follow protocol detailing: how to prepare raw synthetic phospholipids for use in synthesizing glass-supported bilayers; how to determine how densely protein of a given concentration occupies the bilayer’s attachment sites; how to construct a supported lipid bilayer containing antibodies against NK cell activating receptor CD16; and finally, how to image human NK cells on this bilayer using STED super-resolution microscopy, with a focus on distribution of perforin positive lytic granules and filamentous actin at NK synapses. Thus, combining the glass-supported planar lipid bilayer system with STED technique, we demonstrate the feasibility and application of this combined technique, as well as intracellular structures at NK immunological synapse with super-resolution.
De immunologische synaps (IS) ligt op een cruciaal knooppunt voor cel activatie en functie 1. Het is de primaire middel waardoor antigeenpresentatie en celgemedieerde immuniteit worden uitgevoerd. De vroegste microscopische studies van synapsvorming gebruikt een cel- conjugaat systeem 2. De belangrijkste beperking van deze benadering is dat de meeste conjugaten worden gezien in profiel, als het ware, waardoor weergave van de synaptische structuur zelf van de waarnemer beperken. In 1999, het Dustin laboratorium gericht deze beperking door gebruik te maken van de glas-ondersteunde lipidedubbellaag (SLB) techniek 3, die al eerder door de McConnel laboratorium van 4,5 had een pionier. Deze benadering verwijderd antigeen presenterende cellen (APC's) ten gunste van een glas ondersteunde vlakke lipide oppervlak waarin eiwitten kunnen worden bevestigd en vrij bewegen in twee dimensies. Met behulp van deze methode, waren Dustin en collega's in staat om direct tot peer in thij synaps met behulp van hoge resolutie fluorescentie microscopie, en voor de eerste keer krijg je een "face-to-face" blik op de structuur van de IS.
Met het gebruik van SLB systeem heeft de details waarmee de IS kan worden gevisualiseerd is beperkt door de beperkingen van de huidige beeldvormingstechnieken 6-8. Met behulp van standaard technieken verlichting, de minimale resolutie (dwz minimumafstand tussen twee verschillende voorwerpen waarin zij onderscheiden kunnen worden) is <200 nm op basis van Rayleigh criterium 9. Deze beperking belemmert de beeldvorming van zeer fijne, moleculaire schaal bouwsels de synaps en tot de ontwikkeling van superresolutie beeldvormingstechnieken 10-12, werd visualisatie van deze structuren beperkt tot beeldvorming van gefixeerde cellen met elektronenmicroscopie.
Met de recente komst van een verscheidenheid van super-resolutie technieken zoals SIM (gestructureerde verlichting microscopie), PALM (fotogeactiveerde lokalisatie microscopie), STORM (stochastische optische reconstructie microscopie), en STED 10-12, onderzoekers zijn nu in staat om deze synaptische structuren te bestuderen in ongekend detail, dat heeft op zijn beurt voorzien van een steeds duidelijker begrip van de IS. De voordelen van STED microscopie beschreven vóór 13. Hier beschrijven we super-resolutie beeldvorming met STED microscopie uitgerust met de nieuw ontwikkelde 660 nm uitputting laser. Vergeleken met de conventionele 592 nm uitputting laser, de 660 nm laser maakt een bredere selectie van fluorescerende kleurstoffen (zie http://nanobiophotonics.mpibpc.mpg.de/old/dyes/), vooral deze rode fluoroforen.
Andere publicaties hebben de STED beeldvorming van NK-cel synapsen beschreven op antilichaam-gecoate glaasjes 13,14. Hier wordt de SLB-systeem in combinatie met super-resolutie STED microscopie aan de NK-cel synaps bestuderen. Deze techniek heeft het voordeel boven antilichaambeklede objectglaasjes van een vloeistof is mozaïek, waarbij het ingebedde manteleiwitten vrij in een vlakke tweedimensionale vlak (XY-vlak) kan bewegen. Dit bootst getrouwer de organische en mobiele oppervlak van een doelcel, en derhalve beter recapituleert de vorming van een fysiologisch relevante immune synaps.
Het doel van dit protocol is om de eindgebruiker met een gedetailleerde beschrijving van hoe het imago van de immunologische synaps van NK-cellen te bieden door het combineren van de SLB-systeem en super-resolutie STED microscopie. Het zal de eindgebruiker met de stappen die nodig zijn om te voorzien: de voorbereiding van de liposomen, bouwen-eiwit ingebed dubbellagen, bepalen de eiwit dichtheid op de lipidendubbellagen, en het verwerven van super-resolutie beelden met behulp van STED microscopie. Deze technieken zijn niet beperkt tot het gebied van immunologie, en kan breed worden toegepast in verschillende disciplines.
De nieuwheid van de huidige studie is dat het een combinatie van de SLB-techniek met STED NK cel synapsen bestuderen. Eerdere studies hebben de lipidebilaag afgebeeld met TIRF aan T-cel synapsvorming 8 en signalering molecuul mensenhandel op het plasmamembraan 6 bestuderen. Anderen hebben STED beeldvorming van NK-cel synapsen beschreven met behulp van antilichamen gecoat glas dia 13,14. De hybride werkwijze die hierin verder beschreven bouwt voort op deze inspanningen van de beeldvorming van de NK-cel synaps met de verbeterde helderheid geboden door super-resolutie beeldvorming over de lipidebilaag oppervlak, dat betere modellen het dynamische oppervlak van een APC.
Hoewel SLBs zijn kunstmatige membranen ontbreken van cytoskelet, lipid rafts en andere liganden die eigenlijke doel cellen of APC's bezitten, kan deze techniek belangrijke functies, zoals de mobiliteit en oriëntatie van liganden recapituleren. Dit maakt het SLB systeem dienen als reductionistische benadering ontleden tHij bijdrage van individuele receptoren en liganden voor de vorming van de IS en de dynamiek van IS. Het belangrijkste kenmerk van SLBs dat onderzoekers deze techniek met hoge resolutie beeldvormingstechnieken, zoals confocale microscopie en TIRF kunnen combineren. De introductie van STED microscopie nog verder verhoogt dit voordeel, het verstrekken van ongekende inzichten in IS onderzoek en de klinische toepassingen.
Een mogelijke kritiek van dit systeem is dat de SLB het complex oppervlak van een APC niet adequaat nabootsen en dus het potentieel niet-fysiologische anatomische kenmerken in de resulterende synapsen. Hoewel het waar is dat de beperkte repertoire van oppervlaktemoleculen op de SLB niet volledig herhalen het heterogeen bevolkte oppervlak van een APC, kan deze limiet ook voordelig zijn doordat zij kunnen onderzoekers de invloed van afzonderlijke receptor en ligand interacties op synapsvorming bepalen .
THier zijn een aantal cruciale stappen in het proces. Een van de meest kritische is dat oxidatie van de liposomen worden voorkomen door voortdurend met argon om de zuurstof in de buis en oplossing verplaatsen zoals in stap 1.10, 2.6 en 2.11. Oxidatie van de lipiden leidt tot verminderde lipiden mobiliteit, waardoor de mogelijkheid van oppervlakte-eiwitten vrij kunnen bewegen en deelnemen synaptische structureren belemmeren. Evenzo is het ook cruciaal voor al chloroform in het liposoom verwijderd door lyofilisatie (stap 1.2). Bij het bepalen van eiwit dichtheid in de lipide bilaag, is het van belang om eerst dispergeren silicium korrels in een homogene suspensie vrij van clusters. Indien nodig, kan sonicatie kralen worden toegepast. Bij de montage van de SLB, de eerste stappen (5,1-5,8), waarin de dekglaasjes worden gereinigd, de druppels zijn geplaatst, en dekglaasje wordt aangebracht zijn van vitaal belang. Een fout in een van deze kan noodzakelijk het starten van het experiment boven (vanaf het begin van hoofdstuk 5). Daarom is hetgoede gewoonte om meer coverslips schoon te maken dan nodig zal zijn om tijd te besparen in het geval van een ongeluk.
Niet-clustering is de meest voorkomende probleem bij het werken met dit systeem. Indien bij het visualiseren van de cellen in de laatste stap, een niet fluorescerend synapsen vinden, zijn er een paar stappen die genomen kunnen worden. Een vlek van de verwante celoppervlak receptor worden toegevoegd aan de kamer om te verifiëren dat de cel niet vormde een synaps met de bilaag, terwijl cellen niet-specifiek hechten aan de glazen dekglaasje of bilaag oppervlak synaptisch-betrokken oppervlakte-eiwitten moeten weergegeven als afzonderlijke clusters op het vlak van de cel-bilaag-interface, terwijl unengaged oppervlakte eiwitten diffuse kleuring verschijnt rond de omtrek van de cel. Indien deze methode niet, moet men de cellen via flowcytometrie te controleren of het specifieke marker men hoopt studeren wordt uitgedrukt in gepaste overvloed op het celoppervlak. Bepaalde oppervlak proteins is bekend dat neerwaarts gereguleerd op lange termijn in vivo kweken.
Hoewel dit protocol informatie specifiek hoe NK cel synapsvorming visualiseren, kan de SLB-systeem worden gebruikt om synapsvorming studeren in elke immunocyt denkbare simpelweg door substitutie van de primaire ligand in stap 5.11. Meerdere liganden kunnen ook gelijktijdig worden toegevoegd. Men hoeft ook geen streptavidine-biotine systeem voor het hechten van de oppervlakte-eiwitten in de bilaag. Nikkel-NTA: histidine interacties zijn ook haalbaar. Echter, vanwege de hoge sterkte en specificiteit van de streptavidine: biotine interactie, ons lab voorkeur dit systeem. Men kan ook variëren van de concentratie van cellen toegevoegd aan de bilaag van de voorgeschreven dichtheid in stap 5.13, alsmede de duur van de daaropvolgende incubatietijd om synapsen observeren in verschillende stadia van rijping. Dit kan zelfs live worden gedaan, hoewel dit natuurlijk sluit de mogelijkheid van het visualiseren van intracellulaire structures (tenzij ze al zijn gelabeld met een gesmolten fluorescerend label; ons lab maakt gebruik van een paar van zulke veranderde cellijnen). Door de hoge mate van maatwerk mogelijk in dit protocol, kan men de elementaire SLB techniek te gebruiken, samen met STED beeldvorming, een ongelooflijk breed scala aan vragen in de immunologie, celbiologie en biochemie aan te pakken, met inbegrip van basis lipide dynamiek 15, synapsvorming 16 intracellulaire signalering 17 en tumorcelmetastase 18.
The authors have nothing to disclose.
We thank Emily Mace and Malini Mukherjee for imaging and deconvolution analysis. Work in the Liu laboratory was supported in part by the Baylor-UTHouston Center for AIDS Research Core Support Grant number AI36211 from the National Institute of Allergy and Infectious Diseases, the Caroline Wiess Law Fund for Research in Molecular Medicine, Texas Children’s Hospital Pediatric Pilot Research Fund, and the Lymphoma SPORE Developmental Research Program from Baylor College of Medicine and the Methodist Research Institute.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Purpose |
18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine |
Avanti | 850375C | Liposome preparation |
18:1 Biotinyl Cap PE 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl) (sodium salt) |
Avanti | 870273C | Liposome preparation |
Argon gas, compressed | Airgas | UN1006 | Liposome preparation |
A lyophilizer | Labconco | Freezone 7740020 | Liposome preparation |
Lyophilizer tubes | Labconco | 7540200 | Liposome preparation |
Chromatography Columns | Santa Cruz | sc-205558 | Liposome preparation |
1 M Tris pH 8.0 | Ambion | AM9856 | Liposome preparation |
5 M NaCl | Ambion | AM9759 | Liposome preparation |
Octyl-β-D-glucopyranoside | Sigma-Aldrich | O1008 | Liposome preparation |
Dialysis tubing | Spectrum Labs | 132676 | Liposome preparation |
96-well V-bottom polystyrene plate (untreated) | Corning | 3896 | antibody density determination |
Non-functionalized silica beads | Bangs Laboratories | SS06N | antibody density determination |
FACS tubes | Fisher Scientific | 14-959-2A | antibody density determination |
QuantumTM MESF beads | Bangs Laboratories | Variable | antibody density determination |
Casein | Sigma-Aldrich | C0875 | Lipid bilayer preparation |
HEPES buffered saline + 1% HSA | Homemade | Lipid bilayer preparation | |
Streptavidin | Life technologies | 434301 | Lipid bilayer preparation |
Fluorescently-labeled biotinylated protein | Homemade | Lipid bilayer preparation | |
ibidi Sticky-Slide VI 0.4 | ibidi | 80608 | Lipid bilayer preparation |
25×75 mm glass coverslip | ibidi | 10812 | Lipid bilayer preparation |
Hydrogen peroxide (30%) | Fisher Scientic | BP2633 | Lipid bilayer preparation |
Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 258105 | Lipid bilayer preparation |
D-Biotin | Invitrogen | B20656 | Lipid bilayer preparation |
Lens paper | VWR | 54826-001 | For imaging |
Type F Immersion Oil | Leica | 11 513 859 | For imaging |
A Leica TCS STED microscope | Leica | For imaging |