Introduction
면역 시냅스 (IS) 세포 활성화 및 기능 1 중요한 교차점에 자리 잡고 있습니다. 이 항원 제시 세포 성 면역이 수행되는 주요 매체이다. 시냅스 형성의 초기 연구는 미세 세포 - 세포 공액 시스템 (2)을 이용했다. 이 방법의 중요한 한계는 따라서 시냅스 구조 자체의 관찰자의 뷰를 제한하는, 말하자면 접합체의 대부분이, '프로파일'보여 질 것이다. 1999 년, 더스틴 연구소는 이전 McConnel 실험실 4,5에 의해 개척되었다 유리 지원 지질 이중층 (SLB) 기술 (3)를 활용하여이 제한을 해결. 단백질이 부착 된 두 개의 차원으로 자유롭게 이동 될 수있는에 유리 지원 평면 지질 표면에 찬성 항원 제시 세포 (APC를) 처분이 방법. 이 방법을 사용하여, 더스틴와 동료 t에 직접 위로 피어 할 수 있었다그는 고해상도 형광 현미경을 이용하여, 처음으로 IS의 구조에서 "일대일"모양을 얻을 시냅스.
SLB 시스템의 사용으로, IS가 가시화 될 수있는 세부 사항은 현재의 영상 기술 6-8의 제한에 의해 제한되어왔다. 표준 조명 기술을 이용하여, 최소 해상도 (즉, 그들이 구별 될 수있어서 별개의 두 개체 사이의 최소 거리) <된 레일리 기준 (9)의 200 nm의 기준으로했다. 이 제한은 시냅스를 구성하는 매우 미세한 분자 스케일 구조물의 촬상을 방해, 및 수퍼 - 해상도 이미징 기법 10-12의 개발까지 이러한 구조의 시각화는 전자 현미경을 사용하여 고정 된 세포 이미징에 국한되었다.
이러한 SIM 같이 초 해상 기술, 다양한 최근의 출현 (구조화 조명 현미경)는, PALM (광 활성화 현지화 현미경), STORM (stochastical 광학 재건 현미경) 및 STED 10-12, 연구자들은 지금 다시 IS의 점점 더 명확히 이해를 제공하고 전례가없는 세부 사항, 이러한 시냅스 구조를 연구 할 수 있습니다. STED 현미경의 장점은 (13) 이전에 설명되었다. 여기에서 우리는 새로 개발 된 660 nm의 고갈 레이저가 장착 STED 현미경 슈퍼 해상도 이미징에 대해 설명합니다. 종래의 592 nm의 공핍 레이저에 비해, 660 nm의 레이저는 형광 염료 (http://nanobiophotonics.mpibpc.mpg.de/old/dyes/ 참조), 특히 이들 적색 형광체의 폭 넓은 선택을 허용한다.
다른 게시물은 항체 코팅 된 유리 슬라이드 13, 14에 NK 세포 시냅스의 STED 영상을 설명했다. 여기서, SLB 시스템은 NK 세포 시냅스 공부 초해 STED 현미경과 결합된다. 이 기술은 항체 위에 이점을 갖는다임베디드 표면 단백질은 이차원 평면의 표면 (xy 평면)으로 자유롭게 이동할 수있는 유체 모자이크,되는 코팅 슬라이드. 이것은 더 충실 타겟 셀의 유기 및 모바일 표면을 모방하고, 결과적으로 더 중요한 생리 면역 시냅스 형성을 되풀이.
이 프로토콜의 목적은 SLB 시스템 및 수퍼 - 해상도 STED 현미경을 조합하여 NK 세포의 방법 이미지 면역 시냅스의 상세한 설명과 함께 최종 사용자에게 제공하는 것이다. 또한 필요한 단계와 최종 사용자에게 제공 할 것이다 : 리포좀을 제조, 단백질 매립 이중층을 구성, 지질 이중층에 단백질 밀도를 결정하고, STED 현미경을 사용하여 초 - 해상도 이미지를 획득. 이러한 기술은 면역학 분야에 한정되지 않고, 광범위하게 다양한 분야에 걸쳐 이용 될 수있다.
Protocol
리포좀 1. 준비
- 1,2- dioleoyl-SN 글리세로 -3- 포스 포 콜린 (DOPC) 및 1,2- dioleoyl-SN 글리세로 -3- phosphoethanolamine-N-캡 바이오틴 클로로포름 탁 스톡 용액의 양을 계산 (비오틴 PE) 원하는 최종 농도로 희석 주식을 확인합니다. 10 ㎖를 각각 400 μM의 DOPC 80 μM 비오틴 - PE 인지질의 최종 농도를하려면 별도의 유리 크로마토 그래피 튜브에 10 ㎎ / ㎖의 DOPC의 629 μL, 88 μL 10 ㎎ / ㎖ 비오틴-PE를 배치하여 시작합니다.
참고 :이 DOPC과 비오틴 - PE의 클로로포름 중단 원액을 전송하는 동안, 용액 (120 ml의 물을 포함하는 60g의 수산화 칼륨, KOH 1 L 95 % 에탄올)을 청소하여 유리 해밀턴 주사기 및 유리 크로마토 그래피 관을 청소하는 것이 중요합니다. - 화학 후드에서 아르곤의 흐름과 함께 클로로포름을 건조. 파라 필름으로 크로마토 그래피 관을 밀봉합니다.
- lyophiliz에서 높은 진공에 새로 건조 된 리포좀을 가하지어 O / N은 잔류 클로로포름을 제거합니다. 60 ~ 90 분간 건조 당일 완료하십시오.
- 동결 건조기을 실행하는 동안, 일부 희석 버퍼를 준비합니다. 이 프로토콜의 경우, 25 mM 트리스, pH를 8.0로 구성된 25 ml의 준비; 150 mM의 NaCl을; 및 (중량) 2 % n- 옥틸-β-D-라노 시드 (OG) 세제. 다음 건조 OG 분말을 추가하기 전에 아르곤과 산소를 치환 함께 먼저 처음 두 재료를 섞는다. 제조 후, 12 ° C에서 OG 0.2 마이크론 셀룰로오스 아세테이트 막과 용액 및 저장소 필터.
- 또한,하지만 OG없이, 같은 농도에서 트리스 식염수 버퍼의 1 L의 두 나사 상단 병을 준비합니다. 각의 바닥에 증류수 세척 자기 교반 막대를 놓습니다. 트리스 식염수 버퍼의 6 추가 리터를 준비합니다. 아르곤과 모든 병에서 산소를 제거하고뿐만 아니라 4 ° C에 배치합니다.
- 동결 건조 후, 각각의 4 mM의 용액을 만들기 위해 식염수 OG 트리스 완충액 건조 지질을 용해. 예를 들어 다음볼륨, 비오틴-PE 관에 DOPC 튜브 2 ml를, 0.2 ml에 추가합니다.
- 함께 DOPC 지질과 비오틴 - PE 지질을 섞는다. 결합 된 비오틴은 포스페이트 헤드 기의 유동성을 저해 할 수 이것은, SLB의 이동도를 향상시킨다. 80 μM PE 비오틴의 최종 농도를 확인하기 위해, 0.2 mM의 4 비오틴 PE ml의 4 mM의 DOPC 1 ㎖를 혼합한다. 그런 다음 트리스 식염수 OG 버퍼의 8.8 ml를 추가합니다.
- 400 μM의 DOPC의 최종 농도를 들어, 단순히 트리스 - 식염수 OG 9 ml로 4 mM의 DOPC 1ml의 섞는다.
- 얼음 물 초음파기를 입력합니다. 유틸리티 클램프를 사용하여 초음파 처리의 중심에 인지질을 함유하는 희석 된 유리관을 넣어. 맑은 용액이 될 때까지 10 분 동안 초음파 처리 희석 인지질.
주 : 초음파가 열을 발생하기 때문에 낮은 온도를 유지하기 위해 초음파기 물을 욕조에 얼음을 추가합니다. - 액체 위의 공기에서 산소를 대체하기 위해 아르곤으로 튜브를 입력하고, 파라 필름으로 밀봉합니다. 리포좀 2. 투석
- 건조 투석 튜브의 두 부분을 잘라 (분자량 컷 - 오프 : 12-14,000, 직경 : 6.4 mm) 적당한 길이의 (이 예에서는, 40cm), 각 인지질 희석 하나를 롤에서.
- 이들을 2 분 동안 유리 비이커에서, 증류수 200ml에 침지 할 수 있도록함으로써 튜브 섹션을 재수.
- 높은 설정에서 5 분 동안이 전자 레인지, 또는 적어도 물이 끓게 올 때까지.
- 각 튜브의 한쪽 끝에서 매듭을 묶어 트리스 식염수 OG 버퍼의 몇 밀리리터로 내부를 씻어. 그 후, 내부에 남아 꼼꼼하게 버퍼의 양을 최소화하기 위해 가능한 본 세척 완충액만큼을 짠다.
- 모든 공기를 배제하도록 층류 후드에서 작은 투석 튜브의 폐쇄 단부와 개방 각 희석 튜브에 인지질을 추가 클램프. 전체 공기 배제 및 아래 클램핑하여 샘플의 작은 볼륨의 희생이 필요합니다# 8220; 물 라인 ".
- OG없이 트리스 식염수 버퍼의 이전 준비 병 샘플을 담근다. 4 ℃에서 O / N를 저어 다시 밀봉 및 장소하기 전에 아르곤와 병에 산소를 치환.
- 적어도 3 회 OG없이 트리스 완충액 식염수의 새로운 병으로 매 12 시간 동안 튜브를 전송합니다.
- 곧 투석 지질을 제거하기 전에 산소를 대체하기 위해 아르곤과 각을 작성하여 지질 나누어지는 데에 작은 튜브의 수를 준비합니다.
- 36 시간 후, 층류 후드에 투석 병을 가지고 병에서 투석 튜브를 제거합니다. 젖은 유출수를 수집하는 손에 벤치 기저귀 또는 비커 있습니다.
- 다음 클립을 조심스럽게 제거하고 얼음에 아르곤 가스로 채워진 튜브 제조 사전에 1 ㎖의 분액으로 피펫을 통해 투석 된 지질 용액을 전송하고, 상기 클립 투석 튜빙을 잘라.
- 수성 리포좀 솔루션을 나누어지는, 나는 산소를 다시 변위 아르곤 스트림을 사용n은 각 튜브.
- 4 °에서 리포좀을 저장합니다. 냉동하지 마십시오.
- 다음과 같은 농도에서, 바이오틴, 형광 표지 된 항체의 희석 시리즈, 각 희석 볼륨 50 μl를 준비합니다 (공백)이 0 ㎚, 10 nM의 50 nm의, 100 nm의, 500 nm의. (이하는 "샘플 시리즈"이라한다).
- 96 웰 V-바닥 판의 6 우물에 실리카 비드의 1 μl를 추가합니다. 그들이 정착하는 경향이 잘 피펫 팅 전에 구슬을 흔들어해야합니다.
참고 : 중단보다는 건조 구슬을 지시 한 경우, 희석 제조업체의 지침을 따르십시오. - : 1 비율로 1 바이오틴 인지질 :이 구슬에,이 혼합 DOPC의 μl를 추가합니다. 각 웰에 대해이 작업을 수행합니다.
- 구슬과 인지질과의 상호 작용을 장려하기 위해 10 초마다 중간 강도에서 3 번 vortexer를에 접시 펄스.
- 5 % CAS의 150 μl를 추가각 웰에 EIN. 피펫 팅에 의해 세 번 아래로 잘 섞는다.
- 플레이트는이어서, 10 분 동안 카제인 용액에 부화 씻어 보자. 세척, HEPES 250 μL의 총 부피로 각 웰을 채우는 1 % 인간 혈청 알부민 (HSA)과 식염수 (HBS)를 버퍼링. 2 분 동안 1,000 XG에 원심 분리기. 아웃 피펫 맨 상층 액을 200㎕를 버리고, 3 회의 세탁 총 두번 반복한다.
- 333 NG / ml의 농도에서 스트렙 타비 딘의 50 μl를 추가합니다. 다시 10 초를 3 배 판 펄스, 그리고 15 분 동안 진탕에 앉아 보자. 워시 배 단계 6과 결합되지 않은 스트렙 타비 딘를 제거합니다.
- 이전에 준비 희석 시리즈에서 형광 표지 된 비오틴 항체의 50 μl를 추가 아니라 각 (단계 3.1 참조), 20 ~ 30 분 동안 진탕에 접시를 교체합니다. 워시 배 단계 6과 결합되지 않은 항체를 제거합니다.
- 최종 세척 한 후, 다음 FACS 튜브로 전송, HBS / 1 % HSA 100 ㎕에 구슬을 재현 탁. 에이 두 번 반복300 μL의 총 아니라 모든 구슬의 효율적인 제거를 확인하고 각각의 웰에 대해이 작업을 수행합니다.
- 유량 계측기에 결과 튜브를 가져와. 그것은을 읽을 수있는 시간입니다.
- 형광 강도 캘리브레이션 (FIC) 비드 키트에서 "B"로 표시된 병에서 1 방울 추가를 FACS 튜브 (이하 "표준 시리즈"라고 함), 및 HBS / 1 % HSA 300 μL로 희석 하였다.
- 이 튜브를 읽을 수 있지만 아직 데이터를 기록하지 않습니다. 지금은 단순히 빈 구슬이 제대로 제로되어 있는지 확인합니다. 피크가 히스토그램의 왼쪽 끝에가 될 때까지 적절한 채널에서 측정 된 비드의 형광을 나타내는 히스토그램을 확인한 후 다운 여기 레이저의 시프트 전압.
- 튜브를 제거하고 같은 튜브 (1 ~ 4 표시) 시리즈의 다른 4 관의 각 1 방울을 추가합니다. 이제, 다시 기계에 튜브를 배치하고 5 별개의 봉우리로 나타납니다 결과 데이터를 기록한다. 샘플 시리즈에서 각각의 튜브를 읽어보십시오.
- FACS 분석 소프트웨어를 사용하여, 최대량의 절반 지점에서 일련의 표준 히스토그램의 각 피크의 전체 폭에 걸쳐 게이트를 그린다. 즉, 각 피크에 대한 하나의 게이트입니다. 각 샘플에 대해 동일한 작업을 수행합니다. MFI 각 게이트에 대한 (평균 형광 강도) 참고.
- 적절한 위치에서 스프레드 시트 프로그램을 입력 MFI 측정 값을 이용하여. 또한 입력 MESF 값 (이에 상응하는 수용성 형광 색소의 분자) 표준 시리즈의 각 병 (각 비드 코팅 형광 분자의 평균). 이 정보는 플라스틱의 방향이 튜브에 와서 항아리에 따라 찾을 수 있습니다.
- 형광체의 수 및 측정 된 세기 간의 선형 상관 관계를 생성 MESF 값들에 대해 플롯 것 MFI 스프레드 시트를 사용한다.
- Pro에 염료의 비율을 결정하기 위해 마이크로 볼륨 분광 광도계 '단백질 및 라벨'의 모듈을 사용표지 된 항체에 TEIN.
- 입력 샘플 단백질의 표지 효율, 지질 코팅 비드의 평균 직경은, 각 항목에 대한 값 MFI. 스프레드 시트를 자동으로 각 희석 및 단백질 농도에서 각 샘플의 단백질 시딩 MESF 밀도 값을 계산하는 단계에서 생성 3.16 선 그래프에서 수식을 사용한다.
- 나누어지는 15 ml의 50 ML 원뿔 튜브에 말초 혈액이나 버피 코트. PBS 1의 비율로 1 % FBS를 함유하는 혈액이 희석 : 1.
- 부드럽게 10 ml의 혈청 학적 피펫 튜브의 바닥에 피콜의 13 ML을 추가합니다.
- 원심 분리기 (20) 가속기와 1200 XG에 분 휴식 오프 또는 가장 낮은 설정에서이 튜브.
- 원심 분리 후, W (PBMC를) 말초 혈 단핵 세포의 플로팅 흐린 백색 중간층을 수집 혈청 피펫을 사용HICH 앉아서 맑은 노란색 상위 계층과 적혈구 (적혈구)의 최하층 위에 앉아 둘 다 더 흐린 옅은 색의 하위 계층 사이의 교차한다. 참고 PBMC를 수집의 모든 적혈구를 수집하지 마십시오.
- 새로운 50 ML 원뿔 튜브에 수집 된 PBMC를 배치하고 PBS 1 % FBS를 포함하여 용량을 희석. 다시 원심 분리기, 300 x g에서 5 분 동안 최대의 브레이크와 가속,이 시간.
- 뜨는을 취소하고 1 % FBS를 포함하는 PBS 10ml에 세포를 재현 탁.
- 단계 4.6에서와 같이 한 번 더 동일한 설정에서 원심 분리하는 동안 세포를 계산합니다.
- 다시 한번 상층 액을 제거하고, 천만 세포 / ml의 밀도로 배지에서 R10 세포를 재현 탁.
- 제조업체의 지시에 따라, 5 ml의 폴리스티렌 튜브 천만 세포를 가지고, 자기 분리 키트를 사용하여 NK 세포를 분리. 분리 후, 500,0의 밀도로 세포 하나 더 재현 탁를 계산R10 완전 배지에서 00 세포 / ㎖ (88 % RPMI, 10 % FBS, 1 % HEPES; 1 % 피루브산 나트륨) IL-2 (100 U / ml)로 보충. CO 2 배양기에서 37 °,과에서 문화는 2 ~ 3 회 주간 매체를 교체합니다.
- 비이커에 3 : 1의 비율로 황산 30 % 과산화수소를 혼합함으로써 100 ㎖의 피라냐 용액을 준비한다.
참고 : 항상 제대로 지정 화학 흄 후드에서 황산 등 유해 에이전트와의 작업을 수행. - 이 솔루션으로, 20 ~ 30 분 동안 피라나 용액이 직사각형 # 1.5 된 커버를 체험.
참고 : 피라 솔루션으로 된 커버를 청소하는 것이 필수적이다. - 된 커버를 청소하는 동안 이전에 400 μM의 DOPC 지질 및 이전에 80 μM 비오틴 - PE 지질 준비의 1 튜브 준비의 1 관을. 아르곤 탱크에 얼음을 운반.
- 아르곤으로 새로운 microcentrifuge 관에서 산소를 대체,: 1의 비율로 다음 1 DOPC과 비오틴-PE를 함께 추가합니다. 특정 볼륨이 실험의 요구에 따라 달라질 수 있지만, 최소 2 μL를 각에 있어야합니다. 냉장고에 후자를 리턴하기 전에, 한번뿐만 아니라 아르곤 가스, 개별 시약 튜브 혼합물을 튜브에서 산소를 변위.
- 그들은 청소를 마친 후, 철저하게 증류수로 된 커버를 씻어냅니다. 몇 분 동안 건조 공기 아웃 된 커버를 설정합니다.
- 단계 5.4에서 제조 한 리포솜 혼합물의 1.5 μl를 취하여 슬라이드 챔버의 챔버 레인 중 하나에 한 방울에 나누어지는. 레인 당 2 방울의 전형적인 사용되지만, 필요하지 않다.
- 신속하고 효율적으로 물방울을 통해 건조 커버 슬립을 배치합니다. coverslip에 배치되면 그들이 병합하지 않도록 방울 충분히 이격되어 있는지 확인합니다. 또한, 방울 챔버 벽의 가장자리를 건드리지 않고, 원형과 잘 정의 된 남아 있는지 확인하십시오. 단단히 누르십시오사이 각 레인의 주위에 커버 슬립 및 슬라이드 사이의 방수 씰을 보장합니다.
- 마커 펜을 사용하여 방울의 위치를 마크
- 이중층을 차단하는 챔버를 통해 수성 5 % 카제인 100 ㎕ 합격. 유량 용기에 기포가 없음을 확인하십시오.
- 각 레인에 333 ng / ml의 농도에서 스트렙 타비 딘 100 ㎕를 주입한다. 실온에서 10 ~ 15 분 동안 품어. 그 후, 여분의 스트렙 타비 딘을 제거하기 위해 각 레인을 통해 HBS / 1 % HSA 3 ㎖를 실행하여 세척한다.
- 이러한 이전에 20 ~ 30 분 동안 어둠 속에서 제 3 절 품어에 가장 효과적인 것으로 판단 단백질 농도에 알렉사 플 루어 (568)으로 바이오틴 형광 표지 된 항 CD16의 100 μl를 추가합니다. 각 레인을 통해 HBS / 1 % HSA 3 ㎖를 실행하여 다시 씻으십시오.
- 명세서의 비 - 특이 적 결합의 가능성을 초과 스트렙 타비 딘을 결합하고, 따라서 제거하기 위해 상기 챔버를 통해 농도 25 nm에서 D-100 μL 비오틴 흐름셀 reptavidin.
- HBS / 1 % HSA 500,000 / ml의 농도에서 NK 세포에 resuspend 카운트.
- 셀을 아래로 회전하는 동안, 레인 당 HBS / 1 % HSA의 또 다른 3 ml의 챔버에서 D-비오틴을 씻는다.
- 이전에 NK 세포를 추가로 총 내부 반사 형광 (TIRF) 또는 공 초점 현미경에 (FRAP)을 photobleaching에 후 형광 복구하여 SLB에 리간드의 이동성을 확인합니다.
- 세포가 구동을 완료하고 원하는 농도로 재현 탁하고 나면, 각 레인에 100 μl를 추가합니다.
- 30 ~ 60 분 동안 37 ° 5 % CO 2 배양기에서 챔버를 놓습니다.
- 이 잠복기 후, 10 ~ 20 분 동안 실온에서 4 % 파라 포름 알데히드와 세포를 고정합니다. 파라 포름 알데히드를 제거하기 위해 각 레인을 통해 PBS의 3 ㎖를 실행하여 씻으십시오.
- 버퍼 (5 % 정상 당나귀 혈청 0.2 % PBS에서 Tritron X-100)를 차단 400 μl를 추가합니다. 실온에서 30 분 동안 인큐베이션.
- 얼룩 F - 굴지 및 광고에 의해 퍼포딩 희석 형광 표지 팔로이 딘에 200 μL (1 단위 / ㎖의 표지 팔로이 딘) 및 형광 표지 항 퍼포 항체 (500 NG / ml의 항 - 퍼포 단클론 항체). 1 시간 동안 실온에서 품어.
- PBS의 3 ㎖를 실행하여 씻으십시오. 챔버는 이미징을위한 준비가되어 있습니다.
- 필요한 모든 하드웨어 모듈의 전원을 켭니다.
- 이미지 분석 소프트웨어를 시작. 공진 검사 및 STED 모듈을 모두 사용합니다. 이러한 선택을 한 후, 소프트웨어가 시작하기 약 3-5 분 동안 기다립니다.
- 화면 상단의 "구성"탭을 클릭합니다.
- 선택 "레이저 구성"을 선택 후 흰색 빛과 STED 592 nm의 레이저를 켭니다.
- 100 배 목표를 선택하고, 592 nm의 고갈 레이저로 여기 레이저 빔을 맞 춥니 다.
- , "레이저 구성"모듈을 선택 592 고갈을 해제레이저 및 660 nm의 고갈 레이저에 전원을 켭니다.
- 렌즈를 통해, 무대에 슬라이드를 놓습니다. 백색광 램프와 접안 렌즈를 사용하여 초점 경계가 이중층 지역에 바인딩 세포를 가져와.
- 직접 "구성"탭의 오른쪽에, "취득"탭으로 돌아갑니다.
- "스위치 WhiteLight의에"탭을 클릭 한 다음에 해당 모듈을 설정하고 적절한 파장에 여기 레이저 선을 드래그합니다.
- 다음, 적절한 파장의 범위를 포함하는 것으로 검출 범위를 설정 가능한 사람들의리스트에서 원하는 감시를 선택.
참고 : 여기 빔 바로 아래에 감지 범위를 넣어하지 마십시오. - 왼쪽 도구 모음의 맨 아래에있는 순차 주사 대화 상자를 불러옵니다 왼쪽에있는 "Seqential"버튼을 "취득"도구 모음을 클릭합니다. 따라서, 사용자가 여러 서열을 추가 할 수 있도록 각다른 색상마다 서로 다른 여기 빔과 함께. "프레임 사이"를 클릭 한 다음 단계 6.9 및 6.10에서와 같이 각각의 추가 색상의 여기 주파수 검출기 및 검출 범위를 설정합니다.
- 모든 설정이 최적화되면, 인수 과정을 시작하려면 "시작"을 누르십시오.
- 이전 13 설명한 바와 같이, STED의 디컨 볼 루션 위해 디자인 된 설정을 사용하여 무료 디컨 볼 루션 소프트웨어 (호이겐스)를 적용합니다.
지질 이중층에 항체 농도 3. 결정
4. 분리 및 배양 인간 NK 세포
5. 유리 지원 평면 지질 이중층 조립
STED를 사용하여 지질 이중층에 NK 냅 6. 이미징
Representative Results
도 1은 지질 이중층에 항체 밀도의 결과를 나타낸다. 원리는 유동 세포 계측법 (A)를 통해 MFI 대 MESF의 표준 곡선을 만들기 위해 표준 비드를 사용하는 것이다. 일련의 샘플의 MFI는 표준 곡선을 사용 MESF로 전환시켰다. 지질 이중층에 대한 항체 농도는 선형 항체 농도 (B)과 상관된다. 유리 -지지 평면 지질 이중층에 NK 시냅스 2보기 트리플 컬러 화상 STED 도표. 지질 이중층에 항 CD16 항체 F 액틴 형성 및 편광 및 NK 세포에서의 면역 시냅스 패널에 초점 F 액틴 메시를 통해 침투하는 perforin 트리거링 축적한다. 이 결합 된 방식을 사용하여, 하나는 깨끗하게 직접 NK 세포에 CD16의 클러스터링을 반영 SLB, 내 안티 CD16 라벨 형광의 microclusters을 관찰 할 수 있습니다. 종래의 공 초점 이미지의 CD16 센트라의 구조에 비해L 클러스터는 더 쉽게 인해 고갈 된 주변 형광에 STED 이미지에서 식별됩니다. 또한, 액틴 세포 골격의 미세 구조가 크게 개선 된 해상도로 볼 수있다. 이전의 관찰 16, 17과 일치, 퍼포 양성 용해성 과립 STED 이미지, 주로 공 초점 이미지 손실 중요한 세부 낮은 F - 굴지 밀도의 영역 위에 위치 볼 수 있습니다.
지질 이중층에 3G8 항체 그림 1. 밀도. (A) 표준 계열 MESF 및 MFI 간의 선형 상관 관계. (B) 단백질의 농도 및 샘플 단백질 희석 계열의 농도 간의 선형 상관 관계, 당 형광 표지 된 단백질 단량체의 수를 나타내는 지질 코팅시에 증가하는 농도의 함수로서 단위 영역리카 구슬입니다.
평면 지질 이중층에 NK 시냅스 그림 2. STED 촬상. 기본 NK 세포, SLB 함유 비오틴 형광 표지 된 항 CD16 (적색)에 자극 고정 투과 가능하고 팔로이 딘 (청색) 및 안티 F 액틴 염색 (녹색). 각각의 셀은 먼저 일반 공 초점 설정 아래에 몇 군데, 다음 STED 설정했다. 공 초점 및 STED 이미지는 호이겐스 소프트웨어를 사용 deconvoluted했다. 스케일 바, 1 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
본 연구의 참신은 NK 세포의 시냅스를 공부 STED와 SLB 기술을 결합한 것입니다. 이전의 연구는 세포막 6 T 세포의 시냅스 형성 (8) 및 신호 분자 인신 매매를 공부 TIRF와 지질 이중층을 이미지화했다. 다른 사람은 항체 코팅 된 유리 슬라이드 13, 14를 사용하여 NK 세포 시냅스의 STED 영상을 설명했다. 본 명세서에서 더 설명 하이브리드 방법은 지질 이중층 표면에 초 - 해상도 이미징에 의해 수득 향상된 선명도와 NK 세포에 의해 시냅스 촬상 이러한 노력을 토대로하는 APC 나은 모델의 동적 표면.
SLB 수 실제 표적 세포 또는 항원 제시 세포 골격이 소유하는 것이, 지질 뗏목 부족 인공 세포막 및 기타 리간드이지만,이 기술은 이동 방향 및 리간드로서 중요한 기능 요점을 되풀이 할 수있다. 이 SLB 시스템은 해부 t에 환원 주의적 접근 방법이 될 수 있습니다IS의 형성과 IS의 역학에 대한 개별 수용체와 리간드의 그는 기여. SLB 수의 가장 중요한 특징은 연구자는 공 초점 현미경과 같이 TIRF 고해상도 영상화 방법과이 방법을 결합 할 수 있다는 것이다. STED 현미경의 도입은 더욱 연구와 임상 응용 프로그램입니다에 전례없는 통찰력을 제공,이 장점을 증가시킨다.
이 시스템의 하나의 잠재적 인 비판은 SLB 적절 따라서 결과 시냅스에 잠재적으로 비 생리적 해부학 적 특징에 상승을 제공, APC의 복잡한 표면을 모방하지 않습니다. 이 SLB에 표면 분자의 제한된 레퍼토리가 완전히 APC의 불 균질 인구 표면 요점을 되풀이하지 않는 것은 사실이지만 그것이 시냅스 형성에 개인 수용체와 리간드 상호 작용의 영향을 결정하기 위해 수사관을 허용한다는 점에서,이 제한은 유리할 수 .
티여기에 그 과정에서 몇 가지 중요한 단계입니다. 가장 중요한 중 리포좀의 산화 단계는 1.10, 2.6, 2.11처럼 끊임없이 튜브 용액에서 산소를 변위 시키 통해 아르곤을 사용하여 방지 될 수있다. 지질의 산화에 따라서 자유롭게 이동 시냅스 구조에 참여하는 표면 단백질의 능력을 방해, 감소 된 지질 이동성을 초래할 것이다. 마찬가지로, 동결 건조한다 (스텝 1.2)에 의해 모든 리포솜 클로로포름을 제거하는 것도 중요하다. 지질 이중층에서 단백질 농도의 결정에있어서, 먼저 클러스터가없는 균질 한 현탁액에 실리콘 비드를 분산시키는 것이 중요하다. 필요한 경우, 비드의 초음파를 적용 할 수있다. 된 커버 청소되는 것을 특징으로하는 SLB 조립에서, 초기 단계 (5.1-5.8)는, 방울 배치하고, 커버 슬립은 매우 중요 부착되어 있습니다. 이들의에서의 실수 (섹션 5의 시작 부분에서)를 통해 실험을 시작하기 필요로 할 수 있습니다. 이 때문에,은사고의 경우에는 시간을 절약하기 위해 필요한 것보다 더 좋은 방법은 더 된 커버를 청소합니다.
이 시스템과 함께 작동 할 때 비 클러스터링은 가장 흔한 문제입니다. 최종 단계에서 세포를 시각화하는 경우, 어느 하나의 형광을 시냅스 찾는데 실패하는 경우, 취할 수있는 몇 가지 단계가있다. 세포가 시냅스 관여하는 표면 단백질이 해야하는, 유리 커버 슬립 또는 이중층 표면에 비특이적으로 부착 할 수 있지만 동족 세포 표면 수용체에 대한 또 다른 얼룩은, 셀이 이중층으로 시냅스 형성되지 않았 음을 확인하기 위해 상기 챔버에 첨가 될 수있다 맞물려 있지 않은 표면 단백질이 세포의 둘레와 같은 확산 염색 나타나야하는 반면, 셀 이중층 인터페이스의 평면에서와 같은 별개의 클러스터를 표시. 이 방법이 실패 할 경우, 하나는 특정 마커 하나가 세포 표면에 적절한 풍부하게 표현 공부하기를 희망하고있다 있도록 유동 세포 계측법을 통해 자신의 세포를 확인해야합니다. 특정 표면 보호 자전거인은 생체 내 문화에 장기적으로 하향 조절되는 것으로 알려져있다.
이 프로토콜 세부 사항이 구체적으로 어떻게 NK 세포의 시냅스 형성을 시각화하는 동안, SLB 시스템은 단순히 단계 5.11의 기본 리간드의 치환 상상할 수있는 모든 면역 세포에서 시냅스 형성을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 다수의 리간드는 또한 동시에 첨가 될 수있다. 하나는 이중층 내 표면 접착 단백질을 스트렙 타비 딘 - 비오틴 시스템을 사용할 필요가 없다. 니켈 - NTA : 히스티딘의 상호 작용도 가능한입니다. 그러나, 스트렙 타비 딘의 높은 강도와 특이성 : 비오틴 상호 작용, 우리 연구소는이 시스템을 선호한다. 하나는 단계 513에서 소정의 밀도에서 이중층 상 추가 셀의 농도뿐만 아니라 성숙의 다른 단계에서 시냅스를 관찰하기 위해 후속하는 배양 기간만큼 다를 수있다. 물론 이것은 STR 세포를 시각화 가능성을 배제하더라도 이것은 심지어 라이브 할 수uctures (그들은 이미 융합 형광 태그로 표시하지 않는 한, 우리의 실험실은 몇 이러한 변형 된 세포주를 사용한다). 때문에이 프로토콜에서 가능한 사용자 정의의 높은 수준에, 하나는 기본 지질 역학 (15), 시냅스 형성을 포함, 면역학, 세포 생물학, 생화학 질문에 믿을 수 없을만큼 다양한 범위를 해결하기 위해, STED 영상과 함께, 기본 SLB 기술을 사용할 수 있습니다 16, 17, 세포 내 신호 전달 및 종양 세포의 전이 (18).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine |
Avanti | 850375C | Liposome preparation |
| 18:1 Biotinyl Cap PE 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl) (sodium salt) |
Avanti | 870273C | Liposome preparation |
| Argon gas, compressed | Airgas | UN1006 | Liposome preparation |
| A lyophilizer | Labconco | Freezone 7740020 | Liposome preparation |
| Lyophilizer tubes | Labconco | 7540200 | Liposome preparation |
| Chromatography Columns | Santa Cruz | sc-205558 | Liposome preparation |
| 1 M Tris pH 8.0 | Ambion | AM9856 | Liposome preparation |
| 5 M NaCl | Ambion | AM9759 | Liposome preparation |
| Octyl-β-D-glucopyranoside | Sigma-Aldrich | O1008 | Liposome preparation |
| Dialysis tubing | Spectrum Labs | 132676 | Liposome preparation |
| 96-well V-bottom polystyrene plate (untreated) | Corning | 3896 | antibody density determination |
| Non-functionalized silica beads | Bangs Laboratories | SS06N | antibody density determination |
| FACS tubes | Fisher Scientific | 14-959-2A | antibody density determination |
| QuantumTM MESF beads | Bangs Laboratories | Variable | antibody density determination |
| Casein | Sigma-Aldrich | C0875 | Lipid bilayer preparation |
| HEPES buffered saline + 1% HSA | Homemade | Lipid bilayer preparation | |
| Streptavidin | Life technologies | 434301 | Lipid bilayer preparation |
| Fluorescently-labeled biotinylated protein | Homemade | Lipid bilayer preparation | |
| ibidi Sticky-Slide VI 0.4 | ibidi | 80608 | Lipid bilayer preparation |
| 25x75 mm glass coverslip | ibidi | 10812 | Lipid bilayer preparation |
| Hydrogen peroxide (30%) | Fisher Scientic | BP2633 | Lipid bilayer preparation |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 258105 | Lipid bilayer preparation |
| D-Biotin | Invitrogen | B20656 | Lipid bilayer preparation |
| Lens paper | VWR | 54826-001 | For imaging |
| Type F Immersion Oil | Leica | 11 513 859 | For imaging |
| A Leica TCS STED microscope | Leica | For imaging |
References
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- Monks, C. R., Freiberg, B. A. K. upferH., Sciaky, N., Kupfer, A. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).
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