Introduction
Det enteriska nervsystemet (ENS) är organiserad i två ganglionated plexus inbäddade i väggen i mag-tarmkanalen 1. Dessa intramuskulära nervbanor, myentericus plexus (MP) och submukosala plexus (SMP), består av nervceller och enter glia (Figur 1) 2. MP och SMP reglerar gastrointestinala (GI) funktioner såsom intestinal motilitet och epitelial absorption och utsöndring, respektive 3. Enter glia ligger i omedelbar närhet till nervceller inom ganglierna men populationer av enter glia också finns inom sammankoppling fiber skrifter och extra ganglieblockerande delar av tarmväggen 3,4. Enteriska glia ursprungligen trott att endast närande stöd till nervceller. Men nya studier tyder starkt på att neuron-Glia interaktioner är väsentliga för ENS fungerar 5,6. Till exempel, data visar att enter glia "lyssna" på neuronal aktivitet 7och modulera neuronala kretsar 6,8, skydda enter neuroner från oxidativ stress 9 och kan generera nya enter nervceller som svar på skada 10,11. Protokollet presenteras i denna tekniska översyn ger en enkel och robust metod för att undersöka det komplexa samspelet mellan nervceller och enter glia använder in situ intracellulära Ca2 + avbildning.
Ca2 + är en allestädes närvarande signalmolekyl i exciterbara celler och spelar en viktig roll i synaptiska signaleringshändelser i nervsystemet 12. Excitation av nervceller eller enter glia framkallar en höjd i cytoplasma Ca2 + koncentrationen antingen genom inflöde via Ca2 + -permeable kanaler eller Ca2 + frisättning från intracellulära kalcium butiker. Imaging Ca 2 + transienter i neuroner och glia med fluorescerande färgämnen är en etablerad och allmänt använd teknik för att studera den funktionella organisation och dynamikENS 13-17. Ca 2 + avbildning har visat sig vara ett viktigt verktyg för att studera intakta GI vävnadssegment för att belysa spridningen av retbarhet genom ICC pacemakernätverk 18 och tarm glatt muskulatur 19,20. Det gör det möjligt för forskare att sondera ett brett spektrum av fysiologiska parametrar och ger information om både deras rumsliga fördelning och tids dynamik. Celler kan effektivt färgas i ett minimalt invasivt sätt genom att använda membrangenomträng fluorescerande indikatorer och optimerade färgningsprotokoll 21. Detta ger möjlighet att övervaka ett stort antal nervceller och enter glia i funktionellt bevarade preparat 14-16,22, samt in vivo 23. Hela montering vävnadsberedningar är bulk laddad med en hög affinitet Ca2 + indikatorfärgämne såsom Fluo-4 som ökar dess fluorescens vid bindning till Ca 2 +. Förändringar i fluorescens registreras av en CCD-kamera och analyseras digitalt 6. Tillkomsten av Ca2 + gav möjlighet att övervaka neuron och glia cell interaktioner, lyhördhet för olika stimuli, och medverkan av dessa celltyper i gastrointestinala processer i realtid.
In situ Ca 2 + avbildning har gett stor insikt i signaleringsmekanismer enter neuroner och glia och äger flera distinkta fördelar jämfört cellodlingsmodeller 6,24. Först på plats preparat upprätthålla infödda matrismiljö av nervceller och glia och lämna merparten av sina anslutningar för att rikta vävnad intakt. För det andra är de genetik och morfologin hos odlade enterisk Glia signifikant förändrade jämfört med in vivo-6,24. För det tredje är många heterotypiska interaktioner förlorade i primär cellkultur och detta begränsar utvärdera cell-cell-interaktioner. Även odlade celler är väl lämpade för undersökning av grundläggande egenskaper, deras usefulness för att studera komplexa interaktioner mellan enter glia och nervceller är begränsad. Undersöka neuron-glia samspel med hjälp av en in situ metod är mer fysiologiskt relevant som de synaptiska vägar förblir intakta 25. Jämfört med cellodlingsmetoder, en in situ metod ger bättre förutsättningar för att systematiskt förstå intrikata samspelet mellan nervceller och enter glia. Dessutom är idealisk för fluorescerande avbildning av intracellulära Ca 2 + transienter den plana organisationen av ganglionated plexus i hela monterade förberedelser och denna teknik ger en enkel metod för att bedöma neuron-glia aktivitet i ENS.
Protocol
OBS: Följande procedurer involverar vävnad från försöksdjur är förenliga med de AVMA Riktlinjer för eutanasi av djur 2013 och godkändes på förhand av Michigan State University IACUC.
1. Vävnadsberedning
- Bedöva forskning djur i en kammare innehållande 2,5% isofluran i syre eller genom att placera 3-5 ml flytande isofluran på ett absorberande material på golvet av kammaren, så att en fysisk barriär hindrar djuren från direkt kontakt med isofluran. Test för anestesidjupet genom att nypa trampdynan.
OBS: anestesidjupet anses lämpligt när det inte finns någon indragning reflex av bakbenet. När lämpligt sövda, avliva musen genom halsdislokation - Placera djuret i ryggläge och rengör bukhuden med 70% etanol. Använd pincett för att nypa bukhuden vid mittlinjen och använda kirurgisk sax för att göra en 6 cm medial snitt längs linea alba att exponera inre organ matsmältnings.
- Använd trubbig pincett för att lokalisera och exponera ileum inuti bukhinnan. Skär ileal / kolon tarmkäxet med sax och börja reda ut tarmen.
- När längden av tarmen är tillräckligt unraveled, skär tarmen distalt till magen och proximal till cekum för en ileum beredning. För en tjocktarm preparat, skär kolon distalt till blindtarmen och proximala till rektum.
- Snabbt ta bort tarmsegmentet och placera den i en bägare med DMEM / F12 media kompletterat med 3 iM nikardipinhydroklorid och 1 ^ M skopolamin hydroklorid (nedan kallat "media") på is. Tillsatsen av dessa hämmare underlättar microdissection och efterföljande avbildning av förlamande tarmen glatt muskulatur.
- Klipp segment av intresse (t.ex. jejunum, ileum, distal eller proximal kolon) utifrån fastställda anatomiska markörer. Typiskt i åtae vävnad från distala ileum eller distala kolon. Dock använder samma grundläggande förfarande för att isolera, belastning och bild myentericus neuroner och glia i alla tarm regioner.
- Ta ett litet segment (4-6 cm) av önskad tarmen segmentet och placera i en Sylgard-belagd petriskål fylld med kyld medier.
- Säkra proximala och distala ändarna av tarmsegmentet med insekter stift och öppna tarmröret genom att göra en rak, på längden skärs längs mesenteriska gränsen.
- Pin vävnad platt under lätt spänning med slemhinna sidan uppåt och försiktigt dissekera bort slemhinneskiktet med fin pincett (# 5 och # 5/45 fungerar bäst) och mycket fina våren sax.
OBS: Avlägsnandet av slemhinnan kan vara ganska traumatiskt för ENS om det inte görs på rätt sätt. För beredningar kvalitet, vara noga med att begränsa abrupt avlägsnande av slemhinnan genom peeling eller skrapning. Det bästa är att lyfta slemhinnan och skär under med fina sax. - Skär vävnaden i mindre förberedelsers (ca 0,5 cm 2) och stift i avbildnings rätter (4 hörn med cirkulär muskellagret uppåt) placerades på is med färsk medier.
- Försiktigt dissekera bort cirkulära muskler genom retas isär med fina pincett för att exponera myentericus plexus. Undvik överdriven stretching.
- Placera bild skålen tillbaka på is och förändringslösning med färskt medium.
- Förbered 2 ml enzymblandning per maträtt [Dispase en U / ml (4.48 mg / 8 ml), kollagenas typ II 150 U / ml (5,45 mg / 8 ml) i media].
- Ta bort rätter från is och lägga enzymet mix från steg 1,13.
- Inkubera rätter vid RT under 15 min med 5% CO2 / 95% luft.
- Tvätta vävnadspreparat media 3 gånger och åter stift hörn.
2. Loading Fluo-4 Dye
OBS: Undvik fotoblekning genom att arbeta med begränsad ljus vid hantering fluorescerande färger och vävnad lastade med indikator färgämnen.
- Förbered 4 iM Fluo-4 lastning lösning.
- Lägg 1,5 ml medium och 1,2 pl av en 250 mM probenecid lager till ett 1,5 pl alikvot av 4 mM Fluo-4 lager. 4 mM Fluo-4 lager framställs genom tillsats av 11,4 ^ il av Pluronic F-127 (20% i DMSO, kompletterat med 0,25% Cremaphor-EL) till 50 | ig av Fluo-4 AM.
- Inkubera preps i Fluo-4 laddningslösning under 45 minuter i en mörk inkubator vid 37 ° C.
- Ta bort från inkubatorn och tvätta beredningar media 3 gånger.
- Utbyte media för media innehållande 200 pM probenecid och inkubera 15 minuter vid 37 ° C före avbildning.
OBS: Probenecid är ett läkemedel som hämmar multiresistens transportörer i nervceller. Tillsats av detta läkemedel hämmar möjligheten för nervceller att extrudera färgämnen och förbättrar neuronal märkning. Bulk-lastning av Ca 2 + indikatorfärgämnen i frånvaro av probenecid tillverkar huvudsakligen glial cellbelastning. Tillägget av probenecid möjliggör visualisering av neuronala och gliaceller svar. - Förbered Modifierad Krebs buffert.
- Gör en modifierad Krebs-buffert så att de slutliga koncentrationerna (i mm) av komponenterna är som följer: 121 NaCl, 5,9 KCl, 2,5 CaCl2, 1,2 MgCl2, 1,2 NaH 2 PO 4, 10 HEPES, 21,2 NaHCOs 3, en pyrodruv syra och 8 glukos (pH justerat till 7,4 med NaOH). Lägg 3 iM nikardipin och 1 ^ M skopolamin att hämma muskelsammandragningar under Ca2 + avbildning och hel-mount dissektioner.
3. Imaging och analys
OBS: Använd åtminstone en grundläggande bild rigg med en fluorescerande ljuskälla, mikroskop, en kvalitet CCD-kamera och lämplig förvärvs programvara. Variera tillsats av andra komponenter beroende på ljuskällan och specifik applikation. Ett filterhjul och slutare måste användas med en traditionell xenonljuskälla. Men LED-ljuskällor och belysningssystem kräver inte dessa komponenter.
- Placera recOrding kammare under mikroskop och med hjälp av en tyngdkraftsflöde perfusion system med flera uppvärmda sprut reservoarer etablera en kontinuerlig perfusionshastighet av 2-3 ml / min av 37 ° C Krebs-buffert. Se till att förhindra luftbubbelbildning i både ingångs- och sugledning ansluten till en vakuumfälla.
- Ta de önskade plexus i fokus under starkt fältbelysning. Undvik överexponeras vävnad, vilket kan leda till fotoblekning.
- Undersök Fluo-4 lastning inom ganglier och välj friska ganglier för avbildning. Ohälsosamma / skadade ganglier uppvisar autofluorescens eller punktformig morfologi och bör inte användas för avbildning.
- När ganglion är vald, avleda ljusets väg till kameran och få sökarbilden med bild förvärv programvara. Se till att ganglion är i fokus och ställa bild förvärv ränta och exponeringstider.
OBS: bild förvärv priser och tider kommer att variera beroende på de händelser utredare vill spela in. För de flesta experiment, bildertraditionellt förvärvas till 0,5-1 Hz för gliaceller och upp till 2-10 Hz för nervceller eftersom gliaceller Ca2 + svar är inte lika snabb som Ca2 + transienter i nervceller. - Börja experimentera och skapa baslinjen aktivitet för 30 sek.
- Applicera förvärmda läkemedel av intresse såsom receptoragonister och antagonister som använder gravitationsflöde perfusionssystemet med en hastighet av 2-3 ml / min. Följ tillämpning av agonister / antagonister genom att återgå till en perfusion av normal buffert och låta en tvätt / återhämtningsperiod på minst 10 minuter.
OBS: De drog ansökningstider varierar beroende på den enskilda föreningen och experimentell design. I allmänhet är tillräcklig för att aktivera G-proteinkopplade receptorer i neuroner och gliaceller en 20-30 sek applicering av agonist. Men ligandstyrda jonkanaler (t.ex. nikotinacetylkolinreceptorer) kräver ansökningstider på högst 5-10 sek. Ytterligare varaktighet exponeringar kommer att orsaka ligand jonkanaler att snabbt DESEnsitize. Antagonister bör tillämpas för ca 3-15 min för att säkerställa fullständig blockad av receptor vägar. Detta är dock en grov generalisering och utredare bör alltid optimera varje experimentell drog i deras särskilda paradigm. - Stoppa inspelning och utsikt time-lapse film av experimentet. Noggrant utvalda områden av intresse (ROI) med hjälp av lämpliga bildanalysmjukvara.
- Använd programvara för att normalisera och jämföra ROI fluorescerande intensitet mot sitt ursprungliga baslinje fluorescerande värde. Förändringar i normaliserad fluorescens är direkt proportionell mot förändringar i [Ca2 +].
- Använd en modifiering av en metod som beskrivits tidigare 26 med hjälp av AF / F = ((F 1 - F 0) / F 0) ROI - ((F 1 - F 0) / F 0) bakgrund, där F1 är fluorescens vid varje given punkt och F0 är baslinjen fluorescens, för att förbättra noggrannheten bedömningen. Denna modifikation hjälpmedelminska bullret från fluorescens förändringar i vävnadspreparat som uppvisar rörelse muskellagret underliggande myentericus plexus.
Representative Results
Korrekt användning av denna teknik gör det möjligt för utredarna att noggrant mäta intracellulär Ca2 + [Ca2 +] i transienter i enter neuroner och glia i hel-mount vävnadspreparat. Ett representativt exempel på en agonist-framkallade Ca 2 + svar i glia inom en myenteric ganglion från musändtarm visas i Video 1. Följande resultat är tänkta att illustrera några representativa resultat vi har fått med den här metoden. Först, Figur 2 illustrerar resultaten av ett experiment som mäter enter gliaceller [Ca2 +] i förändringar som svar på stimulering av ATP inom marsvin kolon longitudinell myentericus muskel plexus (LMMP) preparat. Specifikt visar denna figur en metod för korrekt analys av det experimentella protokollet som anges ovan inklusive konturerna av den analyserade myentericus ganglion och asterisker betecknar platsen för enteriska neuroner. Dessa resultat även jagllustrate den optimala dosen av hundra mikromolar ATP om mobilisering av [Ca2 +] i i marsvin myentericus glia. Denna reaktion kan användas för att kalibrera enter gliaceller stimulans och normalisera svar att testa stimuli. Nästa, Figur 3 belyser hur man korrekt välja områden av intresse (ROI) omgivande gliaceller, som visas med omgivande gula cirklar. Dessa resultat visar också de önskade fluorescens förändringar under basala förhållanden och som svar på farmakologiska stimuli. Slutligen Figur 4 visar de rumsliga överväganden för att välja enter glia och nervceller för [Ca2 +] i svar i hela-mount förberedelser.
Figur 1. Organisation av ENS. Den ENS innehåller två stora ganglionated plexus. Myentericus plexus är beläget mellan longitudinal och cirkulära muskelskikten. Den submukosal plexus ligger mellan slemhinnan och det cirkulära muskelskiktet. Den ILE enbart består av neuroner och enterisk glia. Nervfiber skrifter ansluter ganglierna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Enteric Glia hos marsvin colonic plexus myentericus reagerar till ATP in situ. (A) Fluo-4 fluorescens i en myenteric ganglion (beskrivs av streckad linje) under basala förhållanden. Pilarna pekar på tjocka interganglionic fiber trakter. (B) Vid stimulering med 100 | amol / l ATP, gliaceller, men inte neuroner, snabbt öka Fluo-4 fluorescens indikerar en ökning av [Ca2 +]
Figur 3. Murina S-100-GFP + celler i kolon myentericus plexus svara på ATP i situ. (A) S-100-GFP + gliaceller (grön) i en mus kolon myentericus ganglion (skiss med streckad linje). Sex regioner av intresse (ROI) som omger gliaceller inom ganglierna visas som gula cirklar. Pilar indikerar tjocka fiber skrifter som leder in i ganglion. Asterisker deNote placering 2 enter nervceller. (B) Samma ganglion visar Rhod-2 fluorescens under basala förhållanden. (C) efter stimulering med 100 mikromol / L ATP, gliaceller reagerar med ökad [Ca2 +] i vilket framgår av ökad Rhod- 2 fluorescens. (D) spår motsvarar varje ROI som visas i A-C. (E) i genomsnitt svar (medelvärde ± SEM) av de 6 ROI visas i D 24. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. I situ avbildning av enter neuron-till-glia kommunikation. (A) Representativa bilder (pseudocolored) från en Ca2 + imaging experiment där en hel-mountberedning av plexus myentericus utmanades med den neuronala P2X7-receptoragonist BzATP (100 iM, 30 sek). Notera att den neuronala agonisten orsakar en ökning av Fluo4 fluorescens i neuron (A ') före de omgivande enterala gliaceller (A "). (B) Analys av förändring i fluorescens över tid i glia (blå) och neuroner (röd ) efter applicering av det neuronala agonist, BzATP. (C) Neuronal och gliaceller svar på BzATP i normal buffert (heldragna linjer) och i buffert innehållande låg Ca2 + och Mg2 + (streckade linjer) för att förstärka neuronala P2X7 receptorer 13. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Video 1. Agonist-framkallade Ca2 + respons i enterisk glia isitu. Denna video visar en myenteric ganglion från musen distala colon laddad med Ca2 + indikatorfärg, Fluo-4. Den gliaceller agonist, ADP, läggs till badet när det anges. ADP framkallar en ökning av intracellulär Ca2 + i enter glia som observeras av den transienta förhöjning i Fluo-4 fluorescens. Klicka här för att se filmen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BubbleStop Syringe Heater | AutoMate Scientific | 10-4-35-G | |
| CaCl2 | Sigma | C3306 | |
| Collagenase, Type II, powder | Gibco | 17101-015 | |
| Dispase | Sigma-Aldrich | 42613-33-2 | |
| Dissection tools | Roboz | ||
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Fixed-stage microscope | Olympus | BX51WI | |
| Fluo-4 AM dye | Invitrogen | F-14201 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| Insect pins | Fine Science Tools | Minutien Pins | |
| iQ Live Cell Imaging Software | Andor | Andor iQ3 | |
| KCl | Sigma | P3911 | |
| MgCl2 | Sigma | M9272 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| Neo sCMOS camera | Andor | Neo 5.5 sCMOS | |
| Nicardipine | Sigma | N7510 | |
| Perfusion chamber | Custom | ||
| Peristaltic pump | Harvard Apparatus | Model 720 | |
| Pluronic F-127 | Invitrogen | P3000MP | |
| Probenecid | Molecular Probes | P36400 | |
| Scopolamine | Sigma | S1013 | |
| Sutter Lambda DG-4 | Sutter | DG-4 | |
| Sylgard | Dow Corning | 184 | |
| Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344C |
References
- Furness, J. B. Types of neurons in the enteric nervous system. Journal of the Autonomic Nervous System. 81 (1-3), 87-96 (2000).
- Furness, J. B. The organization of the autonomic nervous system: peripheral connections. Neuroscience. 130 (1-2), 1-5 (2006).
- Pham, T. D., Gershon, M. D., Rothman, T. P. Time of origin of neurons in the murine enteric nervous system: sequence in relation to phenotype. Journal of Comparative Neurology. 314 (4), 789-798 (1991).
- Nasser, Y., et al. Role of enteric glia in intestinal physiology: effects of the gliotoxin fluorocitrate on motor and secretory function. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 291, G912-927 (2006).
- Glial cells in the gut. Neurogastroenterology & Motility. 17 (6), 777-790 (2005).
- Broadhead, M. J., Bayguinov, P. O., Okamoto, T., Heredia, D. J., Smith, T. K. Ca2+ transients in myenteric glial cells during the colonic migrating motor complex in the isolated murine large intestine. J. Physiol. 590, 335-350 (2012).
- Gulbransen, B. D., Bains, J. S., Sharkey, K. A. Enteric glia are targets of the sympathetic innervation of the myenteric plexus in the guinea pig distal colon. J. Neurosci. 30, 6801-6809 (2010).
- McClain, J. L., et al. Ca2+ Responses in Enteric Glia Are Mediated by Connexin-43 Hemichannels and Modulate Colonic Transit in Mice. Gastroenterology. 146 (2), 497-507 (2014).
- Chandrasekharan, B., et al. Colonic motor dysfunction in human diabetes is associated with enteric neuronal loss and increased oxidative stress. Neurogastroenterology & Motility. 23 (2), e131-e126 (2011).
- Abdo, H., et al. Enteric glial cells protect neurons from oxidative stress in part via reduced glutathione. FASEB J. 24, 1082-1092 (2010).
- Aube, A. C., et al. Changes in enteric neurone phenotype and intestinal functions in a transgenic mouse model of enteric glia disruption. Gut. 55, 630-637 (2006).
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nature Reviews Molecular cell biology. 1 (1), 11-21 (2000).
- Gulbransen, B. D., et al. Activation of neuronal P2X7 receptor-pannexin-1 mediates death of enteric neurons during colitis. Nat Med. 18, 600-604 (2012).
- Bayguinov, P. O., Hennig, G. W., Smith, T. K. Calcium activity in different classes of myenteric neurons underlying the migrating motor complex in the murine colon. J Physiol. 588, 399-421 (2010).
- Okamoto, T., Bayguinov, P. O., Broadhead, M. J., Smith, T. K. Ca(2+) transients in submucous neurons during the colonic migrating motor complex in the isolated murine large intestine. Neurogastroenterol Motil. 24 (8), 769-778 (2012).
- Kunze, W. A., Clerc, N., Furness, J. B., Gola, M. The soma and neurites of primary afferent neurons in the guinea-pig intestine respond differentially to deformation. J Physiol. 526, 375-385 (2000).
- Schemann, M., Michel, K., Peters, S., Bischoff, S. C., Neunlist, M. Imaging and the gastrointestinal tract: mapping the human enteric nervous system. Am J Physiol. 282, G919-G925 (2002).
- Hennig, G. W., et al. Visualization of spread of pacemaker activity in through ICC in guinea-pig antrum. Neurogastro Motil. 14, 575 (2001).
- Stevens, R. J., Publicover, N. G., Smith, T. K. Induction and organization of Ca2+ waves by enteric neural reflexes. Nature. 399, 62-66 (1999).
- Stevens, R. J., Publicover, N. G., Smith, T. K. Propagation and neural regulation of calcium waves in longitudinal and circular muscle layers of guinea-pig small intestine. Gastroenterology. 118, 982-984 (2000).
- Jessen, K. R., et al. Astrocyte-like glia in the peripheral nervous system: an immunohistochemical study of enteric glia. Journal of Neuroscience. 3 (11), 2206-2218 (1983).
- Gulbransen, B. D., Sharkey, K. A. Novel functional roles for enteric glia in the gastrointestinal tract. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 9, 625-632 (2012).
- Gomes, P., et al. ATP-dependent paracrine communication between enteric neurons and glia in a primary cell culture derived from embryonic mice. Neurogastroenterology & Motility. 21 (8), e870-e862 (2009).
- Gulbransen, B. D., Sharkey, K. A. Purinergic neuron-to-glia signaling in the enteric nervous system. Gastroenterology. 136, 1349-1358 (2009).
- Ren, J., Bertrand, P. P. Purinergic receptors and synaptic transmission in enteric neurons. Purinergic Signal. 4, 255-266 (2008).
- Takahashi, A., Camacho, P., Lechleiter, J. D., Herman, B. Measurement of intracellular calcium. Physiol Rev. 79, 1089-1125 (1999).
- Dongcheng, Z., et al. Neural crest regionalisation for enteric nervous system formation: implications for Hirschsprung's disease and stem cell therapy. Developmental Biology. 339 (2), 280-294 (2010).
- Gershon, M. D. Behind an enteric neuron there may lie a glial cell. J Clin Invest. 121, 3386-3389 (2011).
- Boesmans, W., et al. Imaging neuron-glia interactions in the enteric nervous system. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, (2013).
