एक गिलास समर्थित प्लानर लिपिड bilayer पर प्राकृतिक हत्यारा सेल रोग प्रतिरक्षण अन्तर्ग्रथन की सुपर संकल्प इमेजिंग
Summary
We describe here a combination of the glass-supported lipid bilayer technique of forming immunological synapses with the super-resolution imaging technique of stimulated emission depletion (STED) microscopy. The goal of this protocol is to provide users with the instructions necessary to successfully carry out these two techniques.
Abstract
The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has been in the study of immunological synapse formation, due to the ability of the glass-supported planar lipid bilayers to mimic the surface of a target cell while forming a horizontal interface. The recent advances in super-resolution imaging have further allowed scientists to better view the fine details of synapse structure. In this study, one of these advanced techniques, stimulated emission depletion (STED), is utilized to study the structure of natural killer (NK) cell synapses on the supported lipid bilayer. Provided herein is an easy-to-follow protocol detailing: how to prepare raw synthetic phospholipids for use in synthesizing glass-supported bilayers; how to determine how densely protein of a given concentration occupies the bilayer’s attachment sites; how to construct a supported lipid bilayer containing antibodies against NK cell activating receptor CD16; and finally, how to image human NK cells on this bilayer using STED super-resolution microscopy, with a focus on distribution of perforin positive lytic granules and filamentous actin at NK synapses. Thus, combining the glass-supported planar lipid bilayer system with STED technique, we demonstrate the feasibility and application of this combined technique, as well as intracellular structures at NK immunological synapse with super-resolution.
Introduction
प्रतिरक्षाविज्ञानी अन्तर्ग्रथन (है) सेल सक्रियण और समारोह एक के लिए एक महत्वपूर्ण जंक्शन पर स्थित है। यह प्रतिजन प्रस्तुति और सेल की मध्यस्थता उन्मुक्ति बाहर किया जाता है जिसके द्वारा प्राथमिक माध्यम है। synapse गठन की जल्द से जल्द सूक्ष्म पढ़ाई एक सेल सेल एकत्रित 2 प्रणाली का उपयोग किया। इस दृष्टिकोण के साथ प्रमुख सीमा है कि यह इस प्रकार अन्तर्ग्रथनी संरचना ही के पर्यवेक्षक के दृष्टिकोण सीमित थे, के रूप में conjugates के अधिकांश, 'प्रोफ़ाइल में' देखा जाएगा कि है। 1999 में, डस्टिन प्रयोगशाला पहले McConnel प्रयोगशाला 4,5 ने बीड़ा उठाया गया था जो कांच-समर्थित लिपिड bilayer (SLB) तकनीक 3, के उपयोग से इस सीमा को संबोधित किया। प्रोटीन जुड़ा हुआ है और दो आयामों में आज़ादी से स्थानांतरित किया जा सकता है जिसमें एक गिलास समर्थित तलीय लिपिड सतह, के पक्ष में प्रतिजन पेश कोशिकाओं (APCs) का निपटारा इस दृष्टिकोण। इस विधि का प्रयोग, डस्टिन और उनके सहयोगियों टी में सीधे ऊपर सहकर्मी करने में सक्षम थेवह उच्च संकल्प प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग, और पहली बार के लिए है की संरचना में एक "का सामना करने वाली चेहरा" देखो पाने Synapse।
SLB प्रणाली के उपयोग के साथ है, कल्पना की जा सकती है जिसके साथ विस्तार से केवल वर्तमान इमेजिंग तकनीक 6-8 की सीमाओं से प्रतिबंधित कर दिया गया है। मानक रोशनी तकनीक का उपयोग करना, न्यूनतम संकल्प (यानी, वे प्रतिष्ठित किया जा सकता है जिसमें दो अलग-अलग वस्तुओं के बीच न्यूनतम दूरी) <किया गया रेले की कसौटी 9 के आधार पर 200 एनएम गया है। इस सीमा अन्तर्ग्रथन कि मेकअप बहुत ठीक, आणविक पैमाने पर संरचनाओं की इमेजिंग hinders, और सुपर संकल्प इमेजिंग तकनीक 10-12 के विकास के लिए, जब तक इन संरचनाओं के दृश्य इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग तय कोशिकाओं की इमेजिंग तक ही सीमित था।
इस तरह के सिम के रूप में सुपर संकल्प तकनीक की एक किस्म के हाल के आगमन के साथ (संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी), पाम (photoactivated स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी), तूफान (stochastical ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी), और STED 10-12, जांचकर्ताओं अब बारी में है की एक तेजी से स्पष्ट समझ प्रदान की गई है, जो अभूतपूर्व विस्तार में इन अन्तर्ग्रथनी संरचनाओं का अध्ययन करने में सक्षम हैं। STED माइक्रोस्कोपी के फायदे में 13 से पहले वर्णित किया गया है। यहाँ हम नव विकसित 660 एनएम कमी लेजर के साथ सुसज्जित STED माइक्रोस्कोपी के साथ सुपर संकल्प इमेजिंग का वर्णन है। पारंपरिक 592 एनएम कमी लेजर की तुलना में, 660 एनएम लेजर फ्लोरोसेंट रंजक (http://nanobiophotonics.mpibpc.mpg.de/old/dyes/ देखें), विशेष रूप से इन लाल fluorophores के एक व्यापक चयन के लिए अनुमति देता है।
अन्य प्रकाशनों एंटीबॉडी लेपित गिलास स्लाइड 13,14 पर एन.के. सेल synapses के STED इमेजिंग का वर्णन किया है। इधर, SLB प्रणाली एन.के. सेल अन्तर्ग्रथन अध्ययन करने के लिए सुपर संकल्प STED माइक्रोस्कोपी के साथ संयुक्त है। इस तकनीक antibody- से अधिक लाभ हैएम्बेडेड सतह प्रोटीन एक फ्लैट दो आयामी सतह (XY विमान) में स्वतंत्र रूप से स्थानांतरित कर सकते हैं, जिसमें एक तरल पदार्थ मोज़ेक, होने का लेपित स्लाइड। यह और अधिक ईमानदारी से एक लक्ष्य सेल की जैविक और मोबाइल सतह mimics, और फलस्वरूप बेहतर एक physiologically प्रासंगिक प्रतिरक्षा अन्तर्ग्रथन के गठन का स्मरण दिलाता है।
इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य SLB प्रणाली और सुपर संकल्प STED माइक्रोस्कोपी के संयोजन से एन.के. कोशिकाओं की कैसे छवि को प्रतिरक्षाविज्ञानी अन्तर्ग्रथन का एक विस्तृत विवरण के साथ अंत उपयोगकर्ता प्रदान करना है। यह करने के लिए आवश्यक कदम के साथ अंत उपयोगकर्ता प्रदान करेगा: liposomes तैयार करते हैं, प्रोटीन-एम्बेडेड bilayers का निर्माण, लिपिड bilayers पर प्रोटीन घनत्व निर्धारित करते हैं, और STED माइक्रोस्कोपी का उपयोग सुपर संकल्प छवियों के अधिग्रहण। इन तकनीकों में इम्यूनोलॉजी के क्षेत्र तक सीमित नहीं हैं, और मोटे तौर पर विषयों की एक किस्म में उपयोग किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
वर्तमान अध्ययन की नवीनता यह एन.के. सेल synapses के अध्ययन करने के लिए STED साथ SLB तकनीक को जोड़ती है। पिछले अध्ययनों प्लाज्मा झिल्ली 6 पर टी सेल synapse गठन 8 और संकेत अणु की तस्करी का अध्ययन करने के TIRF साथ लिपिड bilayer imaged किया है। दूसरों एंटीबॉडी लेपित गिलास स्लाइड 13,14 का उपयोग कर एन.के. सेल synapses के STED इमेजिंग का वर्णन किया है। इस के साथ साथ आगे वर्णित संकर विधि लिपिड bilayer सतह पर सुपर संकल्प इमेजिंग द्वारा afforded बढ़ाया स्पष्टता, साथ एन.के. सेल अन्तर्ग्रथन इमेजिंग द्वारा इन प्रयासों पर बनाता है जो एक APC के बेहतर मॉडल गतिशील सतह।
SLBs वास्तविक लक्ष्य कोशिकाओं या APCs कि अधिकारी cytoskeleton है, लिपिड rafts का कमी कृत्रिम झिल्ली, और अन्य ligands के हैं, इस तकनीक ऐसी गतिशीलता और ligands के उन्मुखीकरण के रूप में महत्वपूर्ण सुविधाओं पुनरावृत्ति कर सकते हैं। इस SLB प्रणाली विदारक टी में एक न्यूनीकारक दृष्टिकोण के रूप में सेवा करने के लिए अनुमति देता हैIS के गठन और IS की गतिशीलता के लिए अलग-अलग रिसेप्टर्स और ligands की वह योगदान। SLBs की सबसे महत्वपूर्ण विशेषता शोधकर्ताओं ने ऐसे confocal और TIRF माइक्रोस्कोपी के रूप में उच्च संकल्प इमेजिंग दृष्टिकोण के साथ इस तकनीक गठबंधन कर सकते हैं। STED माइक्रोस्कोपी की शुरूआत भी आगे अनुसंधान और इसके नैदानिक अनुप्रयोगों में अभूतपूर्व अंतर्दृष्टि प्रदान करने, इस लाभ बढ़ जाती है।
इस प्रणाली का एक संभावित आलोचना SLB पर्याप्त रूप से इस प्रकार जिसके परिणामस्वरूप अन्तर्ग्रथन में संभावित रूप से गैर-शारीरिक शारीरिक विशेषताओं को जन्म दे रही है, एक APC के जटिल सतह की नकल नहीं करता है। यह SLB पर सतह अणुओं की सीमित प्रदर्शनों की सूची पूरी तरह से एक APC के विभिन्नतापूर्वक आबादी सतह पुनरावृत्ति नहीं करता सच है कि यह synapse गठन पर व्यक्तिगत रिसेप्टर और ligand बातचीत के प्रभाव का निर्धारण करने के जांचकर्ताओं की अनुमति देता है, कि इस सीमा को भी फायदेमंद हो सकता है ।
टीयहाँ इस प्रक्रिया में कई महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं। सबसे महत्वपूर्ण अलावा liposomes की है कि ऑक्सीकरण इस तरह के कदम 1.10, 2.6, और 2.11 के रूप में लगातार ट्यूब और समाधान, में ऑक्सीजन को विस्थापित करने के आर्गन का उपयोग कर के माध्यम से रोका जा रहा है। लिपिड ऑक्सीकरण इस प्रकार आसानी से ले जाने और synaptic संरचना में भाग लेने के लिए सतह प्रोटीन की क्षमता बाधा कमी आई है, लिपिड गतिशीलता में परिणाम होगा। इसी तरह, यह lyophilization (कदम 1.2) द्वारा liposome में सभी क्लोरोफॉर्म दूर करने के लिए भी महत्वपूर्ण है। लिपिड bilayer में प्रोटीन घनत्व के निर्धारण में, यह पहली बार समूहों से मुक्त एक समरूप निलंबन में सिलिकॉन मोतियों को तितर-बितर करने के लिए महत्व का है। यदि आवश्यक हो, मोतियों की sonication के लिए लागू किया जा सकता है। Coverslips साफ कर रहे हैं जिसमें SLB कोडांतरण में, जल्दी कदम (5.1-5.8), बूंदों रखा जाता है, और coverslip महत्वपूर्ण हैं चिपका है। इनमें से किसी में एक गलती (धारा 5 की शुरुआत से) से अधिक प्रयोग शुरू करने की जरूरत है सकते हैं। इस कारण से, यह हैएक दुर्घटना के मामले में समय को बचाने के लिए आवश्यक हो जाएगा की तुलना में अच्छा अभ्यास अधिक coverslips साफ करने के लिए।
इस प्रणाली के साथ काम कर रहा है जब गैर-क्लस्टरिंग सबसे लगातार मुद्दा है। अंतिम चरण में कोशिकाओं visualizing, जब भी किसी भी फ्लोरोसेंट अन्तर्ग्रथन खोजने के लिए विफल रहता है, ले जाया जा सकता है कि कुछ कदम उठाए हैं। कोशिकाओं synaptically-शामिल सतह प्रोटीन चाहिए, कांच coverslip या दोहरी परत की सतह के लिए गैर-विशेष रूप से पालन कर सकते हैं जबकि आत्मीय सेल सतह रिसेप्टर के लिए एक और दाग, सेल दोहरी परत के साथ एक अन्तर्ग्रथन का गठन नहीं किया गया है कि यह पुष्टि करने के लिए चैम्बर के लिए जोड़ा जा सकता है unengaged सतह प्रोटीन कोशिका की परिधि के आसपास के रूप में फैलाना धुंधला दिखाई देना चाहिए, जबकि सेल bilayer इंटरफ़ेस के विमान में के रूप में अलग समूहों दिखाई देते हैं। इस विधि विफल करना चाहिए, एक विशेष मार्कर एक कोशिका की सतह पर पर्याप्त बहुतायत में व्यक्त किया जाता है अध्ययन करने के लिए उम्मीद कर रहा है कि यह सुनिश्चित करने के लिए प्रवाह cytometry के माध्यम से उनकी कोशिकाओं की जांच होनी चाहिए। कुछ सतह proteआईएनएस विवो संस्कृति में लंबे समय से अधिक नीचे विनियमित होने के लिए जाना जाता है।
इस प्रोटोकॉल विवरण विशेष रूप से कैसे एन.के. सेल synapse गठन कल्पना करने के लिए करते हैं, SLB प्रणाली केवल कदम 5.11 में प्राथमिक ligand के प्रतिस्थापन के द्वारा किसी भी कल्पनीय immunocyte में synapse गठन का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। एकाधिक ligands के भी एक साथ जोड़ा जा सकता है। एक भी दोहरी परत के भीतर सतह प्रोटीन पालन के लिए एक streptavidin बायोटिन प्रणाली का उपयोग करने की आवश्यकता नहीं। निकल NTA: हिस्टडीन बातचीत भी व्यवहार्य हैं। हालांकि, की वजह streptavidin के उच्च शक्ति और विशिष्टता के लिए: बायोटिन संपर्क, हमारी प्रयोगशाला में इस प्रणाली पसंद करती हैं। एक भी कदम 5.13 में निर्धारित घनत्व से bilayer पर जोड़ा कोशिकाओं की एकाग्रता, साथ ही परिपक्वता के विभिन्न चरणों में synapses के निरीक्षण के क्रम में बाद में ऊष्मायन अवधि की अवधि भिन्न हो सकते हैं। इस कोर्स के इंट्रासेल्युलर एसटीआर visualizing की संभावना शामिल है, हालांकि यह भी, जीते किया जा सकता हैuctures (वे पहले से ही एक दूसरे से जुड़ने फ्लोरोसेंट टैग के साथ चिह्नित कर रहे हैं जब तक हमारी प्रयोगशाला में कुछ इस तरह बदल सेल लाइनों का उपयोग करता है)। इस वजह से यह प्रोटोकॉल में संभव अनुकूलन के उच्च डिग्री करने के लिए, एक बुनियादी लिपिड गतिशीलता 15, Synapse गठन सहित, इम्यूनोलॉजी, कोशिका जीव विज्ञान, और जैव रसायन में सवालों की एक अविश्वसनीय रूप से विविध रेंज को संबोधित करने के लिए, STED इमेजिंग के साथ साथ बुनियादी SLB तकनीक का उपयोग कर सकते हैं 16, इंट्रासेल्युलर 17 संकेत, और ट्यूमर सेल मेटास्टेसिस 18।
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Emily Mace and Malini Mukherjee for imaging and deconvolution analysis. Work in the Liu laboratory was supported in part by the Baylor-UTHouston Center for AIDS Research Core Support Grant number AI36211 from the National Institute of Allergy and Infectious Diseases, the Caroline Wiess Law Fund for Research in Molecular Medicine, Texas Children’s Hospital Pediatric Pilot Research Fund, and the Lymphoma SPORE Developmental Research Program from Baylor College of Medicine and the Methodist Research Institute.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Purpose |
| 18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine |
Avanti | 850375C | Liposome preparation |
| 18:1 Biotinyl Cap PE 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl) (sodium salt) |
Avanti | 870273C | Liposome preparation |
| Argon gas, compressed | Airgas | UN1006 | Liposome preparation |
| A lyophilizer | Labconco | Freezone 7740020 | Liposome preparation |
| Lyophilizer tubes | Labconco | 7540200 | Liposome preparation |
| Chromatography Columns | Santa Cruz | sc-205558 | Liposome preparation |
| 1 M Tris pH 8.0 | Ambion | AM9856 | Liposome preparation |
| 5 M NaCl | Ambion | AM9759 | Liposome preparation |
| Octyl-β-D-glucopyranoside | Sigma-Aldrich | O1008 | Liposome preparation |
| Dialysis tubing | Spectrum Labs | 132676 | Liposome preparation |
| 96-well V-bottom polystyrene plate (untreated) | Corning | 3896 | antibody density determination |
| Non-functionalized silica beads | Bangs Laboratories | SS06N | antibody density determination |
| FACS tubes | Fisher Scientific | 14-959-2A | antibody density determination |
| QuantumTM MESF beads | Bangs Laboratories | Variable | antibody density determination |
| Casein | Sigma-Aldrich | C0875 | Lipid bilayer preparation |
| HEPES buffered saline + 1% HSA | Homemade | Lipid bilayer preparation | |
| Streptavidin | Life technologies | 434301 | Lipid bilayer preparation |
| Fluorescently-labeled biotinylated protein | Homemade | Lipid bilayer preparation | |
| ibidi Sticky-Slide VI 0.4 | ibidi | 80608 | Lipid bilayer preparation |
| 25×75 mm glass coverslip | ibidi | 10812 | Lipid bilayer preparation |
| Hydrogen peroxide (30%) | Fisher Scientic | BP2633 | Lipid bilayer preparation |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 258105 | Lipid bilayer preparation |
| D-Biotin | Invitrogen | B20656 | Lipid bilayer preparation |
| Lens paper | VWR | 54826-001 | For imaging |
| Type F Immersion Oil | Leica | 11 513 859 | For imaging |
| A Leica TCS STED microscope | Leica | For imaging |
References
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