Introduction
Il sistema nervoso enterico (ENS) è organizzata in due plessi ganglionated incorporato all'interno della parete del tubo digerente 1. Questi circuiti neurali intramuscolari, plesso mienterico (MP) e sottomucosa plesso (SMP), sono composti da neuroni e glia enterica (Figura 1) 2. Il deputato e SMP regolano gastrointestinali (GI) funzioni come la motilità intestinale e l'assorbimento epiteliale e la secrezione, rispettivamente, 3. Glia enterica si trovano in prossimità di neuroni all'interno gangli ma le popolazioni di glia enterica esistono anche all'interno di interconnessione tratti di fibre e porzioni extra-gangliari della parete intestinale 3,4. Glia enterici sono stati originariamente credeva di fornire solo il supporto nutritivo per i neuroni. Tuttavia, studi recenti suggeriscono che le interazioni neuroni-glia sono essenziali per ENS funziona 5,6. Ad esempio, i dati mostrano che glia enterica "ascoltare" per l'attività neuronale 7e modulare circuiti neuronali 6,8, proteggere i neuroni enterici dallo stress ossidativo 9 e sono in grado di generare nuovi neuroni enterici in risposta al danno 10,11. Il protocollo presentato in questa tecnica offre un metodo semplice e robusto per esaminare la complessa interazione tra neuroni e glia enterica utilizzando in situ intracellulare Ca 2+ imaging.
Ca 2+ è una molecola di segnalazione ubiquitario nelle cellule eccitabili e svolge un ruolo essenziale in eventi di segnalazione sinaptica nel sistema nervoso 12. Eccitazione dei neuroni o glia enterica suscita un aumento della concentrazione citoplasmatica di Ca 2+ sia afflusso attraverso Ca 2+ canali -permeable o Ca 2+ rilascio dai depositi intracellulari di calcio. Imaging Ca 2 + transitori in neuroni e glia con coloranti fluorescenti è un fondato e tecnica ampiamente utilizzata per studiare l'organizzazione funzionale e dinamica dell'ENS 13-17. Ca 2+ di imaging ha dimostrato di essere uno strumento importante per studiare i segmenti di tessuto GI intatte per chiarire la diffusione di eccitabilità attraverso ICC reti pacemaker 18 e intestino muscolatura liscia 19,20. Esso consente ai ricercatori di sondare un ampio spettro di parametri fisiologici e fornisce informazioni sia la loro distribuzione spaziale e la dinamica temporale. Le celle possono essere efficacemente colorati in modo minimamente invasivo utilizzando indicatori fluorescenti membrana permeabile e protocolli di colorazione ottimizzati 21. Ciò offre la possibilità di controllare un gran numero di neuroni e glia enterica in preparazioni funzionalmente conservati 14-16,22, così come in vivo 23. -Montaggio interi preparati di tessuto sono di massa caricato con un alta affinità Ca 2+ colorante indicatore come Fluo-4 che ne aumenta la fluorescenza quando si lega a Ca 2+. Le variazioni di fluorescenza sono registrate da una telecamera CCD e anazati digitalmente 6. L'avvento di Ca 2+ ha fornito la possibilità di controllare neuroni e cellule gliali interazioni, risposta a vari stimoli, e il coinvolgimento di questi tipi di cellule nei processi gastrointestinali in tempo reale.
In situ Ca 2+ di imaging ha dato grande intuizione dei meccanismi di segnalazione di neuroni enterici e glia e possiede diversi vantaggi rispetto ai modelli di coltura cellulare 6,24. In primo luogo, in situ preparati mantenere l'ambiente di matrice nativa di neuroni e glia e lasciano la maggior parte delle loro connessioni con il tessuto intatto bersaglio. In secondo luogo, la genetica e la morfologia di colta glia enterica sono significativamente modificati rispetto al vivo 6,24. In terzo luogo, molte interazioni eterotipiche si perdono in colture cellulari primarie e questo limite valutazione interazioni cellula-cellula. Anche se le cellule coltivate sono particolarmente adatte per le indagini di proprietà fondamentali, la loro usefulness per studiare le interazioni complesse tra glia e neuroni enterici è limitata. Indagare interazione neuroni-glia utilizzando un approccio in situ è fisiologicamente più rilevante come i percorsi sinaptici rimangono intatti 25. Rispetto agli approcci di coltura cellulare, un approccio in situ offre migliori condizioni per la comprensione sistematica delle interazioni complesse tra i neuroni e glia enterica. Inoltre, l'organizzazione planare del plesso ganglionated nei preparati tutto il montaggio è ideale per l'imaging fluorescente intracellulari di Ca 2+ transitori e questa tecnica offre un approccio diretto per valutare l'attività dei neuroni-glia nella ENS.
Protocol
NOTA: Le procedure seguenti che coinvolgono il tessuto da animali da laboratorio sono coerenti con le linee guida AVMA per l'eutanasia degli animali 2013 e sono state approvate in anticipo dal Michigan State University IACUC.
1. Preparazione del tessuto
- Anestetizzare animali ricerca in una camera contenente 2,5% isoflurano in ossigeno o mettendo 3-5 ml di isoflurano liquido su un materiale assorbente sul pavimento della camera, in modo che una barriera fisica impedisce animali dal contatto diretto con l'isoflurano. Test per la profondità dell'anestesia pizzicando la zampa.
NOTA: La profondità di anestesia è ritenuto appropriato quando non c'è prelievo riflesso dell'arto posteriore. Una volta adeguatamente anestetizzato, eutanasia il mouse dislocazione cervicale - Posto l'animale in posizione supina e pulire la pelle addominale con etanolo al 70%. Utilizzare pinze per pizzicare la pelle addominale in linea mediana e usare le forbici chirurgiche per fare un supporto 6 centimetril incisione lungo la linea alba di esporre gli organi digestivi interni.
- Utilizzare pinze smussato per individuare ed esporre l'ileo all'interno del peritoneo. Tagliare il mesentere ileale / colon con le forbici e iniziare a svelare l'intestino.
- Una volta che la lunghezza dell'intestino è adeguatamente dipanato, intercettato distale dell'intestino allo stomaco e prossimale al cieco per una preparazione ileo. Per una grande preparazione intestinale, tagliare il distale colon al cieco e prossimale al retto.
- Rimuovere rapidamente il segmento intestinale e metterlo in un bicchiere con i media DMEM / F12 addizionato con 3 micron nicardipina cloridrato e 1 micron scopolamina cloridrato (di seguito denominato "media") su ghiaccio. L'aggiunta di questi inibitori facilita microdissezione e immagini successive paralizzando la muscolatura liscia dell'intestino.
- Segmento Taglio di interesse (ad esempio, digiuno, ileo, colon distale o prossimale) sulla base di marcatori anatomici stabiliti. Tipicamente utilize tessuto dal ileo distale o del colon distale. Tuttavia, utilizzare la stessa procedura di base per isolare, di carico e di immagine neuroni e glia mienterici in tutte le regioni intestinali.
- Rimuovere un piccolo segmento (4-6 cm) di un segmento dell'intestino desiderato e posto in una capsula di Petri Sylgard rivestite pieno di mezzi refrigerati.
- Fissare l'estremità prossimale e distale del segmento intestinale con perni di insetti e aprire il tubo intestinale facendo una dritta, longitudinale tagliare lungo il confine mesenterica.
- Tessuto piatto sotto leggera tensione con il lato mucosa e attenzione sezionare via strato mucoso utilizzando una pinza sottile (5 # e # 5/45 di lavoro migliore) e forbici primavera molto fini Pin.
NOTA: La rimozione della mucosa può essere molto traumatico per il ENS se non fatto correttamente. Per i preparati di qualità, fare attenzione a limitare brusca eliminazione della mucosa dalla secchezza o raschiamento. La pratica migliore è quello di sollevare la mucosa e tagliare con le forbici sotto pregiati. - Tagliare il tessuto in preparazione più piccolos (circa 0,5 cm2) e pin in piatti di imaging (4 angoli con strato muscolare circolare verso l'alto) immessi sul ghiaccio con mezzi freschi.
- Sezionare con attenzione via muscolo circolare da prendere in giro a parte con le pinzette sottili per esporre il plesso mioenterico. Evitare eccessivo allungamento.
- Porre piatto di imaging indietro soluzione ghiaccio e il cambiamento con mezzi freschi.
- Preparare 2 ml di miscela enzimatica per piatto [dispasi 1 U / ml (4.48 mg / 8 ml), Collagenase Tipo II 150 U / ml (5,45 mg / 8 ml) nei media].
- Rimuovere piatti da ghiaccio e aggiungere il mix enzima dal punto 1.13.
- Incubare piatti a temperatura ambiente per 15 minuti con 5% di CO 2/95% di aria.
- Preparazioni di tessuto Lavare con i media 3 volte e angoli re-pin.
2. Loading Fluo-4 Dye
NOTA: Evitare photobleaching lavorando con la luce limitata durante la manipolazione di coloranti fluorescenti e tessuto carichi di indicatore coloranti.
- Preparare 4 mM Fluo-4 soluzione di carico.
- Aggiungere 1,5 ml media e 1,2 ml di una probenecid magazzino 250 mm ad un'aliquota di 1,5 ml di 4 mm Fluo-4 stock. 4 mM Fluo-4 stock viene preparato aggiungendo 11,4 ml di Pluronic F-127 (20% in DMSO; integrato con 0,25% cremaphor-EL) a 50 mg di Fluo-4, AM.
- Incubare preparazioni in Fluo-4 soluzione di carico per 45 minuti in un incubatore buio a 37 ° C.
- Togliere dal incubatore e lavare preparazioni di media 3 volte.
- Mezzi di scambio per supporti contenente 200 mM probenecid e incubare 15 min a 37 ° C prima di imaging.
NOTA: Probenecid è un farmaco che inibisce trasportatori di resistenza ai farmaci in neuroni. L'aggiunta di questo farmaco inibisce la capacità dei neuroni di estrudere coloranti e migliora etichettatura neuronale. Bulk-caricamento di Ca 2+ indicatori coloranti in assenza di probenecid produce principalmente gliali loading cellule. L'aggiunta di probenecid permette la visualizzazione delle risposte neuronali e gliali. - Preparare Modified KreBuffer bs.
- Fare un tampone Krebs modificato tale che le concentrazioni finali (in mM) dei componenti sono come segue: 121 NaCl, KCl 5,9, CaCl 2 2,5, 1,2 MgCl 2, 1.2 NaH 2 PO 4, 10 HEPES, 21.2 NaHCO 3, 1 piruvico acidi e 8 glucosio (pH aggiustato a 7,4 con NaOH). Aggiungere 3 micron nicardipina e 1 micron scopolamina per inibire le contrazioni muscolari durante Ca 2+ imaging e tutto il montaggio dissezioni.
3. Imaging e analisi
NOTA: utilizzare almeno un impianto di imaging di base con una sorgente di luce fluorescente, microscopio, una camera CCD di qualità e adeguato software di acquisizione. Variare l'aggiunta di altri componenti a seconda della sorgente di luce e l'applicazione specifica. Una ruota del filtro e otturatore devono essere usati con una sorgente di luce allo xeno ad arco tradizionale. Tuttavia, fonti di luce LED e sistemi di illuminazione non richiedono tali componenti.
- Posizionare il recording camera sotto il microscopio e utilizzando un sistema di perfusione a gravità con più serbatoi siringa riscaldati stabilire un tasso perfusione continua di 2-3 ml / min a 37 ° C tampone Krebs. Assicurati di evitare la formazione di bolle d'aria sia nella linea di ingresso e di aspirazione collegato ad una trappola del vuoto.
- Portare il plesso desiderati a fuoco in condizioni di illuminazione in campo chiaro. Evitare sovraesposizione del tessuto, che può portare a foto sbiancamento.
- Esaminare il Fluo-4 di carico all'interno dei gangli e selezionare gangli sano per l'imaging. Malsano gangli / danneggiati esporranno autofluorescenza o puntata morfologia e non devono essere utilizzati per l'imaging.
- Una volta selezionato ganglio, deviare il percorso della luce per fotocamera e di ottenere immagini dal vivo con il software di acquisizione delle immagini. Assicurarsi che ganglio è a fuoco e impostare l'immagine di tasso di acquisizione e di esposizione volte.
NOTA: i tassi di acquisizione delle immagini e tempi variano a seconda degli eventi investigatori vogliono registrare. Per la maggior parte degli esperimenti, le immaginisono tradizionalmente acquisita a 0,5-1 Hz per le cellule gliali e fino a 2-10 Hz per i neuroni, perché gliali Ca 2+ risposte non sono così rapidi come Ca 2+ transitori nei neuroni. - Inizia esperimento e stabilire attività di base per 30 sec.
- Applicare farmaci preriscaldate di interesse come agonisti e antagonisti del recettore utilizzando il sistema di perfusione a gravità ad una velocità di 2-3 ml / min. Seguire applicazione di agonisti / antagonisti ritornando ad una perfusione di tampone normale e consentire un periodo di wash / recupero di almeno 10 min.
NOTA: I tempi Drug Application varieranno a seconda del composto individuale e disegno sperimentale. In generale, un'applicazione 20-30 sec di agonista è sufficiente per attivare G-proteine recettori accoppiati in neuroni e cellule gliali. Tuttavia, i canali ionici ligando-dipendenti (come i recettori nicotinici) richiedono tempi di applicazione di non più di 5-10 sec. Ulteriori esposizioni durata causerà canali ionici ligando gated a Dese rapidamentensitize. Antagonisti dovrebbero essere applicate per circa 3-15 minuti per garantire la completa blocco delle vie del recettore. Tuttavia, questa è una generalizzazione lordo e investigatori deve sempre ottimizzare qualsiasi farmaco sperimentale in loro particolare paradigma. - Interrompere la registrazione e visualizzazione di film time-lapse dell'esperimento. Selezionare con attenzione regioni di interesse (ROI) utilizzando il software di analisi di immagine appropriata.
- Utilizzare software per normalizzare e confrontare l'intensità fluorescenza ROI contro il suo valore di base fluorescente iniziale. Le variazioni nella fluorescenza normalizzata sono direttamente proporzionali alle variazioni [Ca 2+].
- Utilizzare una modifica di un metodo descritto in precedenza 26 con Af / F = ((F 1 - F 0) / F 0) ROI - ((F 1 - F 0) / F 0) sfondo, dove F1 è la fluorescenza in un dato point e F0 è la fluorescenza basale, per migliorare la precisione di valutazione. Questo aiuti modificanella riduzione del rumore da variazioni di fluorescenza in preparati tissutali che mostrano il movimento dello strato muscolare sottostante plesso mioenterico.
Representative Results
L'uso corretto di questa tecnica permette ai ricercatori di misurare con precisione intracellulare Ca 2+ [Ca 2+] i transitori nei neuroni enterici e glia in tutto il montaggio preparazioni di tessuto. Un esempio rappresentativo di un agonista-evocato Ca 2+ risposte in glia all'interno di un ganglio myenteric dal colon del mouse è mostrato in Video 1. I risultati seguenti hanno lo scopo di illustrare alcuni risultati rappresentativi che abbiamo ottenuto con questo metodo. In primo luogo, la figura 2 illustra i risultati di un esperimento di misurazione gliali enteriche [Ca 2+] i cambiamenti in risposta alla stimolazione con ATP all'interno cavia del colon longitudinale plesso muscolare mienterico (LMMP) preparati. Specificamente, questa figura mostra il metodo per la corretta analisi del protocollo sperimentale sopra elencati compreso il contorno del ganglio myenteric analizzato e asterischi denotano la posizione dei neuroni enterici. Questi risultati anche illustrate la dose ottimale di un centinaio micromolar ATP sulla mobilitazione del [Ca 2+] i nella cavia glia myenteric. Questa risposta può essere utilizzata per calibrare la stimolazione gliale enterica e normalizzare risposte per testare stimoli. Avanti, Figura 3 chiarisce come selezionare correttamente regioni di interesse (ROI) che circonda le cellule gliali, mostrato con circostante cerchi gialli. Questi risultati mostrano anche le variazioni di fluorescenza desiderati in condizioni basali e in risposta a stimoli farmacologici. Infine, la Figura 4 mostra le considerazioni spaziali per la scelta glia enterica e neuroni per [Ca 2+] i risposte in preparati tutto il montaggio.
Figura 1. Organizzazione della ENS. L'ENS contiene due grandi plessi ganglionated. Il plesso mienterico si trova tra l'lstrati muscolari ongitudinal e circolari. Il plesso sottomucosa si trova tra la mucosa e lo strato muscolare circolare. L'ENS è esclusivamente composto da neuroni e glia enterica. Tratti di fibre del nervo collegano gangli. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. enterica glia nella cavia del colon plesso mioenterico rispondere alle atp in situ. (A) Fluo-4 fluorescenza in un ganglio mienterici (illustrato a tratteggio) in condizioni basali. Le frecce indicano spessi tratti di fibre interganglionic. (B) Dopo stimolazione con 100 mmol / L ATP, le cellule gliali, ma non i neuroni, aumentano rapidamente Fluo-4 fluorescenza indica un aumento di [Ca 2+]
Figura 3. murino S-100-GFP + cellule del colon plesso rispondere mienterico ATP in situ. (A) cellule gliali (verde) in un mouse del colon ganglio mienterico S-100-GFP + (delineati dalla linea tratteggiata). Sei regioni di interesse (ROI) che circonda le cellule gliali all'interno dei gangli sono mostrate come cerchi gialli. Le frecce indicano tratti di fibre spesse portano nel ganglio. Asterischi dposizione enote di 2 neuroni enterici. (B) Stesso ganglio mostrando Rhod-2 fluorescenza in condizioni basali. (C) A seguito di stimolazione con 100 mmol / L ATP, le cellule gliali rispondono con un aumento [Ca 2+] i, come indicato da un aumento Rhod- 2 di fluorescenza. (D) Tracce corrispondente a ciascun ROI mostrato in A-C. (E) la risposta media (media ± SEM) delle 6 ROI mostrati in D 24. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. In situ imaging comunicazione enterica neurone-to-glia. (A) Immagini rappresentative (pseudocolored) da un esperimento di imaging Ca 2+ in cui un intero-mountpreparazione del plesso mioenterico è stata impugnata con l'agonista del recettore neuronale P2X7 BzATP (100 micron, 30 sec). Si noti che l'agonista neuronale provoca un aumento della fluorescenza Fluo4 nel neurone (A ') prima che le cellule circostanti enteriche gliali (A "). (B) Analisi della variazione di fluorescenza nel tempo glia (blu) e neuroni (rosso ) in seguito all'applicazione del agonisti neuronale, BzATP. (C) neuronale e risposte gliali a BzATP in tampone normale (linee continue) e in tampone contenente bassa Ca 2+ e Mg 2+ (linee tratteggiate) per potenziare i recettori P2X7 neuronali 13. Si prega clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Video 1. Agonist-evocato Ca 2+ risposta glia enterica insitu. Questo video mostra un ganglio myenteric dal mouse colon distale caricato con il Ca 2+ colorante indicatore, Fluo-4. L'agonista cellule gliali, ADP, viene aggiunto al bagno quando indicato. ADP suscita un aumento intracellulare Ca 2+ in glia enterica come ha rilevato l'innalzamento transitorio in Fluo-4 fluorescenza. Clicca qui per vedere il video.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BubbleStop Syringe Heater | AutoMate Scientific | 10-4-35-G | |
| CaCl2 | Sigma | C3306 | |
| Collagenase, Type II, powder | Gibco | 17101-015 | |
| Dispase | Sigma-Aldrich | 42613-33-2 | |
| Dissection tools | Roboz | ||
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Fixed-stage microscope | Olympus | BX51WI | |
| Fluo-4 AM dye | Invitrogen | F-14201 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| Insect pins | Fine Science Tools | Minutien Pins | |
| iQ Live Cell Imaging Software | Andor | Andor iQ3 | |
| KCl | Sigma | P3911 | |
| MgCl2 | Sigma | M9272 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| Neo sCMOS camera | Andor | Neo 5.5 sCMOS | |
| Nicardipine | Sigma | N7510 | |
| Perfusion chamber | Custom | ||
| Peristaltic pump | Harvard Apparatus | Model 720 | |
| Pluronic F-127 | Invitrogen | P3000MP | |
| Probenecid | Molecular Probes | P36400 | |
| Scopolamine | Sigma | S1013 | |
| Sutter Lambda DG-4 | Sutter | DG-4 | |
| Sylgard | Dow Corning | 184 | |
| Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344C |
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