In Situ Ca ²⁺ Imaging av enteric nervesystemet

Introduction

De enterisk nervesystem (ENS) er organisert i to ganglionated nervefletninger innleiret inne i veggen av fordøyelseskanalen ^1. Disse intramuskulære nevrale kretser, den myenterisk plexus (MP) og submucosal plexus (SMP), er sammensatt av enteriske neuroner og glia (Figur 1) ^2. MP og SMP regulere gastrointestinale (GI) funksjoner som intestinal motilitet og epitelial absorpsjon og sekresjon, henholdsvis ^3. Ente gliaceller ligger i umiddelbar nærhet til nevroner innenfor ganglier, men bestander av ente gliaceller også eksisterer innenfor sammenhengende fiber traktater og ekstra ganglieblokkere deler av tarmveggen ^3,4. Enteriske gliaceller ble opprinnelig antatt å bare gi næringsstøtte til nerveceller. Men nyere studier sterkt at nevron-gliaceller interaksjoner er avgjørende for ENS fungerer ^5,6. For eksempel, data viser at mage gliaceller "lytte" til neuronal aktivitet ⁷og modulere neuronal kretser ^6,8, beskytte enteriske neuroner fra oksidativt stress ⁹ og er i stand til å generere nye enteriske nerveceller i respons til skade ^10,11. Protokollen som presenteres i denne teknisk gjennomgang gir en enkel og robust fremgangsmåte for å undersøke det komplekse samspill mellom neuroner og glia enterisk ved hjelp av in situ intracellulær Ca2 ⁺ avbildning.

Ca ²⁺ er en allestedsnærværende signalmolekyl i eksiterbare celler, og spiller en viktig rolle i synaptiske signal hendelser i nervesystemet ^12. Eksitasjon av nevroner eller ente gliaceller utløser en høyde i cytoplasma Ca ²⁺ konsentrasjon enten ved tilstrømning gjennom Ca ²⁺ -permeable kanaler eller Ca ²⁺ løslatelse fra intracellulære kalsium butikker. Imaging Ca ^{2 +} transienter i nevroner og gliaceller med fluorescerende fargestoffer er en etablert og mye brukt teknikk for å studere den funksjonelle organiseringen og dynamikkENS ^13-17. Ca ²⁺ bildebehandling har vist seg å være et viktig verktøy i å studere intakte GI vev segmenter for å belyse spredningen av oppstemthet gjennom ICC pacemaker nettverk ¹⁸ og gut glatt muskulatur ^19,20. Det gjør at forskerne å undersøke et bredt spekter av fysiologiske parametre og gir informasjon om både deres romlige fordeling og timelige dynamikk. Celler kan effektivt farget i en minimal invasiv måte ved hjelp av membran-gjennomtrengelig fluorescerende indikatorer og optimaliserte flekker protokoller ^21. Dette gir mulighet for å overvåke et stort antall av neuroner og gliaceller i enterisk funksjonelt konserverte preparater ^14-16,22, så vel som in vivo ^23. Hele-mount vevspreparater er bulk lastet med en høy affinitet Ca ²⁺ indikatorfarge som Fluo-4 som øker sin fluorescens når bundet til Ca ^2+. Endringer i fluorescens blir registrert av en CCD-kamera og analysert digitalt ^seks. Ankomsten av Ca ²⁺ gitt mulighet til å overvåke nevroner og gliaceller celle interaksjoner, reaksjonsevne til ulike stimuli, og involvering av disse celletypene i gastrointestinale prosesser i sanntid.

In situ Ca ²⁺ bildebehandling har gitt god innsikt i signalmekanismer enteriske nevroner og gliaceller og besitter flere klare fordeler i forhold til cellekultur modeller ^6,24. Først i situ forberedelser opprettholde den opprinnelige matrise miljø av nevroner og gliaceller og la hoveddelen av sine forbindelser for å målrette vev intakt. For det andre er genetikk og morfologi av kultivert ente gliaceller vesentlig endret i forhold til in vivo ^6,24. For det tredje er mange heterotypic interaksjoner tapt i primærcellekultur og dette begrenser vurdere celle-celle interaksjoner. Selv dyrkede celler er godt egnet for undersøkelse av grunnleggende egenskaper, deres usefulness for å studere komplekse interaksjoner mellom enteriske gliaceller og nevroner er begrenset. Gransker nevron-gliaceller samspill ved hjelp av en in situ tilnærming er mer fysiologisk relevant som synaptic trasé forbli intakt ^25. I forhold til cellekultur tilnærminger, en in situ tilnærmingen gir bedre vilkår for systematisk forstå intrikate samspillet mellom nevroner og ente gliaceller. Videre er den plane organiseringen av ganglionated plexus i hele monterte preparater ideell for fluoriserende billeddannelse av intracellulære Ca ^{2 +} transienter og denne teknikken tilveiebringer en grei metode for å vurdere neuron-glia aktivitet i ENS.

Protocol

MERK: Følgende prosedyrer som involverer vev fra forsøksdyr er konsistente med AVMA Retningslinjer for Avliving av dyr 2013 og ble godkjent på forhånd av Michigan State University IACUC.

1. Vevspreoarerlng

1. Bedøve forskning dyret i et kammer inneholdende 2,5% isofluran i oksygen eller ved å plassere 3-5 ml flytende isofluran på et absorberende materiale på gulvet i kammeret, slik at en fysisk barriere hindrer dyr fra direkte kontakt med isofluran. Test for anestesidybden ved å klemme footpad.
   MERK: anestesidybden er hensiktsmessig når det ikke er noe uttak refleks av hind lem. Når riktig bedøvet, avlive mus ved halshugging
2. Plasser dyret i liggende stilling og rense abdominal hud med 70% etanol. Bruk pinsett til å klemme abdominal hud på midtlinjen og bruke kirurgisk saks for å lage en 6 cm medial snitt langs linea alba å eksponere interne fordøyelsesorganer.
3. Bruk butt pinsett til å lokalisere og eksponere ileum inne i bukhinnen. Kutt ileal / tykktarm mesenterium med saks og begynne å rakne tarmen.
4. Når lengden av tarmen er tilstrekkelig rekkes opp, skjæres den distale tarmen til magen og proksimalt til cecum for en ileum preparat. For en tykktarmen forberedelse, kuttet kolon distal til cecum og proksimale til endetarmen.
5. Raskt fjerne tarmsegmentet og plassere den i et beger med DMEM / F12 media supplert med tre mikrometer nicardipinhydroklorid og 1fiM skopolamin hydroklorid (heretter omtalt som "media") på is. Tilsetningen av disse inhibitorer letter mikrodisseksjon og påfølgende avbildning av lammende tarmen glatt muskulatur.
6. Cut segment av interesse (f.eks jejunum, ileum, distal eller proksimale colon) basert på etablerte anatomiske markører. Vanligvis utilize vev fra den distale ileum eller distale colon. Imidlertid bruke den samme grunnleggende prosedyren for å isolere, last og bilde myentericus nevroner og gliaceller i alle tarm regioner.
7. Fjern et lite segment (4-6 cm) av ønsket tarmen segmentet og plasser i en Sylgard-belagt petriskål fylt med kjølt medier.
8. Sikre proksimale og distale ender av den intestinale segment med insekt pinner og åpne intestinalsonden ved å lage en rett, langsgående kutt langs mesenteriske grensen.
9. Pin vev flat under lett spenning med slimhinner side opp og nøye dissekere bort slimhinnen ved hjelp av fine tang (# 5 og # 5/45 arbeids beste) og veldig fine våren saks.
   MERK: Fjerning av slimhinnen kan være ganske traumatisk for ENS hvis det ikke gjøres riktig. For kvalitets forberedelser, ta vare å begrense brå fjerning av slimhinnen ved peeling eller skraping. Den beste praksis er å løfte slimhinner og kuttet under med fine saks.
10. Skjær vevet i mindre forberedelses (ca 0,5 cm ²⁾ og pin til bildebehandling retter (4 hjørner med sirkulære muskellaget vendt opp) plassert på is med frisk medier.
11. Nøye dissekere bort sirkulær muskel ved å erte hverandre med fine pinsett for å avsløre myentericus plexus. Unngå overdreven strekking.
12. Plassere bilde fatet tilbake på isen og endring løsning med frisk medier.
13. Forberede 2 ml enzym mix per tallerken [Dispase en U / ml (4,48 mg / 8 ml), Kollagenase Type II 150 U / ml (5,45 mg / 8 ml) i media].
14. Fjern retter fra isen og legge enzymet mix fra trinn 1.13.
15. Inkuber retter ved RT i 15 min med 5% CO _2/95% luft.
16. Vask vevspreparater med medie 3 ganger og re-pin hjørner.

2. Legge Fluo-4 Dye

MERK: Unngå fotobleking ved å arbeide med begrenset lys mens håndtering fluorescerende fargestoffer og vev lastet med indikatorfarger.

1. Forberede 4 mikrometer Fluo-4 lasting løsning.
   1. Legg 1,5 ml media og 1,2 mL av en 250 mm probenecid lager til en 1,5 mL delmengde av 4 mM Fluo-4 lager. 4 mM Fluo-4 lager blir fremstilt ved tilsetning av 11,4 ul av Pluronic F-127 (20% i DMSO, supplert med 0,25% Chremaphor-EL) til 50 pg av Fluo-4 AM.
2. Inkuber preps i Fluo-4 lasting løsningen i 45 minutter i et mørkt inkubator ved 37 ° C.
3. Fjern fra inkubatoren og vaske preparater med medie 3 ganger.
4. Byttemateriale for medier inneholdende 200 mM probenecid og inkuber i 15 minutter ved 37 ° C før avbildning.
   MERK: Probenecid er et stoff som hemmer multiresistens transportører i nerveceller. Tilsetning av dette stoffet hemmer evnen til neuroner å ekstrudere fargestoffer og øker nevronal merking. Bulk-lasting av Ca ²⁺ indikatorfarger i fravær av probenecid produserer gliacelle lasting. Tilsetningen av probenecid tillater visualisering av neuronale og gliale responser.
5. Forberede Modifisert Krebs buffer.
   1. Foreta en modifisert Krebs-buffer, slik at sluttkonsentrasjonene (i mm) av komponentene er som følger: 121 NaCl, 5,9 KCl, 2,5 _CaCl2, 1,2 _MgCl2, 1,2 NaH _{2PO 4,} 10 HEPES, 21,2 _NaHCO3, en pyrodrue syre og 8 glukose (pH justert til 7,4 med NaOH). Legg tre mikrometer nicardipin og 1fiM skopolamin å hemme muskelsammentrekninger i løpet av Ca ²⁺ bildebehandling og hel-mount disseksjoner.

3. Imaging and Analysis

MERK: Bruk minst en grunnleggende bilderigg med et fluorescerende lyskilde, mikroskop, en CCD kvalitet kamera og passende oppkjøps programvare. Variere tillegg av andre komponenter avhengig av lyskilden og spesifikk applikasjon. En filterhjulet og lukkeren må brukes sammen med en tradisjonell xenonbue lyskilde. Men, LED lyskilder og belysningssystemer ikke kreve disse komponentene.

1. Plasser recording kammeret under mikroskopet, og ved hjelp av et gravitasjonsstrømning perfusjon system med flere oppvarmede sprøyte reservoarer etablere en kontinuerlig perfusjonshastighet på 2-3 ml / min over 37 ° C Krebs-buffer. Sørg for å hindre luftbobledannelse i både inn og sugeledningen koblet til en vakuum felle.
2. Bringe de ønskede plexus i fokus i sterkt felt belysning. Unngå overeksponering vev, noe som kan føre til fotobleking.
3. Undersøke Fluo-4 lasting innen ganglier og velge sunn ganglia for bildebehandling. Usunne / skadede ganglia vil vise autofluorescence eller punktformet morfologi og bør ikke brukes til bildebehandling.
4. Når ganglion er valgt, avlede lysbanen til kamera og få levende bilde med bildet oppkjøpet programvare. Sikre at ganglion er i fokus og satt image oppkjøpet rente og eksponeringstider.
   MERK: Bildeoppkjøps priser og tider vil variere avhengig av hendelsene etterforskerne ønsker å ta opp. For de fleste eksperimenter, bilderer tradisjonelt kjøpt til 0,5-1 Hz for gliaceller og opp til 2-10 Hz for nevroner fordi glial Ca ²⁺ svarene er ikke så rask som Ca ^{2 +} transienter i nerveceller.
5. Begynn eksperiment og etablere referanse aktivitet for 30 sek.
6. Anvende forvarmes medikamenter av interesse, slik som reseptor-agonister og antagonister ved bruk av gravitasjonsstrømning perfusjon system med en hastighet på 2-3 ml / min. Følg anvendelse av agonister / antagonister ved å returnere til en perfusjon av vanlig buffer, og tillate en vaske / rekonvalesensperiode på minst 10 min.
   MERK: narkotika lukketider vil variere avhengig av den enkelte sammensatte og eksperimentell design. Generelt, er tilstrekkelig til å aktivere G-proteinkoblede reseptorer i neuroner og gliaceller en 20-30 sek anvendelse av agonist. Men ligand ionekanaler (for eksempel nikotin-acetylcholin reseptorene) krever søknad tider av ikke mer enn 5-10 sek. Ytterligere varighet eksponeringer vil føre ligand ionekanaler raskt Desensitize. Antagonister bør brukes for ca 3-15 min å sikre fullstendig blokade av reseptor trasé. Men dette er en grov generalisering og etterforskere bør alltid optimalisere en eksperimentell medisinsk sine bestemt paradigme.
7. Stopp opptak og visning time-lapse film av forsøket. Nøye utvalgte regioner av interesse (ROI-er) med riktig programvare for bildeanalyse.
8. Bruke programvare for å normalisere og sammenligne ROI fluorescerende intensitet mot sin opprinnelige baseline fluorescerende verdi. Endringer i normalisert fluorescens er direkte proporsjonal med forandringer i [Ca2 ^+].
   1. Bruke en modifikasjon av en metode som er beskrevet tidligere ved hjelp av ²⁶ AF / F = ((F ₁ - F ₀₎ / F ₀₎ roi - ((F ₁ - F ₀₎ / F ₀₎ bakgrunn, hvor F1 er fluorescensen til enhver punkt og F0 er referanse fluorescens, for å forbedre nøyaktigheten vurderingen. Denne modifikasjon hjelpemidlerå redusere støy fra fluorescens endringer i vevspreparater som viser bevegelsen av muskelen lag som ligger under den myenterisk plexus.

Representative Results

Riktig bruk av denne teknikken gjør at etterforskerne å måle intracellulær Ca ²⁺ [Ca _^2+] Jeg transienter i enteriske nevroner og gliaceller i hel-mount vevspreparater. Et representativt eksempel på en agonist-fremkalt Ca ^{2 +} responser i gliaceller innenfor et myenterisk ganglion fra musen kolon er vist i Video 1. De følgende resultater er ment å illustrere noen representative resultater har vi oppnådd med denne metoden. Først, Figur 2 illustrerer resultatene av et eksperiment som måler ente glial [Ca2 _^+] forandringer i respons på stimulering av ATP i marsvin colonic lengde myenterisk plexus muskel (LMMP) preparater. Spesielt, viser denne figur en metode for riktig analyse av den eksperimentelle protokollen beskrevet ovenfor inkludert omrisset av den analyserte myenterisk ganglion og stjernene betegner plassering av enteriske neuroner. Disse resultatene også jegllustrate den optimale dose av ett hundre mikromolar ATP på mobilisering av [Ca2 _^+] i marsvin myenterisk gliaceller. Denne responsen kan brukes til å kalibrere ente glial stimulering og normal svar på prøvestimuli. Neste, Figur 3 belyser hvordan du velger riktig regioner av interesse (Rois) rundt gliaceller, vist med omkringliggende gule sirkler. Disse resultater viser også de ønskede fluorescens endringer i henhold til basalbetingelser, og i respons til farmakologiske stimuli. Endelig Figur 4 viser de romlige betraktninger for å velge ente gliaceller og nevroner for [Ca ^2+] Jeg responser i hele monterte forberedelser.

Figur 1. Organisering av ENS. Den ENS inneholder to store ganglionated plexuses. Den myenterisk plexus ligger mellom llangsgående hull og sirkulære muskellagene. Den submucosal plexus ligger mellom slimhinner og den sirkulære muskellaget. ENS er utelukkende består av nevroner og ente gliaceller. Nerve traktene koble ganglia. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2. Ente gliaceller i marsvin colonic myentericus plexus reagerer på ATP i situ. (A) Fluo-4 fluorescens i en myenterisk ganglion (angitt ved stiplet linje) under basale betingelser. Pilene peker på tykke interganglionic fiber traktater. (B) Ved stimulering med 100 mikromol / L ATP, gliaceller, men ikke nevroner, raskt øke Fluo-4 fluorescens indikerer en økning i [Ca ^2+] (C) Ente gliaceller svare på ATP på en doseavhengig måte med 1 mmol / L utløse maksimal respons ^24. Klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figur 3. Murint S-100-GFP + celler i tarm myenterisk plexus svarer til ATP in situ. (A) S-100-GFP + gliaceller (grønt) i en mus colonic myenterisk ganglion (skissert med stiplet linje). Seks regioner av interesse (Rois) rundt gliaceller innenfor gangliene er vist som gule sirkler. Piler indikerer tykke fiber traktater som fører inn i ganglion. Stjernene deNote plassering av to enteriske nerveceller. (B) Samme ganglion viser Rhod-2 fluorescens etter basale forhold. (C) Etter stimulering med 100 mikromol / L ATP, gliaceller svare med økt [Ca ^2+] _jeg som vist ved økt Rhod- 2 fluorescens. (D) Sporer tilsvarer hvert ROI vist i A-C. (E) i gjennomsnitt respons (gjennomsnitt ± SEM) av de 6 ROIs vist i D ^24. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4. In situ avbildning av magesaft neuron-til-glia kommunikasjon. (A) Representative bilder (pseudocolored) fra en Ca ²⁺ bildebehandling eksperiment der en hel-mountFremstillingen av myenterisk pleksus ble utfordret med neuronal P2X7 reseptoragonist BzATP (100 uM, 30 sek). Legg merke til at den neuronale agonist forårsaker en økning i Fluo4 fluorescens i nervecellen (A ') før de omkringliggende enteriske gliaceller (A "). (B) Analyse av endringen i fluorescens over tid i gliaceller (blå) og neuroner (red ) etter påføring av neuronal agonist, BzATP. (C) Neuronal og glial responser til BzATP i normal buffer (heltrukne linjer) og i buffer inneholdende lav Ca2 ⁺ og Mg2 ⁺ (stiplede linjer) for å potensere neuronale P2X7-reseptorer ^13. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Video 1. Agonist-fremkalt Ca ²⁺ respons i ente gliaceller isitu. Denne videoen viser en myenterisk ganglion fra musen distal kolon lastet med Ca ²⁺ indikatorfarge, Fluo-4. Den gliacelle agonist, ADP, tilsettes til badet når dette indikeres. ADP utløser en økning i intracellulært Ca ²⁺ i ente gliaceller som observert av forbigående økning i Fluo-4 fluorescens. Klikk her for å se denne videoen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BubbleStop Syringe Heater	AutoMate Scientific	10-4-35-G
CaCl2	Sigma	C3306
Collagenase, Type II, powder	Gibco	17101-015
Dispase	Sigma-Aldrich	42613-33-2
Dissection tools	Roboz
DMSO	Sigma-Aldrich	D5879
Fixed-stage microscope	Olympus	BX51WI
Fluo-4 AM dye	Invitrogen	F-14201
Glucose	Sigma	G8270
Insect pins	Fine Science Tools	Minutien Pins
iQ Live Cell Imaging Software	Andor	Andor iQ3
KCl	Sigma	P3911
MgCl2	Sigma	M9272
NaCl	Sigma	S9888
NaH2PO4	Sigma	S8282
NaHCO3	Sigma	S6014
Neo sCMOS camera	Andor	Neo 5.5 sCMOS
Nicardipine	Sigma	N7510
Perfusion chamber	Custom
Peristaltic pump	Harvard Apparatus	Model 720
Pluronic F-127	Invitrogen	P3000MP
Probenecid	Molecular Probes	P36400
Scopolamine	Sigma	S1013
Sutter Lambda DG-4	Sutter	DG-4
Sylgard	Dow Corning	184
Temperature Controller	Warner Instruments	TC-344C