We describe here a combination of the glass-supported lipid bilayer technique of forming immunological synapses with the super-resolution imaging technique of stimulated emission depletion (STED) microscopy. The goal of this protocol is to provide users with the instructions necessary to successfully carry out these two techniques.
The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has been in the study of immunological synapse formation, due to the ability of the glass-supported planar lipid bilayers to mimic the surface of a target cell while forming a horizontal interface. The recent advances in super-resolution imaging have further allowed scientists to better view the fine details of synapse structure. In this study, one of these advanced techniques, stimulated emission depletion (STED), is utilized to study the structure of natural killer (NK) cell synapses on the supported lipid bilayer. Provided herein is an easy-to-follow protocol detailing: how to prepare raw synthetic phospholipids for use in synthesizing glass-supported bilayers; how to determine how densely protein of a given concentration occupies the bilayer’s attachment sites; how to construct a supported lipid bilayer containing antibodies against NK cell activating receptor CD16; and finally, how to image human NK cells on this bilayer using STED super-resolution microscopy, with a focus on distribution of perforin positive lytic granules and filamentous actin at NK synapses. Thus, combining the glass-supported planar lipid bilayer system with STED technique, we demonstrate the feasibility and application of this combined technique, as well as intracellular structures at NK immunological synapse with super-resolution.
Den immunologiske synapse (IS) ligger på et kritisk knutepunkt for celle-aktivering og funksjon 1. Det er den primære mediet som antigen presentasjon og cellemediert immunitet blir utført. De tidligste mikroskopiske studier av synapse formasjon utnyttet en celle-celle konjugat system 2. Den viktigste begrensning med denne tilnærmingen er at de fleste av konjugatene vil sees 'i profil ", som det var, og dermed begrense observatørens riss av den synaptiske strukturen selv. I 1999 Dustin laboratoriet løses denne begrensning ved anvendelse av glass-støttet lipidbilag (SLB) teknikken 3, som hadde vært Hydro tidligere av McConnel laboratorie 4,5. Denne tilnærmingen kastes av antigen-presenterende celler (APC) i favør av en glass-støttet lipid plane overflate, inn i hvilket proteinene kan bli festet og bevege seg fritt i to dimensjoner. Ved hjelp av denne metoden, Dustin og kolleger var i stand til å kikke rett opp i than Synapse med høyoppløselig fluorescens mikroskopi, og for første gang får en "face-to-face" se på strukturen i ER.
Med bruk av SLB-systemet, har detaljer som IS kan visualiseres vært begrenset bare av begrensningene i nåværende bildeteknikker 6-8. Ved hjelp av standard belysningsteknikker, den minste oppløsning (dvs. minsteavstand mellom to distinkte objekter, karakterisert ved at de kan skilles) har vært <200 nm på grunn av Rayleigh-kriterium 9. Denne begrensning hindrer avbildning av meget fine, molekylær skala strukturer som utgjør synapse, og til utvikling av superoppløsningsavbildningsteknikker 10-12, ble visualiseringen av disse strukturene begrenset til avbildning av fikserte celler ved å bruke elektronmikroskopi.
Med den siste ankomsten av en rekke superoppløsningsteknikker, slik som SIM-kort (strukturert belysning mikros), PALM (photoactivated lokalisering mikroskopi), STORM (stokastiske optisk rekonstruksjon mikroskopi), og STED 10-12, etterforskere er nå i stand til å studere disse synaptiske strukturer i enestående detalj, noe som igjen har gitt en stadig mer avklart forståelse av IS. Fordelene med STED mikroskopi har blitt beskrevet før 13. Her beskriver vi super-oppløsning bildebehandling med STED mikros utstyrt med den nyutviklede 660 nm uttømming laser. Sammenlignet med den konvensjonelle 592 nm uttømming laser, gjør det mulig for 660 nm laser for et bredere utvalg av fluorescerende fargestoffer (se http://nanobiophotonics.mpibpc.mpg.de/old/dyes/), spesielt disse røde fluoroforer.
Andre publikasjoner har beskrevet STED avbildning av NK celle synapser på antistoffbelagte glass 13,14. Her er SLB system kombinert med super-oppløsning STED mikroskopi for å studere NK celle synapse. Denne teknikken har den fordel i antistoff-belagte objektglass ved å være en fluid mosaikken, i hvilket den innebygde overflateproteiner kan bevege seg fritt i en flat to-dimensjonal overflate (xy-planet). Dette etterligner flere trofast den organiske og mobile overflaten av en målcelle, og følgelig bedre sammenfatter dannelse av et fysiologisk relevant immun synapse.
Målet med denne protokollen er å gi sluttbrukeren med en detaljert beskrivelse av hvordan du bilde den immunologiske synapse av NK-celler ved å kombinere SLB system og super-oppløsning STED mikroskopi. Det vil gi sluttbrukeren med de nødvendige skritt for å: forberede liposomer, konstruere protein-embedded bilagene, bestemme protein tetthet på lipiddobbeltlag, og skaffe seg super-oppløsning ved hjelp STED mikroskopi. Disse teknikkene er ikke begrenset til feltet av immunologi, og kan grovt utnyttet på tvers av en rekke disipliner.
Nyheten av denne studien er at den kombinerer SLB teknikk med STED å studere NK celle synapser. Tidligere studier har avbildet lipidbilaget med TIRF å studere T celle synapse formasjon 8 og signalmolekyl trafficking på plasmamembranen 6. Andre har beskrevet STED avbildning av NK celle synapser hjelp antistoffbelagte glass 13,14. Hybridmetoden beskrevet her lenger bygger på dette arbeidet med CCD-NK-cellen synapse med forbedret klarhet gis av super-oppløsning bildebehandling på lipidbilag overflate, som bedre modeller den dynamiske overflaten av en APC.
Selv SLBs er kunstige membraner mangler av cytoskjelettet, lipid flåter og andre ligander som faktiske målceller eller APC besitter, kan denne teknikken rekapitulere viktige funksjoner som mobilitet og orientering av ligander. Dette gjør at SLB system for å tjene som en reduksjonistisk tilnærming i dissekere tHan bidrag fra hvert av reseptorer og ligander for dannelse av IS og dynamikken i ER. Den viktigste funksjonen i SLBs er at forskerne kan kombinere denne teknikken med høyoppløselige bilde tilnærminger, for eksempel konfokal og TIRF mikroskopi. Innføringen av STED mikros ytterligere øker denne fordelen, og gir enestående innsikt i IS forskning og dens kliniske applikasjoner.
En potensiell kritikk av dette systemet er at SLB ikke i tilstrekkelig grad å etterligne den komplekse overflaten av en APC, og dermed gi opphav til potensielt ikke-fysiologiske anatomiske trekk i de resulterende synapser. Mens det er sant at den begrensede repertoar av overflatemolekyler på SLB ikke fullt ut rekapitulere den heterogent befolket overflaten av en APC, kan denne grensen også være fordelaktig ved at det tillater forskere for å bestemme innvirkningen av individuelle reseptor og ligand interaksjoner på synapse dannelse .
Ther er flere viktige trinn i prosessen. Blant de mest kritiske er at oksydasjon av liposomene forebygges ved konstant ved hjelp av argon for å fortrenge oksygen i røret, og løsningen, for eksempel i trinn 1,10, 2,6 og 2,11. Oksidasjon av lipidene vil resultere i redusert lipid mobilitet, og dermed hindrer muligheten for overflateproteiner for å bevege seg fritt og delta i synaptisk strukturering. Likeledes er det også viktig å fjerne all kloroform i liposomet ved lyofilisering (trinn 1.2). Etter bestemmelse av proteintetthet i det ytre lipid bilaget, er det viktig først å dispergere silikonperler til en homogen suspensjon uten klynger. Om nødvendig, kan sonikering av perler anvendes. I montering av SLB, de tidlige trinnene (5,1 til 5,8), karakterisert ved at dekkglass er renset, dråpene er plassert, og dekkglass er festet er avgjørende. En feil i noen av disse kan nødvendiggjøre starter eksperimentet over (fra begynnelsen av § 5). Av denne grunn er detgod praksis å rengjøre flere Dekk enn vil være nødvendig for å spare tid i tilfelle et uhell.
Non-clustering er den hyppigste spørsmålet når du arbeider med dette systemet. Hvis, når visualisere cellene i det siste trinnet, unnlater man å finne noen fluorescerende synapser, er det noen få skritt som kan tas. En annen flekk for beslektede celleoverflate-reseptoren kan tilsettes til kammeret for å verifisere at cellen ikke har dannet en synapse med bilaget, mens celler kan feste seg ikke-spesifikt til glass dekkglass eller to-lags overflate, postsynaptisk-overflateproteiner involvert bør vises som atskilte klynger på planet for den celle dobbeltlag-grensesnitt, mens unengaged overflateproteiner bør fremstå som diffus farging rundt hele omkretsen av cellen. Dersom denne metoden svikter, bør man ta sine celler via strømningscytometri for å sikre at den bestemte markøren man håper å studere uttrykkes i tilstrekkelig mengde på celleoverflaten. Viss overflate proteins er kjent for å være nedregulert i løpet av lang sikt in vivo kultur.
Mens denne protokollinformasjon spesifikt hvordan å visualisere NK-celle synapse formasjon, kan SLB-systemet brukes til å studere synapse-dannelse i en hvilken som helst immunocytt tenkelig enkelt ved substitusjon av den primære ligand i trinn 5.11. Multippel-ligander kan også tilsettes samtidig. Man trenger heller ikke bruke en streptavidin-biotin system for å følge de overflateproteiner i bilaget. Nikkel-NTA: histidin interaksjoner er også levedyktig. Imidlertid, på grunn av den høye styrke og spesifisitet av streptavidin: biotin interaksjonen, foretrekker vårt laboratorium dette systemet. Man kan også variere konsentrasjonen av celler er lagt ut på bilaget fra den foreskrevne tettheten i trinn 5.13, så vel som varigheten av den etterfølgende inkubasjonsperioden for å observere synapser på ulike stadier av modnings. Dette kan også gjøres levende, selv om dette selvfølgelig utelukker muligheten for å visualisere intracellulær structures (med mindre de allerede er merket med en smeltet fluorescerende tag; vår lab bruker noen slike endrede cellelinjer). På grunn av høy grad av tilpasning mulig i denne protokollen, kan man bruke vanlig SLB teknikk, sammen med STED bildebehandling, for å løse et utrolig variert utvalg av spørsmålene i immunologi, cellebiologi, og biokjemi, inkludert grunnleggende lipid dynamikk 15, synapse formasjon 16, intracellulær signalisering 17, og tumorcellemetastase 18.
The authors have nothing to disclose.
We thank Emily Mace and Malini Mukherjee for imaging and deconvolution analysis. Work in the Liu laboratory was supported in part by the Baylor-UTHouston Center for AIDS Research Core Support Grant number AI36211 from the National Institute of Allergy and Infectious Diseases, the Caroline Wiess Law Fund for Research in Molecular Medicine, Texas Children’s Hospital Pediatric Pilot Research Fund, and the Lymphoma SPORE Developmental Research Program from Baylor College of Medicine and the Methodist Research Institute.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Purpose |
18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine |
Avanti | 850375C | Liposome preparation |
18:1 Biotinyl Cap PE 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl) (sodium salt) |
Avanti | 870273C | Liposome preparation |
Argon gas, compressed | Airgas | UN1006 | Liposome preparation |
A lyophilizer | Labconco | Freezone 7740020 | Liposome preparation |
Lyophilizer tubes | Labconco | 7540200 | Liposome preparation |
Chromatography Columns | Santa Cruz | sc-205558 | Liposome preparation |
1 M Tris pH 8.0 | Ambion | AM9856 | Liposome preparation |
5 M NaCl | Ambion | AM9759 | Liposome preparation |
Octyl-β-D-glucopyranoside | Sigma-Aldrich | O1008 | Liposome preparation |
Dialysis tubing | Spectrum Labs | 132676 | Liposome preparation |
96-well V-bottom polystyrene plate (untreated) | Corning | 3896 | antibody density determination |
Non-functionalized silica beads | Bangs Laboratories | SS06N | antibody density determination |
FACS tubes | Fisher Scientific | 14-959-2A | antibody density determination |
QuantumTM MESF beads | Bangs Laboratories | Variable | antibody density determination |
Casein | Sigma-Aldrich | C0875 | Lipid bilayer preparation |
HEPES buffered saline + 1% HSA | Homemade | Lipid bilayer preparation | |
Streptavidin | Life technologies | 434301 | Lipid bilayer preparation |
Fluorescently-labeled biotinylated protein | Homemade | Lipid bilayer preparation | |
ibidi Sticky-Slide VI 0.4 | ibidi | 80608 | Lipid bilayer preparation |
25×75 mm glass coverslip | ibidi | 10812 | Lipid bilayer preparation |
Hydrogen peroxide (30%) | Fisher Scientic | BP2633 | Lipid bilayer preparation |
Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 258105 | Lipid bilayer preparation |
D-Biotin | Invitrogen | B20656 | Lipid bilayer preparation |
Lens paper | VWR | 54826-001 | For imaging |
Type F Immersion Oil | Leica | 11 513 859 | For imaging |
A Leica TCS STED microscope | Leica | For imaging |