Introduction
El sistema nervioso entérico (SNE) se organiza en dos plexos ganglionares incrustados dentro de la pared del tubo digestivo 1. Estos circuitos neuronales intramusculares, el plexo mientérico (MP) y el plexo submucoso (SMP), se componen de neuronas y glía entérica (Figura 1) 2. El MP y SMP regulan gastrointestinales (GI) funciones tales como la motilidad intestinal y la absorción del epitelio y secreción, respectivamente 3. Glía entérica se encuentran en las proximidades de las neuronas en los ganglios, pero las poblaciones de la glía entérica también existen dentro de la interconexión de los tractos de fibras y porciones extra-ganglionares de la pared intestinal 3,4. Glia entéricas se creía originalmente para proporcionar sólo un apoyo nutritivo para las neuronas. Sin embargo, estudios recientes sugieren fuertemente que las interacciones neurona-glía son esenciales para ENS funciona 5,6. Por ejemplo, los datos muestran que la glía entérica "escuchar" a la actividad neuronal 7y modular los circuitos neuronales 6,8, proteger a las neuronas entéricas del estrés oxidativo 9 y son capaces de generar nuevas neuronas entéricas en respuesta a la lesión 10,11. El protocolo presentado en esta revisión técnica proporciona un método simple y robusto para examinar la compleja interacción entre las neuronas y la glía entérica utilizando in situ intracelular de Ca 2 + de imágenes.
Ca 2+ es una molécula de señalización ubicua en las células excitables y juega un papel esencial en los eventos de señalización sináptica en el sistema nervioso 12. La excitación de las neuronas o glía entérica provoca una elevación de la concentración citoplasmática de Ca2 +, ya sea por afluencia a través de canales de Ca2 + permeables o Ca 2 + liberación de las reservas de calcio intracelular. Imagen Ca 2 + transitorios en las neuronas y glía con tintes fluorescentes es un establecidos y técnica ampliamente utilizada para estudiar la organización funcional y dinámica deel 13-17 ENS. Formación de imágenes de Ca 2+ ha demostrado ser una herramienta importante en el estudio de los segmentos de tejido GI intactas para dilucidar la propagación de la excitabilidad a través de redes de marcapasos ICC 18 y músculo liso intestinal 19,20. Se permite a los investigadores para investigar un amplio espectro de parámetros fisiológicos y proporciona información acerca tanto a su distribución espacial y dinámica temporal. Las células se pueden teñir de manera eficiente en una forma mínimamente invasiva mediante el uso de indicadores fluorescentes de membrana permeable y protocolos de tinción optimizados 21. Esto ofrece la oportunidad de controlar un gran número de neuronas y glía entérica en preparaciones funcionalmente conservados 14-16,22, así como in vivo 23. -Todo el montaje preparaciones de tejidos son a granel cargado con una alta afinidad de Ca2 + colorante indicador como Fluo-4 que aumenta su fluorescencia cuando se une a Ca 2+. Los cambios en la fluorescencia se registran por una cámara CCD y analyzed digitalmente 6. El advenimiento de Ca 2+ proporcionó la oportunidad de supervisar las neuronas y células gliales interacciones, la capacidad de respuesta a diversos estímulos, y la participación de estos tipos de células en los procesos gastrointestinales en tiempo real.
In situ imagen Ca 2+ ha dado una gran comprensión de los mecanismos de señalización de las neuronas entéricas y glía y posee varias ventajas sobre los modelos de cultivo celular de 6,24. En primer lugar, in situ preparaciones mantener el entorno de la matriz nativa de las neuronas y glia y salen de la mayor parte de sus conexiones con el tejido diana intacta. En segundo lugar, la genética y la morfología de la glía entérica culta significativamente se alteran en comparación con 6,24 en vivo. En tercer lugar, muchas interacciones heterotípicas se pierden en cultivo de células primarias y esto limita la evaluación de las interacciones célula-célula. Aunque las células cultivadas son muy adecuadas para la investigación de las propiedades fundamentales, su usefulness para el estudio de las interacciones complejas entre células gliales y las neuronas entéricas es limitado. La investigación de la interacción neurona-glía utilizando un enfoque in situ es fisiológicamente más relevantes como las vías sinápticas permanecen intactos 25. En comparación con los enfoques de cultivo celular, un enfoque in situ ofrece mejores condiciones para comprender sistemáticamente las intrincadas interacciones entre neuronas y glía entérica. Por otra parte, la organización planar del plexo ganglionares en los preparativos de todo el montaje es ideal para imágenes fluorescentes de intracelular de Ca 2 + transitorios y esta técnica ofrece un enfoque sencillo para evaluar la actividad neuronal glía en la ENS.
Protocol
NOTA: Los siguientes procedimientos que afectan el tejido de los animales de laboratorio son consistentes con las Directrices AVMA para la Eutanasia de los Animales de 2013 y fueron aprobados previamente por la Universidad Estatal de Michigan IACUC.
1. Preparación del tejido
- Anestesiar a la investigación con animales en una cámara que contiene 2,5% de isoflurano en oxígeno o mediante la colocación de 3-5 ml de isoflurano líquido sobre un material absorbente en el suelo de la cámara, asegurando que una barrera física impide que los animales del contacto directo con el isoflurano. Prueba para la profundidad de la anestesia por pellizcar la almohadilla de la pata.
NOTA: La profundidad de la anestesia se considera apropiado cuando no hay reflejo de retirada de la extremidad posterior. Una vez anestesiado apropiadamente, la eutanasia el ratón por dislocación cervical - Colocar el animal en posición supina y limpiar la piel abdominal con etanol al 70%. El uso de fórceps para pellizcar la piel abdominal en la línea media y el uso de tijeras quirúrgicas para realizar una media de 6 cml incisión a lo largo de la línea alba para exponer los órganos digestivos internos.
- El uso de fórceps romos para localizar y exponer el íleon dentro del peritoneo. Cortar el mesenterio del íleon / colon con tijeras y comenzar desentrañar el intestino.
- Una vez que la longitud del intestino se deshizo adecuadamente, cortar el intestino distal al estómago y proximal al ciego para una preparación de íleon. Para una preparación de intestino grueso, cortar el distal del colon hasta el ciego y proximal al recto.
- Quite rápidamente el segmento intestinal y colocarlo en un vaso con medio DMEM / F12 suplementado con hidrocloruro de nicardipina 3 M y 1 mM de clorhidrato escopolamina (en adelante, "los medios de comunicación") en hielo. La adición de estos inhibidores facilita microdisección y la imagen posterior al paralizar el músculo liso intestinal.
- Segmento de corte de interés (por ejemplo, yeyuno, íleon, colon distal o proximal) basado en marcadores anatómicos establecidos. Normalmente utilize tejido del íleon distal o en el colon distal. Sin embargo, utilizar el mismo procedimiento básico para aislar, de carga y de imagen neuronas y glía mientéricas en todas las regiones intestinales.
- Retirar un pequeño segmento (6.4 cm) del segmento de intestino deseada y colocar en una placa de Petri con recubrimiento de Sylgard lleno de medios refrigerados.
- Asegure los extremos proximal y distal del segmento intestinal con alfileres de insectos y abrir el tubo intestinal haciendo una recta, a lo largo corte a lo largo del borde mesentérico.
- Tejido Pin plana bajo una ligera tensión con la cara mucosa y cuidadosamente diseccionar capa mucosa utilizando unas pinzas finas (# 5 y # 5/45 trabajo mejor) y tijeras muy finas de primavera.
NOTA: La eliminación de la mucosa puede ser muy traumático para la ENS si no se hace correctamente. Para las preparaciones de calidad, tener cuidado de limitar retirada brusca de la mucosa por descamación o raspado. La mejor práctica es levantar la mucosa y cortar debajo con tijeras finas. - Cortar el tejido en preparación menors (aproximadamente 0,5 cm 2) y el pin en platos de imagen (4 esquinas con capa muscular circular hacia arriba) se coloca en el hielo con medio fresco.
- Diseccionar cuidadosamente lejos músculo circular por las burlas aparte con pinzas finas para exponer el plexo mientérico. Evite estirar excesivo.
- Coloque el plato de imágenes de nuevo en solución de hielo y el cambio por medio fresco.
- Preparar 2 ml de mezcla de enzimas por plato [dispasa 1 U / ml (4,48 mg / 8 ml), colagenasa Tipo II 150 U / ml (5,45 mg / 8 ml) en los medios de comunicación].
- Sacar los recipientes de hielo y agregue la mezcla de enzimas del paso 1.13.
- Incubar platos a TA durante 15 min con 5% de CO 2/95% de aire.
- Preparaciones de tejidos de lavado con medios 3 veces y esquinas re-pin.
2. Carga Fluo-4 Tinte
NOTA: Evite fotoblanqueo trabajando con luz limitada durante la manipulación de los tintes fluorescentes y tejido cargadas de tintes indicadores.
- Preparar 4 mM solución de carga de Fluo-4.
- Añadir 1,5 ml de medio y 1,2 l de una acción probenecid 250 mM a una alícuota de 1,5 l de 4 mM Fluo-4 stock. 4 mM Fluo-4 stock se prepara mediante la adición de 11,4 l de Pluronic F-127 (20% en DMSO; suplementado con 0,25% Cremaphor-EL) a 50 g de Fluo-4, AM.
- Incubar preparaciones en Fluo-4 solución de carga durante 45 minutos en una incubadora oscura a 37 ° C.
- Eliminar de la incubadora y lavar las preparaciones con los medios de comunicación 3 veces.
- Medios de cambio de medio que contenía 200 mM probenecid e incubar 15 min a 37 ° C antes de formación de imágenes.
NOTA: El probenecid es un fármaco que inhibe transportistas resistencia a múltiples fármacos en las neuronas. La adición de este fármaco inhibe la capacidad de las neuronas para extruir tintes y mejora etiquetado neuronal. Carga masiva de Ca 2+ colorantes indicadores en ausencia de probenecid produce carga celular principalmente glial. La adición de probenecid permite la visualización de las respuestas neuronales y gliales. - Preparar Modificado Krebuffer de bs.
- Hacer un tampón de Krebs modificada de tal manera que las concentraciones finales (en mm) de los componentes son como sigue: 121 NaCl, 5,9 KCl, 2,5 CaCl 2, 1,2 MgCl2, 1,2 NaH 2 PO 4, 10 HEPES, 21,2 NaHCO 3, 1 pirúvico ácido y 8 de glucosa (pH ajustado a 7,4 con NaOH). Añadir 3 nicardipina mu M y 1 mM escopolamina para inhibir las contracciones musculares durante Ca 2 + de imágenes y todo el montaje disecciones.
3. Imagen y Análisis
NOTA: Utilice por lo menos un equipo básico de imágenes con una fuente de luz fluorescente, microscopio, una cámara CCD calidad y software de adquisición correspondiente. Varíe la adición de otros componentes en función de la fuente de luz y aplicación específica. Una rueda de filtro y de obturación deben usarse con una fuente de luz de arco de xenón tradicional. Sin embargo, fuentes de luz LED y sistemas de iluminación no requieren esos componentes.
- Coloque el recording cámara bajo el microscopio y el uso de un sistema de perfusión de flujo por gravedad con múltiples depósitos de jeringa con calefacción establecer una velocidad de perfusión continua de 2-3 ml / min de 37 ° C tampón Krebs. Asegúrese de que para evitar la formación de burbujas de aire, tanto en la línea de entrada y de succión conectado a una trampa de vacío.
- Traiga el plexo deseados en foco bajo iluminación de campo brillante. Evitar la sobreexposición de los tejidos, que puede conducir a la foto de blanqueo.
- Examine el Fluo-4 carga dentro de los ganglios y seleccione ganglios saludable para la imagen. Ganglios poco saludables / dañados exhibirán autofluorescencia o puntiforme morfología y no deben ser utilizados para la imagen.
- Una vez que se selecciona ganglio, desviar la trayectoria de la luz a la cámara y obtener imágenes en vivo con el software de adquisición de imágenes. Asegúrese de que ganglio está en enfocar y ajustar la tasa de adquisición de imágenes y los tiempos de exposición.
NOTA: las tasas de adquisición de la imagen y los tiempos pueden variar dependiendo de los eventos investigadores desean grabar. Para la mayoría de experimentos, las imágenestradicionalmente adquiridos en 0,5 a 1 Hz para las células gliales y hasta 2-10 Hz para las neuronas porque las respuestas glial Ca 2 + no son tan rápidos como Ca 2 + transitorios en las neuronas. - Comience experimento y establecer actividad de referencia durante 30 segundos.
- Aplicar drogas pre-calentado de interés, tales como agonistas y antagonistas del receptor utilizando el sistema de perfusión de flujo por gravedad a una velocidad de 2-3 ml / min. Siga aplicación de agonistas / antagonistas volviendo a una perfusión de tampón normal y permitir un período de lavado / recuperación de al menos 10 min.
NOTA: Los tiempos de aplicación del fármaco variará dependiendo del compuesto individual y el diseño experimental. En general, una aplicación de 20-30 segundos de agonista es suficiente para activar G-receptores acoplados a proteínas en las neuronas y células gliales. Sin embargo, los canales iónicos activados por ligando (tales como los receptores nicotínicos de la acetilcolina) requieren tiempos de aplicación de no más de 5-10 segundos. Otras exposiciones duración causarán ligando canales iónicos a Dese rápidamentensitize. Antagonistas deben aplicarse durante aproximadamente 3-15 minutos para asegurar el bloqueo completo de las vías de receptores. Sin embargo, esta es una generalización bruto y los investigadores siempre debe optimizar cualquier fármaco experimental en su paradigma particular. - Detener la grabación y vista la película de lapso de tiempo del experimento. Seleccionar cuidadosamente las regiones de interés (ROI) utilizando el software de análisis de imagen correspondiente.
- Utilice el software para normalizar y compara ROI intensidad fluorescente en contra de su valor inicial fluorescente línea de base. Los cambios en la fluorescencia normalizada son directamente proporcionales a los cambios en [Ca2 +].
- Utilice una modificación de un método descrito anteriormente utilizando 26? F / F = ((F 1 - F 0) / F 0) ROI - ((F 1 - F 0) / F 0) de fondo, donde F1 es la fluorescencia en cualquier dado punto y F0 es la fluorescencia de línea de base, para mejorar la precisión de evaluación. Esto ayuda modificaciónen la reducción de ruido de los cambios de fluorescencia en preparaciones de tejidos que exhiben movimiento de la capa muscular subyacente en el plexo mientérico.
Representative Results
El uso adecuado de esta técnica permite a los investigadores para medir con precisión Ca2 + intracelular [Ca 2 +] i transitorios en las neuronas entéricas y glía en todo el montaje en preparaciones de tejido. Un ejemplo representativo de un agonista-evocó Ca 2 + respuestas en glía dentro de un ganglio mientérico del colon de ratón se muestra en Video 1. Los resultados siguientes están destinados a ilustrar algunos resultados representativos que hemos obtenido usando este método. En primer lugar, la figura 2 ilustra los resultados de un experimento que mide la glía entérica [Ca 2 +] i los cambios en la respuesta a la estimulación por el ATP dentro de los preparativos de cobaya colon plexo mientérico muscular longitudinal (LMMP). Específicamente, esta figura muestra el método para el análisis adecuado del protocolo experimental enumerados anteriormente, incluyendo el contorno de la ganglionares y asteriscos denotan la localización de las neuronas entéricas mientérico analizado. Estos resultados tambiénllustrate la dosis óptima de un centenar de ATP micromolar en la movilización de [Ca 2 +] i en el conejillo de indias glía mientérico. Esta respuesta puede ser utilizado para calibrar la estimulación glial entérico y normalizar las respuestas para poner a prueba los estímulos. A continuación, la Figura 3 aclara cómo seleccionar adecuadamente las regiones de interés (ROI) que rodea las células gliales, que se muestra y la zona círculos amarillos. Estos resultados también muestran los cambios de fluorescencia deseados bajo condiciones basales y en respuesta a estímulos farmacológicos. Finalmente, la figura 4 muestra las consideraciones espaciales para la elección de la glía entérica y neuronas de [Ca 2 +] i en las respuestas de los preparativos de todo el montaje.
Figura 1. Organización de la ENS. La ENS contiene dos grandes plexos ganglionares. El plexo mientérico se encuentra entre el lcapas musculares ongitudinal y circulares. El plexo submucoso está situado entre la mucosa y la capa muscular circular. La ENS está exclusivamente compuesto por neuronas y glía entérica. Tractos de fibras nerviosas se conectan los ganglios. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. entérica glía en el conejillo de indias de colon responden plexo mientérico de ATP in situ. (A) Fluo-4 de fluorescencia en un ganglio mientérico (delineado por la línea de puntos) en condiciones basales. Las flechas apuntan a tractos de fibras interganglionic gruesos. (B) Después de la estimulación con 100 mmol / L de ATP, las células gliales, pero no neuronas, aumentan rápidamente Fluo-4 de fluorescencia que indica un aumento de la [Ca 2 +]
+ Células Figura 3. murino S-100-GFP en el colon responden plexo mientérico a ATP in situ. (A) células gliales (verde) en un ratón de colon ganglio mientérico S-100-GFP + (esbozados por línea de trazos). Seis regiones de interés (ROI) que rodea las células gliales en los ganglios se muestran como círculos amarillos. Las flechas indican los tractos de fibras gruesas que llevan en el ganglio. Los asteriscos dubicación enote de 2 neuronas entéricas. (B) La misma muestra de ganglio Rhod-2 fluorescencia bajo condiciones basales. (C) Después de la estimulación con 100 mol / L ATP, las células gliales responden con un aumento de [Ca2 +] i como se muestra por el aumento de Rhod- 2 de fluorescencia. (D) Huellas correspondiente a cada retorno de la inversión se muestra en A-C. (E) con un promedio de respuesta (media ± SEM) de las 6 regiones de interés se muestran en D 24. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La Figura 4. En las imágenes in situ de comunicación entérica-neurona-glía a. (A) Imágenes representativas (pseudocoloreada) de un experimento de imágenes de Ca 2+ en su conjunto de montajepreparación del plexo mientérico fue impugnada con el agonista del receptor neuronal P2X7 BzATP (100 m, 30 s). Tenga en cuenta que el agonista neuronal provoca un aumento en la fluorescencia Fluo4 en la neurona (A ') antes de las células circundantes entéricos gliales (A "). (B) Análisis del cambio en la fluorescencia con el tiempo en la glía (azul) y las neuronas (rojo ) tras la aplicación del agonista neuronal, BzATP. (C) Neuronal y respuestas gliales a BzATP en tampón normal (líneas continuas) y en tampón que contenía bajo Ca 2+ y Mg 2+ (líneas de trazos) para potenciar los receptores P2X7 neuronales 13. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Vídeo 1. agonista-evocó Ca 2 + respuesta en glía entérica ensitu. Este video muestra un ganglio mientérico del colon distal ratón cargado con el Ca 2 + colorante indicador, Fluo-4. El agonista de células gliales, ADP, se añade al baño cuando esté indicado. ADP provoca un aumento de Ca2 + intracelular en glía entérica como se observa por la elevación transitoria de Fluo-4 fluorescencia. Por favor, haga clic aquí para ver el vídeo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BubbleStop Syringe Heater | AutoMate Scientific | 10-4-35-G | |
| CaCl2 | Sigma | C3306 | |
| Collagenase, Type II, powder | Gibco | 17101-015 | |
| Dispase | Sigma-Aldrich | 42613-33-2 | |
| Dissection tools | Roboz | ||
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Fixed-stage microscope | Olympus | BX51WI | |
| Fluo-4 AM dye | Invitrogen | F-14201 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| Insect pins | Fine Science Tools | Minutien Pins | |
| iQ Live Cell Imaging Software | Andor | Andor iQ3 | |
| KCl | Sigma | P3911 | |
| MgCl2 | Sigma | M9272 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| Neo sCMOS camera | Andor | Neo 5.5 sCMOS | |
| Nicardipine | Sigma | N7510 | |
| Perfusion chamber | Custom | ||
| Peristaltic pump | Harvard Apparatus | Model 720 | |
| Pluronic F-127 | Invitrogen | P3000MP | |
| Probenecid | Molecular Probes | P36400 | |
| Scopolamine | Sigma | S1013 | |
| Sutter Lambda DG-4 | Sutter | DG-4 | |
| Sylgard | Dow Corning | 184 | |
| Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344C |
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