We describe here a combination of the glass-supported lipid bilayer technique of forming immunological synapses with the super-resolution imaging technique of stimulated emission depletion (STED) microscopy. The goal of this protocol is to provide users with the instructions necessary to successfully carry out these two techniques.
The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has been in the study of immunological synapse formation, due to the ability of the glass-supported planar lipid bilayers to mimic the surface of a target cell while forming a horizontal interface. The recent advances in super-resolution imaging have further allowed scientists to better view the fine details of synapse structure. In this study, one of these advanced techniques, stimulated emission depletion (STED), is utilized to study the structure of natural killer (NK) cell synapses on the supported lipid bilayer. Provided herein is an easy-to-follow protocol detailing: how to prepare raw synthetic phospholipids for use in synthesizing glass-supported bilayers; how to determine how densely protein of a given concentration occupies the bilayer’s attachment sites; how to construct a supported lipid bilayer containing antibodies against NK cell activating receptor CD16; and finally, how to image human NK cells on this bilayer using STED super-resolution microscopy, with a focus on distribution of perforin positive lytic granules and filamentous actin at NK synapses. Thus, combining the glass-supported planar lipid bilayer system with STED technique, we demonstrate the feasibility and application of this combined technique, as well as intracellular structures at NK immunological synapse with super-resolution.
La sinapsis inmunológica (IS) se encuentra en una coyuntura crítica para la activación de las células y la función 1. Es el medio principal por el cual la presentación de antígenos y la inmunidad mediada por células se llevan a cabo. Los estudios microscópicos tempranos de la formación de sinapsis utilizan un sistema conjugado célula-célula 2. La principal limitación de este enfoque es que la mayoría de los conjugados será visto 'en el perfil', por así decirlo, restringiendo así la vista del observador de la propia estructura sináptica. En 1999, el laboratorio Dustin dirigida esta limitación mediante la utilización de la técnica de 3 bicapa lipídica apoyado de vidrio (SLB), que había sido pionero anteriormente por el laboratorio de 4,5 McConnel. Este enfoque dispuesto de las células presentadoras de antígenos (APC) en favor de una superficie plana apoyado lípidos de vidrio, en la que las proteínas se podrían unir y se mueven libremente en dos dimensiones. Usando este método, Dustin y sus colegas fueron capaces de mirar directamente hacia arriba en tél sinapsis mediante microscopía de fluorescencia de alta resolución, y por primera vez conseguir una mirada "cara a cara" en la estructura de la SI.
Con el uso del sistema SLB, el detalle con que la SI puede ser visualizado se ha restringido solamente por las limitaciones de las técnicas de imagen actuales 6-8. El uso de técnicas de iluminación estándar, la resolución mínima (es decir, la distancia mínima entre dos objetos distintos en el que se pueden distinguir) ha sido <200 nm sobre la base del criterio de Rayleigh 9. Este límite impide la formación de imágenes de estructuras a escala molecular muy finos que componen la sinapsis, y hasta el desarrollo de técnicas de imagen super-resolución 10-12, la visualización de estas estructuras se limita a la obtención de imágenes de células fijadas mediante microscopía electrónica.
Con el reciente advenimiento de una variedad de técnicas de super-resolución, como SIM (microscopía de iluminación estructurada), PALM (microscopía fotoactivado localización), STORM (microscopía óptica reconstrucción estocástico), y STED 10-12, los investigadores pueden ahora estudiar estas estructuras sinápticas en un detalle sin precedentes, que tiene a su vez proporciona una comprensión cada vez aclarado de la SI. Las ventajas de microscopía STED se han descrito antes del 13. Aquí describimos super-resolución de imagen con microscopía STED equipado con el láser de 660 nm agotamiento de nuevo desarrollo. En comparación con el láser convencional agotamiento de 592 nm, el láser de 660 nm permite una selección más amplia de colorantes fluorescentes (ver http://nanobiophotonics.mpibpc.mpg.de/old/dyes/), especialmente en estos fluoróforos rojos.
Otras publicaciones han descrito la imagen STED de las sinapsis de las células NK en portaobjetos de vidrio recubiertas de anticuerpos 13,14. Aquí, el sistema SLB se combina con super-resolución STED microscopía para estudiar la sinapsis de las células NK. Esta técnica tiene la ventaja sobre anticuerpoportaobjetos recubiertos de ser un mosaico fluido, en el que las proteínas de la superficie embebidos pueden moverse libremente en una superficie bidimensional plana (plano xy). Esto imita más fielmente la superficie orgánica y móvil de una célula diana, y en consecuencia mejor recapitula la formación de una sinapsis inmune fisiológicamente relevante.
El objetivo de este protocolo es proporcionar al usuario final con una descripción detallada de cómo reproducir la sinapsis inmunológica de las células NK mediante la combinación del sistema SLB y super-resolución STED microscopía. Además, proporcionará al usuario final con las medidas necesarias para: preparar los liposomas, construir bicapas proteínas incrustado, determinar la densidad de la proteína en las bicapas lipídicas, y adquirir imágenes de super-resolución mediante microscopía STED. Estas técnicas no se limitan al campo de la inmunología, y pueden ser ampliamente utilizados en una variedad de disciplinas.
La novedad de este estudio es que combina la técnica de SLB con STED para estudiar las sinapsis de las células NK. Estudios anteriores han fotografiado la bicapa lipídica con TIRF para estudiar la formación de sinapsis de células T 8 y señalización tráfico molécula en la membrana plasmática 6. Otros han descrito STED de formación de imágenes de las sinapsis de células NK utilizando portaobjetos de vidrio recubiertas de anticuerpos 13,14. El método híbrido descrito en este documento además se basa en estos esfuerzos por imágenes de la sinapsis de las células NK con la mayor claridad ofrecida por imágenes de super-resolución en la superficie bicapa lipídica, que mejores modelos de la superficie dinámica de un APC.
Aunque SLBS son membranas artificiales que carecen de citoesqueleto, balsas de lípidos, y otros ligandos que células diana, actuales o APCs poseen, esta técnica puede recapitular características importantes tales como la movilidad y la orientación de los ligandos. Esto permite que el sistema SLB para servir como un enfoque reduccionista en la disección de tque la contribución de los receptores y ligandos individuales para la formación de la SI y la dinámica de la IS. La característica más importante de SLBS es que los investigadores pueden combinar esta técnica con enfoques de imágenes de alta resolución, como la microscopía confocal y TIRF. La introducción de la microscopía STED aumenta aún más esta ventaja, y proporciona información sin precedentes en es la investigación y sus aplicaciones clínicas.
Una crítica potencial de este sistema es que el SLB no imita adecuadamente el complejo de superficie de una APC, dando así lugar a características anatómicas potencialmente no fisiológicas en las sinapsis resultantes. Si bien es cierto que el limitado repertorio de moléculas de superficie en el SLB no recapitula totalmente la superficie heterogénea poblado de un APC, este límite también puede ser ventajoso en que permite a los investigadores determinar la influencia de las interacciones de los receptores y el ligando individuales en la formación de sinapsis .
Taquí hay varios pasos cruciales en el proceso. Entre los más crítico es que la oxidación de los liposomas puede prevenir mediante el uso constante de argón para desplazar el oxígeno en el tubo y solución, tal como en los pasos 1.10, 2.6, y 2.11. La oxidación de los lípidos dará lugar a la movilidad de los lípidos disminuido, impidiendo así la capacidad de las proteínas de la superficie de moverse libremente y participar en la estructuración sináptica. Del mismo modo, también es crucial para eliminar todo el cloroformo en el liposoma mediante liofilización (paso 1.2). En la determinación de la densidad de proteína en la bicapa lipídica, que es de importancia para dispersar primero los granos de silicio en una suspensión homogénea libre de clusters. Si es necesario, la sonicación de las perlas se puede aplicar. En el montaje de la SLB, los primeros pasos (05.01 a 05.08) en los que los cubreobjetos se limpian, las gotas se colocan, y cubreobjetos está fijado son vitales. Un error en cualquiera de estos puede requerir de comenzar el experimento más (desde el inicio de la sección 5). Por esta razón, esbuenas prácticas para limpiar más cubreobjetos que serán necesarios para ahorrar tiempo en caso de un percance.
No agrupación es el problema más frecuente cuando se trabaja con este sistema. Si, al visualizar las células en la etapa final, uno no puede encontrar ningún sinapsis fluorescentes, hay algunos pasos que se pueden tomar. Otra mancha para el receptor de la superficie celular cognado se puede añadir a la cámara para verificar que la célula no se ha formado una sinapsis con la bicapa mientras que las células pueden adherirse de forma no específica a la superficie de cubreobjetos de vidrio o bicapa, proteínas de la superficie sinápticamente implicados-debería aparecerá como grupos distintos en el plano de la interfaz célula-bicapa, mientras que las proteínas de superficie unengaged deben aparecer como tinción difusa alrededor del perímetro de la célula. En caso de que este método falla, se debe comprobar sus células a través de citometría de flujo para asegurar que el concreto marcador uno tiene la esperanza de estudiar se expresa en abundancia adecuada en la superficie celular. Cierta prote superficieins se sabe que son las reguladas por encima de largo plazo en la cultura vivo.
Si bien los detalles de este protocolo específicamente cómo visualizar la formación de sinapsis de las células NK, el sistema SLB puede ser usado para estudiar la formación de sinapsis en cualquier inmunocitos imaginable simplemente por sustitución del ligando primario en el paso 5,11. Múltiples ligandos también se pueden añadir simultáneamente. Uno también no necesita utilizar un sistema de estreptavidina-biotina para adherir las proteínas de la superficie dentro de la bicapa. Níquel-NTA: interacciones de histidina también son viables. Sin embargo, debido a la alta resistencia y especificidad de la estreptavidina: interacción biotina, nuestro laboratorio prefiere este sistema. Uno puede también variar la concentración de células añadidas en la bicapa de la densidad prescrita en el paso 5,13, así como la duración del periodo de incubación posterior a fin de observar las sinapsis en diferentes etapas de maduración. Esto se puede hacer incluso en directo, aunque esto, por supuesto, excluye la posibilidad de visualizar str intracelulaructures (a menos que ya están etiquetados con una etiqueta fluorescente fundido; nuestro laboratorio utiliza un par de dichas líneas celulares alterados). Debido al alto grado de personalización posible en este protocolo, se puede utilizar la técnica básica SLB, junto con imagen STED, para hacer frente a una gama muy variada de preguntas en inmunología, biología celular y bioquímica, incluyendo la dinámica de lípidos básicos 15, la formación de sinapsis 16, de señalización intracelular 17, y la metástasis de las células tumorales 18.
The authors have nothing to disclose.
We thank Emily Mace and Malini Mukherjee for imaging and deconvolution analysis. Work in the Liu laboratory was supported in part by the Baylor-UTHouston Center for AIDS Research Core Support Grant number AI36211 from the National Institute of Allergy and Infectious Diseases, the Caroline Wiess Law Fund for Research in Molecular Medicine, Texas Children’s Hospital Pediatric Pilot Research Fund, and the Lymphoma SPORE Developmental Research Program from Baylor College of Medicine and the Methodist Research Institute.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Purpose |
18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine |
Avanti | 850375C | Liposome preparation |
18:1 Biotinyl Cap PE 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl) (sodium salt) |
Avanti | 870273C | Liposome preparation |
Argon gas, compressed | Airgas | UN1006 | Liposome preparation |
A lyophilizer | Labconco | Freezone 7740020 | Liposome preparation |
Lyophilizer tubes | Labconco | 7540200 | Liposome preparation |
Chromatography Columns | Santa Cruz | sc-205558 | Liposome preparation |
1 M Tris pH 8.0 | Ambion | AM9856 | Liposome preparation |
5 M NaCl | Ambion | AM9759 | Liposome preparation |
Octyl-β-D-glucopyranoside | Sigma-Aldrich | O1008 | Liposome preparation |
Dialysis tubing | Spectrum Labs | 132676 | Liposome preparation |
96-well V-bottom polystyrene plate (untreated) | Corning | 3896 | antibody density determination |
Non-functionalized silica beads | Bangs Laboratories | SS06N | antibody density determination |
FACS tubes | Fisher Scientific | 14-959-2A | antibody density determination |
QuantumTM MESF beads | Bangs Laboratories | Variable | antibody density determination |
Casein | Sigma-Aldrich | C0875 | Lipid bilayer preparation |
HEPES buffered saline + 1% HSA | Homemade | Lipid bilayer preparation | |
Streptavidin | Life technologies | 434301 | Lipid bilayer preparation |
Fluorescently-labeled biotinylated protein | Homemade | Lipid bilayer preparation | |
ibidi Sticky-Slide VI 0.4 | ibidi | 80608 | Lipid bilayer preparation |
25×75 mm glass coverslip | ibidi | 10812 | Lipid bilayer preparation |
Hydrogen peroxide (30%) | Fisher Scientic | BP2633 | Lipid bilayer preparation |
Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 258105 | Lipid bilayer preparation |
D-Biotin | Invitrogen | B20656 | Lipid bilayer preparation |
Lens paper | VWR | 54826-001 | For imaging |
Type F Immersion Oil | Leica | 11 513 859 | For imaging |
A Leica TCS STED microscope | Leica | For imaging |