Abstract
Цитозольного Ca 2+ регулировать многие аспекты клеточной активности практически во всех типах клеток, контролируя процессы, широкие, как транскрипции генов, электрической возбудимости и пролиферации клеток. Разнообразие и специфичность Ca 2+ сигналов происходит от механизмов, посредством которых Ca 2+ сигналы генерируются действовать в течение различных временных и пространственных масштабах, начиная от сотовых всей колебаний и волн, происходящих в течение периодов от нескольких минут до местных переходных Ca 2+ микродоменов (Ca 2+ клубы) длительностью миллисекунд. Последние достижения в области электронного умножается CCD (EMCCD) камеры в настоящее время позволяют для работы с изображениями местных Ca 2+ сигналов с 128 х 128 пикселей пространственным разрешением со скоростью> 500 кадров с -1 (FPS). Такой подход чрезвычайно параллельный и позволяет одновременный мониторинг сотен каналов или слоеного сайтов в одном эксперименте. Тем не менее, огромное количество данных, полученных (около 1 Гб PER мин) оказывать визуальную идентификацию и анализ местного Ca 2+ события невыполнимую. Здесь мы опишем и продемонстрируем процедуры для приобретения, обнаружения и анализа местного IP 3 опосредованной Са 2+ сигналы в интактных клетках млекопитающих, нагруженных Са 2+ показателей в обеих широкого поля эпи-флюоресценции (WF) и полное внутреннее отражение флуоресценции (TIRF) микроскопия. Кроме того, мы опишем алгоритм, разработанный в рамках программной среде Python с открытым исходным кодом, которая автоматизирует выявление и анализ этих местных Ca 2+ сигналов. Алгоритм локализуется сайты Ca 2+ выпуска с разрешением суб-пикселей; позволяет отзыв пользователем данных; и выводит временные последовательности отношение флуоресцентных сигналов вместе с амплитудой и кинетических данных в Excel-совместимый таблице.
Introduction
Ионы кальция (Ca 2+) повсеместно регулировать широкий спектр биологических процессов, в том числе генной экспрессии, секреции и длительных изменений в синаптической пластичности 1. Один из способов, через которые Са 2+ может действовать таким разнообразным образом через различных пространственных и временных форм Ca 2+ сигналы клеток может генерировать. Например глобальных высот в цитозоле [Са 2+] триггера сокращения в гладкой мышечной ткани 2, тогда как более мелкие, локальные переходные высоте (местные Ca 2+ Микродомены) стимулировать экспрессию генов, необходимую для обучения и памяти 3.
Бесплатный цитозольный [Ca 2+] поддерживается на ~ 100 нм в покое, но может быстро подняться до нескольких микро-моляра после притока Ca 2+ в цитозоле через Са 2+ -permeable ионные каналы, расположенные в мембране и освобождение Са 2+ из внутриклеточных сTores. В нашей лаборатории фокусируется на инозитол 1,4,5-трифосфата рецептора (IP-3 R), который образует канал выпуска 2+ Ca, расположенной в эндоплазматический ретикулум (ER) мембраны. После связывания как IP 3 и Са 2+ в цитозоле активации сайты рецептора, R канал IP 3 открывает освободить Ca 2+ поглощенных в ER просвет. Релиз Ca 2+ может оставаться пространственно ограничена небольшим кластера IP 3 рупий для создания местного цитозольную микродоменной Ca 2+ (Ca 2+ слоеного 4) или, в зависимости от близости соседних кластеров IP 3 R, может распространяются по всей клетке, привлекая множество сайтов слоеные с помощью процесса, Са 2+, индуцированной Ca 2+ -release (CICR) 5,6.
Введение флуоресцентных маленькая молекула Са 2+ индикатор красителей разработана Роджером Tsien 7, в сочетании с передовой микроскопии томографовнг методы, значительно облегчило наше понимание Ca 2+ сигнализации. Последние достижения в области камер, используемых для микроскопии позволяют сейчас для визуализации переходных местных Ca 2+ события, такие как клубы с беспрецедентной пространственным и временным разрешением. Имеющиеся в настоящее время EMCCD камеры позволяют изображений с 128 х 128 пикселей при> 500 кадров с -1 (кадров в секунду) и новое поколение дополнительной полупроводника из оксида металла (CMOS) камеры обеспечивают более высокое разрешение в пикселях, и даже более высокую скорость за счет немного выше уровень шума. В сочетании с полного внутреннего отражения (TIRF) микроскопии стало возможным с изображением одного Ca 2+ события 8,9 каналов. Такой подход позволяет визуализации сотен каналов / событий одновременно, при создании больших наборов данных (около 1 Гб в минуту), которые делают ручную обработку, визуальную идентификацию и анализ непрактичным и разместить ответственность на разработке автоматизированных алгоритмов.
2+ сигналы в интактных клетках млекопитающих с использованием флуоресцентных Ca 2+ показателей. Кроме того, мы продемонстрировать алгоритм, разработанный в среде Python с открытым исходным кодом, которая автоматизирует идентификацию и анализ локальных Ca 2+ событий, отображаемых как TIRF и обычные широкое поле эпи-флуоресценции (WF) микроскопии. Хотя мы опишем эти подходы в контексте ИС 3 -порожденная Ca 2+ сигналы, они легко поддаются изучению локальных изменений в цитозоле [Са 2+], исходящие из различных Са 2+ -permeable ионные каналы, расположенные в любом поверхности мембрану или внутриклеточные органеллы 8-10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Мы представляем детальные процедуры для работы с изображениями местных Ca 2+ события в человеческой нейробластомы SH-SY5Y клеток. Эти процедуры могут быть адаптированы к изображения внутриклеточного Са 2+ сигналов во многих типах клеток 8-10.
1. Подготовка клеток
- Культуры клеток для включения в образ в соответствии с инструкцией, приведенной на веб-сайте своего поставщика.
- Через несколько дней до обработки изображений, урожай клеток, выращенных в культуре ткани колбу с использованием 1 мл 0,25% трипсина / EDTA (2-3 мин). После отрыва, добавить равный объем культуральной среды для инактивации трипсина.
- Выполните подсчет клеток с использованием гемоцитометра и семян клеток в стеклянное дно блюд изображений при плотности 3-7 х 10 4 клеток на чашку. Выделите ячейки для экспериментов с изображениями, когда они достигают 60% слияния (2-3 дня).
2. Приготовление растворов и реактивов
- Подготовка Ca 2+ -содержащего HEPES в буфересолевой раствор (Са 2+ -HBSS) состоит из (мМ): NaCl 135, KCl 5,4, CaCl2, 2, 1 MgCl 2, 10 HEPES, 10 глюкозы и; рН = 7,4 при комнатной температуре (RT) с помощью NaOH. Подготовка Ca 2+ -HBSS без добавления глюкозы и хранят при температуре 4 ° С; добавить глюкозы в растворе непосредственно перед использованием.
- Солюбилизации мембранных проникающий формы флуоресцентного индикатора Са 2+ Cal-520 (1 мМ), CI-IP-3 (200 мкМ), и EGTA (100 мМ) в диметилсульфоксиде (ДМСО), содержащих 20% Pluronic F-127. Алиготе этих реагентов в пробирки Эппендорф и хранить, защищенных от влаги и света, при температуре -20 ° C.
3. Загрузка Клетки с мембраной проникающий Cal-520, CI-IP 3 и EGTA
- Подготовка "загрузочного буфера" путем разбавления исходных растворов мембран проникающий Cal-520 и CI-IP 3 до конечной концентрации 5 мкМ и 1 мкМ, соответственно, в Са 2+ -HBSS.
- Отберите у.е.lture СМИ и промыть клетки, замену носителя с Са 2+ -HBSS три раза.
- Удалить Ca 2+ -HBSS и инкубировать клетки в буфере для нанесения в течение 60 мин при комнатной температуре в темноте.
- Удалить загрузки буфер и промыть клетки, замену носителя с Са 2+ -HBSS три раза.
- При желании на этом этапе, тензодатчики с EGTA / AM разбавлением исходного раствора в конечной концентрации 5 мкМ в Ca 2+ -HBSS а затем инкубируют клетки в течение 30-60 мин при комнатной температуре в темноте. После этого инкубирования промойте ячеек три раза Ca 2+ -HBSS затем переходите к шагу 3.5.
- Инкубируйте клетки в Ca 2+ -HBSS в течение 30 мин, чтобы обеспечить деэтерификации загруженных реагентов.
- Непосредственно перед визуализации, заменить Са 2+ -HBSS с "свежей" Ca 2+ -HBSS, чтобы удалить какой-либо краситель, который мог бы утечка в ванне во время конечного инкубации.
4. Ca 2+
- Поместите небольшую каплю иммерсионного масла на цели 100X APO TIRF (NA 1.49).
- Установите блюдо изображений на этапе инвертированного микроскопа и принести клеток в фокусе, используя проходящем свете. Важно, чтобы обеспечить блюдо изображений, чтобы предотвратить движение во время записи.
- Осветить клетки с 488 нм лазера, чтобы возбудить Cal-520 и собрать излучаемую флуоресценции (λ> 510 нм), используя высокоскоростной EMCCD камеру.
ПРИМЕЧАНИЕ: пакет программного обеспечения, который работает микроскоп позволяет пользователю перевести фокусирующей линзы, позволяющие лазерный луч, чтобы быть введены либо на самом краю объективной обратной диафрагму (для TIRF возбуждения) или ближе к центру (для "WF" возбуждения). - Использование программного обеспечения EMCCD, уменьшить поле изображения с полным 512 х 512 пикселей для того, чтобы собирать данные по необходимой временным разрешением, чтобы захватить локальные Ca 2+ события.
ПРИМЕЧАНИЕ: Например, центр Quadприобретение 256 х 256 пикселей ускоряет процесс приобретения до 66 кадров в секунду. Кроме того, можно дополнительно увеличить частоту кадров EMCCD камеры к 500 кадров в секунду с использованием изолированного функция режима урожай. - Настройка программного обеспечения для автоматической записи несколько секунд базовой деятельности, доставить УФ вспышки в клетки и продолжить запись еще 10-30 сек.
Примечание: УФ флэш поставляется с использованием ксеноновой дуговой источник света вводится через УФ отражающей дихроичное зеркало в задней порта микроскопом. Продолжительность и интенсивность УФ-вспышки регулируется эмпирически, чтобы вызвать желаемую частоту местных Са 2+ событий. - Сохранить файлы в качестве изображения стеки для анализа в автономном режиме.
5. Автоматизированная Ca Анализ 2+ изображения
ПРИМЕЧАНИЕ: Можно просматривать, обрабатывать и анализировать полученные данные с помощью многих коммерческих программных пакетов. Тем не менее, мы разработали алгоритм для быстрого автоматизации идентификациейd анализ локальных Ca 2+ сигналов. Подробное описание пространственных и временных фильтров, используемых в данном алгоритме, генерация подпрограмм; F / F 0 и идентификации / анализа можно найти в 11. Этот алгоритм был разработан для работы на платформе программного обеспечения с открытым исходным кодом Python, и могут быть получены, вместе с образцами экспериментальных данных и подробные инструкции пользователей, по электронной почте об авторе (ismith@uci.edu).
- Преобразование файлов, которые будут импортированы в специально написанный алгоритм в формат файла Multi-самолета .tiff.
- Найдите папку, содержащую алгоритм анализа и дважды щелкните run.exe.
- Выберите .tiff файл для анализа.
- Выберите параметры анализа в диалоговом окне Открыть. Смотрите рисунок 2А для параметров по умолчанию для выборки данных.
- Определить уровень черного, которые будут компенсированы из стека изображения либо перемещении курсора на части поля зрения, что делает пOT содержать ячейку (рис 2б) или вручную, путем ввода уровень черного, используя "Set Уровень черного строки.
- Соблюдайте четыре окна на экране после анализа программного обеспечения (рис 2С-F). С монохромный образ отдыха флуоресценции из клеток анализируется. Белые квадраты, наложенные на этой фотографии являются места событий, определяется как центра тяжести позиций двумерных гауссовых функций, установленных на события.
- Нажмите на каждом месте события или нажмите клавиши курсора для переключения между событиями. После выполнения этого фон вычитается, Gaussian сглаживаются изменения соотношения флуоресценции (; F / F 0) в каждой из этих сайтов обновлений в окне D.
ПРИМЕЧАНИЕ: красным цветом события полны решимости происходят из этого конкретного сайта, а не из «просачивание через" от деятельности локализованного в соседние сайтов. Нижний синий след указывает, где сигнал флуоресценции в выбранном месте превышает обнаруженияПорог, в то время как черные линии определяет события, происходящие из этого конкретного сайта (в соответствии с красным цветом события). - Нажмите на красным цветом событие для обновления окна E, который отображает временную эволюцию события, а окна F, который отображает пространственный профиль случае, усредненная по ее течения времени, вместе с пространственным профилем оборудованной функцией Гаусса.
- Вручную просмотреть события, которые были определены таким образом, чтобы артефакты могут быть отклонены из анализа. Удалить такие события, щелкнув правой кнопкой мыши красным цветом события.
ПРИМЕЧАНИЕ: В наших руках, Ca 2+ поток через отдельные каналы IP 3 R вызывает сигналы с; F / F 0 о 0,11, так что, скорее всего, ложные срабатывания любых обнаруженных «события» заметно меньше, чем это. - Экспорт данных, выбрав пункт "Сохранить Excel" или экспортировать данные на чейно, опираясь вокруг клеток, представляющих интерес и выбрав "Сохранить CellR17 ;.
Примечание: Данные сохраняются в той же папке, что и оригинальный стек изображений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
1А показывает WF образ отдыха флуоресценции Cal-520 в нейробластомы человека SH-SY5Y, также загружаются с CI-IP 3. Воздействие этих клеток к 100 мсек УФ вспышкой фото-выпуска I-IP-3 вызвало переходные Ca 2+ затяжек на дискретных участках, обозначенных (белые кружки на фиг.1А). Флуоресцентные следы измеренные на этих сайтах показал быстрый рост фазы, обусловленные переходными отверстиями IP 3 R, с последующим гораздо медленнее падающего фазы (рис 1B и 1C), как Ca 2+ медленно рассеивается от места выпуска. Красный выделенных событий на рисунке 1b сигналы Ca 2+, которые были определены с помощью алгоритма, возникла из выбранного сайта. Номера для выделенных событий представляют собой загрязнения Ca 2+ сигналы поступающего из близко расположенных объектов.
Для достижения более высокого разрешения изображений местного Ca
Анализ стеки учитываются в этой манере значительно облегчается с помощью пользовательского написанный алгоритм, разработанный в нашей лаборатории, работающих на программной платформе с открытым исходным кодом Python 11. 2А показано диалоговое окно открытия, в котором пользователь вводит параметры, которые будут использоваться для идентификации и последующего анализа изображений стеков. После этого пользователю будет предложено выбрать уровень черного, должны быть вычтены из всего набора изображений, после чего выявление и анализ работает алгоритм Рисунок 2C-F показывают, соответственно, субклеточные сайты местного Ca 2+-релизе.; деятельность на отдельных участках; отдельные события на расширенном масштабе времени; и пространственные профили представительных событий (рис 2 легенду для деталей). По результатам рассмотрения пользователя выявленных мест, проанализированы данные для всех событий (см таблицу 1) могут быть экспортированы, выбрав функцию «Сохранить в Excel".
Фигура 3 представлены данные, показывающие как улучшенное разрешение изображения, достигнутый в TIRF EGTA загружены клеток по сравнению с WF изображений в ненагруженных клеток, а рАуэр алгоритма для определения и анализа локальных Ca 2+ сигналы. 3А показана репрезентативная локальное событие, отображаемых WF в клетке загружены только с Cal-520 и CI-IP 3. Для сравнения, 3В показан аналогичный случай, но теперь отображены с помощью TIRF микроскопии в клетке дополнительно загружен EGTA. Наложенные следы в 3С и 3D, иллюстрируют соответствующие временные (C) и пространственных (D) Профили событий, записанных с помощью флуоресценции WF без ЭГТА (черный) и TIRF микроскопии с ЭГТА загрузки (красный). Рисунок 3E участки виду измерения амплитуд слоеного , время затухания, и пространственная ширина по этим двум условиям, определяется с помощью алгоритма для анализа примерно 44 (WF) и 88 (TIRF) события.
Рисунок 1: IP
Рисунок 2: Пользовательский интерфейс пользовательского кода предназначены для автоматического выявления и анализа местных Ca 2+ сигналов в SH-SY5Y, отображенных на TIRF микроскопии () диалоговое окно, где выявление и анализ параметров вводятся Открытие (B) пользователь выбирает.. . область изображения, которая не содержит клетки, чтобы определить уровень черного, который вычитается из всех кадров в стеке изображения (C - F). Скриншоты Заключительного / идентификация анализа окон (C) Изображение отдыхает Cal-5 20 флуоресценции, на которых накладываются в местах, где Са 2+ были определены (белые квадраты). Пользователь может цикл между сайтами, перемещая мышь на изображение или нажатием клавиш управления курсором. (D) окно, показывающее отношение флуоресценции (; F / F 0) след на выбранном событии. Красные-выделенных событий идентифицированы как возникнув на сайте выбранной. Ниже синяя полоса указывает события, которые превышают порог для обнаружения на этом сайте; события не выделен красным цветом были локализованы на участке, примыкающем. Нажатие на голубой панели осуществляется переход к этому сайту событий. При нажатии на красную случае с помощью мыши открывает еще два окна, показывающие эволюцию во времени события на расширенном масштабе времени (E) и пространственных профилей (F) из событий в среднем за свое время, конечно (слева) вместе с пространственным профилем оборудованная Gaussian (справа).e.jpg "TARGET =" _ пустое "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 3: Улучшение временной и пространственной точностью из слоеного изображений достигается за счет использования TIRF микроскопии в сочетании с внутриклеточной нагрузки ЭГТА () фотоснимка из слоеного захваченного во время пиковой амплитуды, накладывается на фоновое изображение отдыхает флуоресценцию. показать клеток контур. Изображение получено с помощью WF микроскопии клетки не загружается с ЭГТА. Слоеного изображение псевдоцветной, с более высокими Ca 2+ уровнях, обозначенных более «теплых» цветов. (B) соответствующее изображение из слоеного, отображаемых TIRF микроскопии в клетке, загруженной с ЭГТА. (C) Следы, WF (черный) или TIRF + EGTA (красный), показывают соответствующее изменение в Cal-520 fluorescencе с течением времени для Ca 2+ затяжек, показанных в (а) и (б) выше. Следы нормированы к тому же амплитудой и приведены в соответствие с их пикового времени, чтобы облегчить сравнение их кинетики. Аннотации показывают измерения Са 2+ параметров событий (амплитуда и время падения) количественно (E). (D) следы, WF (черный) или TIRF + EGTA (красный), показывают, интенсивность флуоресценции линии сканирования через Са 2 + затяжек, указанные в (А) и (В). Линейные сканы нормированы на их максимальных амплитуд, и по центру. Аннотация показывает измерение полной ширины на половине максимальной амплитуды (FWHM), а количественно (E). (E) гистограммы, показывающие средние пиковые амплитуды (вверху), спада от 80% до 20% от пиковой амплитуды (в центре) и пространственная ширина (FWHM) затяжек, отображаемых WF микроскопии в клетках без ЭДТА (открытых баров) и TIRF микроскопии в ЭГТА загружены клеток (серые столбики). Данные представлены в виде среднего значения ± SEM с п по меньшей мере, 37 затяжекдля ВФ и 79 для TIRF. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
| А. | Группа # | Событие идентификационный номер сайт |
| B. | GroupX: | Средняя суб-пикселей х расположение всех событий на конкретном участке |
| C. | GroupY: | Средняя суб-пикселей у местонахождение всех событий на конкретном участке |
| D. | No. события: | Количество событий, происходящих на месте на протяжении всего эксперимента. |
| E. | Макс Amp: | Максимальная амплитуда случае в этом конкретном месте (; F / F 0) |
| F. | X: | Субпиксельное х локализация события |
| Г. | Y: | Субпиксельное илocalization события |
| H. | T_peak: | Время, когда событие достигает пиковой амплитуды (по числу кадров) |
| I. | Амплитуда: | Амплитуда всех событий, происходящих с каждого сайта (; F / F 0) |
| J. | Sigmax: | X SD гауссовой профиль устанавливается на время хода мероприятия (в пикселях) |
| К. | Sigmay: | Y SD гауссовой профиль устанавливается на время хода мероприятия (в пикселях) |
| Л. | Угол обзора: | Угол продольной оси в результате эллиптической функции Гаусса устанавливается на время ходе события |
| М. | R20: | Время подняться на 20% амплитуды макс (в кадрах) |
| Н. | R50: | Время подняться на 50% амплитуды макс (в кадрах) |
| О. | R80: | Время растидо 80% от амплитуды макс (в кадрах) |
| П. | R100: | Время расти до 100% максимальной амплитуды (в кадрах) |
| Q. | F80: | Время снизится до 80% от амплитуды макс (в кадрах) |
| Р. | F50: | Время снизится до 50% от амплитуды макс (в кадрах) |
| С. | F20: | Время снизится до 20% от амплитуды макс (в кадрах) |
| Т. | F0: | Время, чтобы вернуться к исходному до события (в кадрах) |
Таблица 1: Выходные данные алгоритма.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы опишем протоколов для работы с изображениями местных Ca 2+ события в культивируемых клетках млекопитающих с использованием флуоресцентных Ca 2+ показателей. Кроме того, мы опишем алгоритм с интуитивно понятным пользовательским интерфейсом, который позволяет автоматизировать идентификацию и анализ полученных данных. Описанная здесь процедура использования флуоресцентного Са 2+ индикатор CAL-520, но и многие другие Ca 2+ чувствительные красители, такие как Fluo-3, Fluo-4, Fluo-8 и Орегон Зеленый BAPTA-1 выполнять достаточно хорошо, чтобы изображения Са 2+ микродомены. Уход же должны быть приняты для того, чтобы с высоким сродством к версии (K D из ~ 200-400 нм) этих показателей используются для изображения местных Ca 2+ микродомены и оптимальные условия загрузки этих показателей должны быть определены эмпирически для каждый тип клеток под следствием. По своей природе Ca 2+ показатели связывают Са 2+ и, таким образом, выступают в качестве Ca 2+ буферы; более высокие концентрации загрузка IndicaТЗ есть потенциал, чтобы вмешиваться в сигналы Ca 2+ записывается и / или может быть наложен арест во внутриклеточные органеллы, хотя условия погрузки, описанные здесь, хорошая отправная точка. В целом, визуализации деятельность местных Ca 2+ событий минимально инвазивной, сохраняя родной архитектуру клетки и цитоплазмы факторов, которые могут регулировать каналы, которые лежат в основе Ca 2+ микродомены.
Протокол мы описали здесь изображений с высоким разрешением местных Ca 2+ сигналов с помощью TIRF микроскопии имеет очевидное ограничение в том, что он ограничивает измерения на события, которые возникают из каналов Ca 2+, лежащих в запредельном области. Тем не менее, он не ограничен только каналов в плазматической мембране, и продемонстрировать применимость к каналам, таким как IP-3 R в внутриклеточных органелл, которые были найдены, чтобы быть преимущественно расположен близко к плазматической мембране 12, нов противном случае будут недоступны для электрофизиологических записи своей деятельности в родном клеточной среде. Конфокальной визуализации позволит визуализации сигналов, генерируемых в глубь клетки, но имеет недостатки по сравнению с TIRF изображений в том, что толщина оптической секции шире (~ 800 нм против 100-200 нм) и имеет ограниченный размер временной необходимостью для сканирования конфокальной пятно (ы). Поскольку изображения осуществляется в режиме эпи-флуоресценции с использованием инвертированного микроскопа, оптические записи локальных и одноканальных Са 2+ сигналов могут быть легко объединены с одновременным электрофизиологические записи патч-зажим.
Выражая флуоресценции Са 2+ сигналы как отношение флуоресценции отдыха (; F / F 0), можно получить хорошую относительную меру амплитуд сигналов. Тем не менее, мы предупреждаем, что калибровка местном, временные изменения флуоресценции в абсолютных концентраций Ca 2+не подходит. Градиенты свободного [Ca 2+] и Са 2+ гранью индикатора вокруг канала Ca 2+ выпуска или группе каналов является более узким, чем может быть решена с помощью оптической микроскопии и, таким образом, быть размыты функцией рассеяния точки микроскопа. Кроме того, местные [Ca2 +] в непосредственной близости от поры канала изменится на микросекунды масштабе времени, как открывает и закрывает канал. Таким образом, сигналы флуоресценции дают лишь размытое (в пространстве и времени) представление об истинном Ca 2+ нанодоменного, лежащей в основе местных Ca 2+ сигналы 13.
Алгоритм, описанный здесь значительно облегчает анализ локальных Са 2+ сигналов от изображений на основе камеры. Благодаря автоматизации выявления и анализа не только смещение пользователь устранены, но гигабайт стеки могут быть обработаны в течение нескольких минут в очень параллельно, получая как временных, так и пространственных данных из нескольких событий изодновременно одноклеточных.
Хотя данные в этой рукописи представлены в контексте ИС 3 -опосредованной Ca 2+ сигналы, подходы, описанные может быть легко расширена для визуализации локальных изменений в цитозольной [Ca2 +], вытекающих из многочисленных типов лиганд, второй messenger- и напряжения закрытого Ca 2+ -permeable ионных каналов. Высокой пропускной характер алгоритма для автоматизации идентификации и анализа местных Ca 2+ мероприятий должны также оказаться весьма полезным для работы с изображениями Ca 2+ каналопатии в болезненных состояний с помощью моделей одноклеточных, такие как болезнь и аутизмом Альцгеймера.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Neuroblastoma SH-SY5Y cells | ATCC | CRL-2266 | |
| Cal-520/AM | AAT Bioquest Inc. | 21130 | |
| ci-IP3 (D-23-O-Isopropylidene-6-O-(2-nitro-4,5-dimethoxy)benzyl-myo-Inositol 1,4,5-trisphosphate-Hexakis(propionoxymethyl) Ester | SiChem | cag-iso-2-145-10 | |
| DMSO/20% pluronic F127 | Invitrogen | P-3000MP | |
| EGTA/AM | Invitrogen | E-1219 | |
| 35 mm glass-bottom imaging dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C |
References
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).
- Hill-Eubanks, D. C., Werner, M. E., Heppner, T. J., Nelson, M. T. Calcium signaling in smooth muscle. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (9), a004549 (2011).
- Hagenston, A. M., Bading, H. Calcium signaling in synapse-to-nucleus communication. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (11), a004564 (2011).
- Berridge, M. J. Elementary and global aspects of calcium signalling. J Physiol. 499 (Pt 2), 291-306 (1997).
- Lipp, P., Niggli, E. A hierarchical concept of cellular and subcellular calcium signalling). Prog Biophys Mol Biol. 65 (3), 265-296 (1996).
- Parker, I., Yao, Y., Ilyin, V. Fast kinetics of calcium liberation induced in Xenopus oocytes by photoreleased inositol trisphosphate. Biophys J. 70 (1), 222-237 (1996).
- Minta, A., Kao, J. P., Tsien, R. Y. Fluorescent indicators for cytosolic calcium based on rhodamine and fluorescein chromophores. J Biol Chem. 264 (14), 8171-8178 (1989).
- Demuro, A., Parker, I. Imaging the activity and localization of single voltage-gated Ca(2+) channels by total internal reflection fluorescence microscopy. Biophys J. 86 (5), 3250-3259 (2004).
- Smith, I. F., Parker, I. Imaging the quantal substructure of single inositol trisphosphate receptor channel activity during calcium puffs in intact mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (15), 6404-6409 (2009).
- Reissner, K. J., et al. A novel postsynaptic mechanism for heterosynaptic sharing of short-term plasticity. J Neurosci. 30 (26), 8797-8806 (2010).
- Ellefson, K. S., Parker, B., Smith, I., F, I. An algorithm for automated detection, localization and measurement of local calcium signals from camera-based imaging. Cell Calcium. , (2014).
- Smith, I. F., Wiltgen, S. M., Parker, I. Localization of puff sites adjacent to the plasma membrane: Functional and spatial characterization of calcium signaling in SH-SY5Y cells utilizing membrane-permeant caged inositol trisphosphate. Cell Calcium. 45, 65-76 (2009).
- Shuai, J., Parker, I. Optical single-channel recording by imaging calcium flux through individual ion channels: theoretical considerations and limits to resolution. Cell Calcium. 37 (4), 283-299 (2005).
