Summary
여기서 우리는 생활에 초음파 미세 기포 조영제, 고립 늦은 임신 단계 쥐의 배아를 주입하는 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 관류의 매개 변수 및 조영 증강 고주파 초음파 영상을 이용한 혈관 내 배아 분자 마커의 연구를 가능하게한다.
Introduction
조영 증강 초음파 영상 시각화하고 혈관 환경의 특성을 미세 기포 조영제를 사용한다. 이러한 에이전트는 미세 순환, 혈관 및 심장 혈관 기능의 비 침습적 평가를 할 수 있습니다. 또한, 기포 표면의 개질이 가능 혈관 질환의 분자 초음파 영상을 혈관 신생, 염증 및 아테롬성 경화증의 임상 1,2- 애플리케이션에서 입증 된 바와 같이, 내피 표적 바이오 마커에 대한 결합 미세 기포가 발생할 수있다. 콘트라스트 향상 초음파 따라서 혈관 질병과 건강 상태에 영향 3-5 복잡하고 다양한 환경을 식별하기 위해 사용될 수있다.
년의 과거 수 년, 마이크로 버블 영상의 유용성에 대한 관심이 다양한 마우스 배아 모델을 확장했다. 포유류의 개발 모델로, 배아 미세 기포 맥관계 내로 도입 생리 향상개발 순환 시스템 (예를 들어, 혈류, 심장 출력) 및 형질 전환 사례 및 심장 질환 6,7의 대상으로 돌연변이 마우스 모델에서의 연구는 심장 혈관 기능을 변경하는 방법 유전 적 요인에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 사실, 양적 및 질적 2D는 배아 뇌 혈관 분석 이미 8을 달성했다. 더욱이, 마우스의 배아는 생체 내에서 혈관 마커 타겟팅 결합 미세 기포를 검사하는 우수한 모델로서 제시한다. Bartelle 등. (9)는, 예를 들어, Biotag - 피라 유전자 변형 배아에 바인딩 및 혈관 해부학을 검토하여 대상을 평가하기 위해 태아 심장의 심실에 아비딘 미세 기포를 도입했습니다. 병원에이 기술을 번역에서 중요한 벤치 마크 - 이질 동형 접합 마우스 모델의 생성은 분자 초음파의 양적 특성을 정의하는 것을 목표로 종양 모델 연구를위한 대리로 사용할 수 있습니다.
8-10 통해 노출로 단일 배아 심장 내 주사를 통해 순환 배아에 도입된다. 자궁 내 주사 그러나 난제에 직면하고있다. 이러한 주입 안내, 어머니 표면화 배아 움직임에 대응하는 필요, 어머니 혈역학 생존을 유지하고 (11)에 의한 출혈 합병증 마취 장기적인 효과를 어드레싱 표면화 배아를 포함한다. 따라서, 조사의 목적은 거실 절연 말기 배아 미세 기포 (12) 내로 주입하는 기술을 개발하는 것이었다. 이 옵션은 분사 제어 및 위치, 장애물없이 촬상면의 재현성 간단한 이미지 분석 및 정량의 관점에서 더 많은 자유를 제공한다.
본 연구에서는 FO 살아있는 쥐의 배아에 미세 기포를 주입위한 새로운 절차 개요R 마이크로 버블 운동 동작을 연구하고의 목적은 내인성 내피 세포 표면 마커에 결합 마이크로 버블을 목표로 공부. 비선형 대비 특정 초음파 영상은 피크 향상 (PE), 세척 된 속도와 시간 고립 E17.5 배아에 (TTP)을 피크를 포함하는 기본 관류 매개 변수들로 측정하는 데 사용됩니다. 우리는 또한 활성 혈관 (13)의 부위에서 혈관 내피 세포에서의 고 발현에 endoglin은 임상 적으로 관련된 대상 함수 트랜스 제닉 마우스 모델의 배아 endoglin 손실 분자 초음파의 정량적 특성을 평가하기위한 배아 모델의 타당성을 입증 . endoglin 타겟 (MB E) 쥐 이소 IgG의 2 제어 (MB C) 및 타겟이 불분명 한 (MB U) 마이크로 버블의 접착 이형 endoglin (영어 +/-)과 동형 접합 endoglin (영어 +가 / +) 표현 배아에서 평가된다. 대상 BINDI 분석NG 분자 초음파 endoglin 유전자형을 구별 정량화 초음파 분자 수준 수용체 밀도를 관련시킬 수 있음을 보여준다.
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Protocol
참고 : 본 연구에서 수행 된 실험 절차는 동물 관리 Sunnybrook 연구소위원회 (토론토, 온타리오, 캐나다)에 의해 승인되었다. 동물의 인도적인 처리를위한 절차는 항상 준수해야합니다. 이는 연구자는 초음파 촬상 시스템의 기본적인 동작에 숙련되어있는 것으로한다. 이 프로토콜은 두 사람이 가장 잘 작동합니다.
1. 동물 모델
- 메이트 CD-1 남성과 여성 뮤스의 musculus는 관류 연구 야생형 배아를 얻었다.
- Bourdeau 등. (14)에 의해 설명 된 바와 같이 분자 영상 연구를 들어, 129 / 안녕 기원의 배아 줄기 세포를 사용하는 동종 재조합에 의해 영어 +/- 마우스를 생성합니다.
- 교잡 B6- 영어 +/- 마우스는 친절 CD-1 배경에 박사 미셸 Letarte에서 인수했다. 사용 공학과 +/- CD-1 backcrossed 배아,뿐만 아니라 영어 + / + 한배 새끼 공동ntrols. 배아를 개최 생산하는 마우스 메이트.
2. 실험 준비
- 쥐의 짝짓기를 시작하고 매일 플러그를 확인합니다. 배아 하루 0.5 질 플러그가 관찰되는 날 정오로 정의된다.
- (500)에 소 태아 혈청을 50 ㎖, 5 1 M HEPES ml의 페니실린 - 스트렙토 마이신 5 ㎖ (10,000 유닛의 페니실린, 10,000 μg의 스트렙토 마이신)을 첨가하여 배아 매체를 준비 ml의 둘 베코 변성 이글 배지 고 글루코스 (DMEM) (4500 mg의 / L). 호일로 병을 싸서 4 ℃에서 냉장 보관하십시오.
- 20 분 140 XG에 50 ML 원뿔 튜브 원심 분리기 분명 초음파 젤. 30 ml를 주사기로 헤어 젤립니다. 인산염 완충 식염수 (PBS)와 별도로 설정과 추가 (표시) 30ml의 주사기를 입력합니다. 배아의 한 쓰레기는 일반적으로 초음파 젤의 2 ~ 3 주사기와 PBS의 4 주사기 사이에 필요합니다.
- 약 30 유리 바늘을 당겨 플라 스티의 스트립에 고정 부드럽게100 × 20mm 세포 배양 접시에. 이것은 바늘을 분리하여 처리하는 동안 보안되도록. 히터 (77) 서브 자석 (55), 메인 자석 70 : 유리 풀러를 사용하여, 필라멘트 1 X 90mm 유리 모세관에 다음과 같은 설정을 사용합니다.
- 기본에 경화제의 8 부피 비율 : 1을 사용, (자신의 요리를 받게됩니다 담가 내에서 각각의 배아를 보장하기에 충분) 10-12 해부 접시를 준비합니다. 50 ML 원뿔 튜브에베이스 40ml를 붓고. 5-6 ml의 경화제를 추가하고 나무 막대기로 저어.
- 약 절반에 각을 작성, 60 X 15mm 배양 접시에 붓는다. 스탠드 O / N 설정할 수 있습니다.
- (: 0.79 mm 내경) 폴리 염화 비닐 (PVC) 튜브 400mm 긴 조각에 여성 luers를 연결합니다. 튜브 편안 초음파 단계에 주사기 펌프에서 도달해야한다.
3. 실험 장치
- 3D 및 리니어 모터 (21) 어레이와 MH 수술 현미경 이미징 플랫폼을 마련Z 변환기.
- 오리엔트 플랫폼 레일 탑재되도록 현미경의 바로 아래에 위치하는 스테이지와, 좌측에있다.
- 플랫폼의 확장 암의 볼 조인트에 3D 모터를 연결합니다. 앞으로 직면, 모터에 장착 퀵 릴리즈로 트랜스 듀서 클램프의 퀵 릴리스 후 나사, 래치를 고정, 클램프에 변환기 헤드를 위치.
- 카트의 전면 패널에있는 활성 포트 트랜스 듀서 커넥터를 고정합니다. 컴퓨터를 켭니다.
- 분자 영상 연구의 '심장'설정을 선택, 21 MHz의 초음파 변환기를 시작하고, 관류 연구를위한 '일반'. 정확한 중간 위치에 모든 시간 이득 보상 슬라이더를 이동. 주파수 : '대비 모드'의 경우 다음 매개 변수 설정 18 MHz의 전력 전송 : 30dB, 초점 : 4 % (0.39 MPa의)를, 이득 대비 비선형, 버스트 시간 : 6 10mm를, 모드 대비 100 % 0.1에서초, 빔 폭 : 와이드.
- 나누어지는 40 ml의 배아 미디어 넷 50 ML 원뿔 튜브에 각. 얼음에 놓습니다.
- 핫 플레이트에 2 L 비이커에 물 1 L를 가열. 45 ° C에서 유지한다. 예열 비커에 초음파 젤 PBS의 한 주사기를 추가합니다. 항상 온도계를 모니터링하여이 온도를 유지한다.
- 열두 1 ml의 주사기와 미세 기포의 주입을위한 열 (21) 십이 G 바늘 옆으로 열 설정합니다.
4. 수술
참고 : 외과 의사가 수술을 시작하면서 조수가 거품 (5 단계)를 준비하게한다. 여기에 설명 된 프로토콜은 휘 틀리는 등에서 적응하고있다. (15)
- 자궁 경부 전위 다음 임신 여성 마우스에서 E16.5 또는 E17.5 배아를 수집합니다.
참고 : 배아 마취의 효과는 아직 세부 사항 (16) 연구되지 않았다. 목 베기 등의 추가 방법은, 적절한 연산 할 수있다임신 한 쥐의 희생에 대한 TIONS.- 자궁 및 배아를 나타 내기 위해 복부를 오픈. 조심스럽게 빠르게 (난소와 자궁의 혈관 절단) 자궁 뿔의 끝을 절단 및 질과 방광에 절단하여 자궁을 제거합니다.
- 가시 집게를 사용하여 배아를 손상시키지 않고 가능한 한 신속하게 빙냉 배아 매체 40ml의 튜브의 자궁에 옮긴다. 마우스 시체를 버리십시오.
- 현미경 무대 이주. 100 × 20mm 세포 배양 접시에 자궁을 입금. 50 ml의 신선한 배아 매체 가득 새로운 접시에 자궁을 전송합니다.
- 부드럽게 찢어 한쪽 끝에서 시작하여 자궁의 외부 세포막을 당깁니다, 살균 (70 % 에탄올 스프레이) 미세 집게를 사용. 태반의 탈락, 정수리 난황과 분리 기본 내장 난황에서 제거 할 라이 헤르 트의 막을 노출.
- 내장 Y를 유지 하나 하나 배아를 해부OLK 주머니에 손상이없고 가능한 한 조심스럽게 (17) 태반을 처리. 배아는 즉시 팝업으로 난황의 파열을 방지하기 위해주의하십시오.
- 신선한 배아 매체와 얼음에 보관 다른 접시에 배아를 이동 천공 숟가락을 사용합니다. 필요할 때까지 냉장 배아를 유지합니다. 배아 접시에 모든 1-1.5 시간을 미디어를 변경합니다. 이러한 조건으로 배아는 해부 후 최대 4 시간 동안 가능한입니다.
5. 마이크로 버블 준비
참고 : 두 대상 및 타겟이 불분명 한 미세 기포를 사용하여 초음파와 분자 이미징을 수행합니다. ⅰ) 항체 표적 미세 기포, ⅱ) 제어 이소 타입 항체 표적 미세 기포 및 ⅲ) 타겟이 불분명 한 미세 기포 : 하나의 실험은 많은 3으로 미세 기포의 별도의 유리 병을 요구할 수 있습니다. 조영제는 동결 건조 분말로서 제공 및 주입 전에 식염수로 재구성되어야한다. 각 타겟이 불분명 한 microb에서 ~ 2 × 10 9 마이크로 버블이 있습니다ubble 유리 병 ~ 대상 준비가 유리 병에 8.8 × 10 8 마이크로 버블. 마이크로 버블은 재구성 후 최대 3 시간 동안 안정하다.
- 대상 준비 튜브의 재구성
참고 : 대상 준비 준비의 예 : endoglin 대상으로 미세 기포 (마우스 endoglin에 바이오틴 쥐 MJ 7/18 항체 MB E; 집 하이 브리 도마 시설에서); 혈관 내피 성장 인자 수용체 2 (VEGFR2) 타겟 미세 기포 (MB V, 비오틴 안티 - 마우스와 CD309); 쥐 이소 IgG의 2 제어 항체를 대상으로 미세 기포 (MB C, 비오틴 쥐 이소 IgG의 2 제어 마우스의 IgG2a를 대상으로).- 식염수 1 ㎖로 항체 용액 (20 μg의) (최종 부피)을 희석. 얼음에 보관하십시오.
- 모든 공기 방울을 제거, 1 ml의 생리 식염수와 주사기를 입력합니다. 21 G 바늘을 부착, 마이크로 버블 유리 병에 천천히 솔루션을 주입.
- 천천히 1 ml의 공기를 제거하는, 상기 플런저를 철회하고, 바늘을 철회. 부드럽게교반. 얼음에 5 분을 서 보자.
주 : 초음파 미세 기포는 고압 환경 하에서 파괴 될 수있다. - 경과 시간 후, 항체 희석으로 새 주사기를 작성하고 적절한 바이알에 추가 할 수 있습니다. 부드럽게 교반. 혼합물 (현재 2 ㎖)을 10 분 동안 서 보자. 얼음에 보관하십시오. 전체 표면 접합을 가정하면, 미세 기포에 대한 결합 리간드의 평균 개수가 약 18 7,600 리간드 / 2 ㎛이다.
- 타겟이 불분명 한 유리 병의 재구성
- 모든 공기 방울을 제거, 1 ml의 생리 식염수와 주사기를 입력합니다. 21 G 바늘을 부착, 마이크로 버블 유리 병에 천천히 솔루션을 주입.
- 천천히 1 ml의 공기를 제거하는, 상기 플런저를 철회하고, 바늘을 철회. 부드럽게 교반. 5 분을 서 보자. 상술 한 바와 같이, 추가 1 ml의 생리 식염수를 추가합니다. 부드럽게 교반과 얼음에 10 분 서 보자.
- 콜터 계수
- 부드럽게 ~ 원하는 미세 기포 유리 병을 선동하고 그릴21 G 바늘을 사용하여 1 ㎖의 용액을 주사기로 50 μL. 빈 2 ML의 microcentrifuge 관에 미세 기포를 주입한다.
- 희석제의 10 ㎖ 중에 미세 기포 스톡 용액 10 μL 샘플 피펫.
- 부드러운 혼합 한 후, 풀 베는 계수를 (재료의 목록 참조)를 사용하여 마이크로 버블 인구의 농도와 크기 분포를 평가합니다. 30 μm의 조리개를 사용하여 (유리 병 샘플 당) 세 50 μL 측정의 최소를 계산합니다.
- 주입을위한 준비 마이크로 버블
참고 : '배아로 마이크로 버블의 주입을'때 조수가이 단계를 수행합니다 (6 단계)가 시작된다. 각각의 배아 각 주사에 대해 선택된 미세 기포의 형태 무작위 마이크로 버블의 모든 유형 균등 절차 걸쳐 분포하지만 임의의 순서로되도록 소정의 보조자로 선택되도록, 한번 주입된다. 거품의 형태가 주입되는 외과 의사가 맹인 확인합니다.- 일 결정400 μL의 부피 1 × 10 8 메가 바이트 / ㎖의 최종 농도를 생산 (5.3.3 측정 스톡 농도를 이용하여 부피를 계산)하기 위해 필요한 버블 스톡 용액의 전자 볼륨. 빈 microcentrifuge 관에 식염수 해당 볼륨을 나누어지는.
- 조심스럽게 선택된 마이크로 버블 유리 병을 선동하고, 21 G 바늘을 사용하여 1 ML의 주사기로 솔루션 (위의 계산보다 50 μL 이상 ~) 초과 볼륨을 그립니다. 빈 microcentrifuge 관에 미세 기포를 주입한다.
- 마이크로 버블 원액 필요한 볼륨을 피펫과 생리 식염수를 나누어 추가 할 수 있습니다. 피펫의 끝으로 가볍게 교반하여 섞는다.
- 21 G 바늘을 사용하여 깨끗한 주사기에 희석 마이크로 버블 솔루션을 그립니다. 바늘을 제거, 주사기에서 공기 방울을 제거하고 루어와 튜브를 연결합니다. 천천히 기포를 생성하도록 확실하지 튜브 결정의 단부에 용액을 누른다.
- syrin를 삽입20㎕의 전체 부피 20 μL / 분의 속도로 미세 기포를 분배하도록 설정 시린지 주입 펌프로 GE. 튜브의 끝에 뽑아 유리 바늘을 연결합니다. 사출 단계에 가까운 펌프를 이동합니다.
태아에 마이크로 버블의 6 주입
- 무작위로 선택하고 냉장 미디어 접시에서 (천공 숟가락으로) 한 배아를 제거합니다. 입체경에서 초음파 단계에있는 해부 접시에 놓고 적어도 혈관이 나타나는 측 (antimesometrial 측)에서 찢어 / 절단, 미세 집게와 난황과 양막을 제거합니다. 쉽게이 헤드 영역에 인접한 영역을 관통함으로써 달성된다.
- 내에서 배아를 제거하기에 충분하지만, 더 이상을 잘라. 플라 스티의 작은 조각을 사용하여 해부 요리를 안정시킨다.
- 조심스럽게 배아 주변에서 주머니를 기동. 태반으로, 옆으로 배아를 놓고앞에 제대 혈관. 난황을 핀, 곤충 핀을 사용 (4 핀 권장)하고 필요에 태반의 가장자리가 장소에 부착 할 수 있습니다. 주요 혈관을 피하십시오.
- 배아가 부활 할 때까지 미리 예열 45 ° C PBS와 배아를 씻으십시오. 제대 정맥 및 관련 혈관 네트워크를 식별합니다. 주사를 편안하게 할 수 있도록 요리를 배치합니다.
참고 : 따뜻하게되면, 태아의 혈액이 눈에 띄게 제대 동맥에 펌프, 흐름을 시작합니다. 누출을 먼저 시작하면, 정맥 두 배 빠르게 동일한 표시의 피로, 밝은 빨간색 될 것입니다. 제대 정맥에서 발생하는 지점은 일반적으로 태반 표면에 대동맥에서 그 오버레이. - 배아가 부활되면, 섬세 배아 주위에서 (미세 집게를 사용) 공기 방울을 제거해야되고, 미리 예열 미국 젤로 (그러나 태반)을 커버한다. 미리 예열 PBS와 요리를 최고.
참고 : soluti의 수준에 눈을 유지필요에 따라 PBS 젤 주사기에서의 가열 비커에 백업 주사기를 추가합니다. - 해부 접시의 가장자리에 플라 스티의 큰 공을 유리 바늘을 마운트하고 PBS로 바늘 끝을 삽입합니다. 지금까지 주요 지점에서, 합리적인 태반 디스크의 융모 표면의 정맥을 선택, 가위를 사용하여 크기로 끝을 잘라. 끝이 약간 비스듬하게 절단 할 경우, 사출있는 가장 쉬운 방법입니다. 봄 가위의 가장자리를 사용하여 유리의 가장자리의 계단 현상을 제거합니다.
- 모든 공기가 바늘 끝으로부터 배출되고, 미세 기포는 PBS로 자유롭게 유동 보일 때까지 주사기 펌프를 사용하여 천천히 유리 바늘 내로 20 μL / 분 미세 기포 용액을 주입. 펌프를 중지하고 20 μL의 주입 볼륨에 대해 다시 설정합니다. 공기가 주입하는 동안 태아의 혈관 시스템에 흘러 들어 가지 않도록 할 것.
- 태반에 부드럽게 정맥 중 하나에 유리 바늘 끝을 삽입하고 움직이지되어 있는지 확인합니다. stere 멀리 스윙oscope 헤드와 위치 배아 위의 트랜스 듀서. 영상을 시작합니다.
7. 초음파 분자 영상
참고 : 이전에 설정 한 반면 비선형 영상 조건을 사용하여, 배아가 6, 10mm의 초점에 고르게 위치해 그래서 변환기를 놓습니다. 일단 위치, 미세 기포의 일시 주사를 시작합니다. 주입이 완료되면, 타이머를 시작한다.
- 관류 영상
- 비선형 대비 모드에 대한 프레임의 최대 수는 '연구 관리'버튼을 누르고 연구 브라우저 상단의 '환경 설정'탭을 클릭하여 선택되어 있는지 확인합니다. '환경 설정'창에서 해당 확인란을 선택합니다.
- 비선형 영상을 시작하여 이미지 설정을 조정합니다. 제어판의 '대비 모드'버튼을 누릅니다. '# 이득을 조정하여 이득 2D 에이전트8217; 30 dB로 다이얼 '전원'다이얼을 사용하여 4 %의 전원을 절감, '주파수'전화 넓은 롤러 볼 / 마우스를 사용하는 빔 폭 (왼쪽 아래)을 설정을 사용하여 1 Hz로 주파수를 감소.
참고 : 모든 제어가 초음파 시스템의 제어 패널에 있습니다. - 1 Hz의 프레임 레이트로 20 분 시네 루프를 기록함으로써, 미세 기포의 전체 루스 세척 - 소산 및 캡처. 를 눌러 스캔 / 동결은 데이터 수집을 시작합니다.
- 이미지의 전체 시퀀스가 포착되면, 시스템 메모리에 일련의 이미지를 저장하는 제어 패널에 위치한 '시네 가기'버튼을 누른다. 이 시스템은 획득 한 비선형 대비 모델 데이터의 날짜 스탬프 시네 루프를 만듭니다.
- 대상 마이크로 버블 이미징
- '환경 설정'에서 0.1 초에 버스트 시간을 설정합니다. 컨트롤 DES를 사용하여 적절한 촬상 파라미터를 설정위의 cribed (7.1.2.).
- 조작부 '콘트라스트 모드'버튼을 눌러 비선형 콘트라스트 촬상을 시작합니다. 배아가 제대로 변환기 하에서 및 배아를 통해 미세 기포 조영제의 흐름 비선형 콘트라스트 모드 화상의 표시되는지 확인 위치해.
- 배아 분자 영상 연구 중에 바인딩 표적으로 한 마이크로 버블을 평가하기 위해, 마이크로 버블은 3 분 주입 완료 후 40 초 동안 방해받지 않고 순환 할 수 있습니다. 이 시간은 순환 미세 기포 보유를 허용하는 것이다. 를 눌러 '스캔 / 동결'이 시간 동안 영상을 정지합니다.
- 3 분 40 초에, 이력서 영상은 배아가 적절하게 PBS로 덮여, 여전히 볼 수 있는지 확인하고, 미세 기포가 순환 계속. 를 눌러 '스캔 / 동결'촬영을 시작합니다.
- '사전 destruc를 기록하여 3 분 50 초 후 분사의 중단 / 보충 순서 획득29 Hz에서 기 '음향 응답 순서. 를 눌러 '스캔 / 동결'는 데이터 수집을 시작합니다. 4 분 포스트 분사 18,19에서, 0.1 초 고주파 탄성 버스트를 시작. 버스트를 구현하는 '버스트'버튼을 누릅니다.
- (버퍼 라인이 가득 찰 때까지) 순서의 나머지 프레임을 기록하고 '시네 저장'을 눌러 시네 루프를 저장하기 위해 계속합니다.
- 마이크로 버블 순환의 추가 시네 루프를 수집합니다. 이 이후의 '포스트 파괴'영상 시퀀스는 빔을 보충 만 순환 거품 신호를 포함하는 것으로 가정한다. 를 눌러 '스캔 / 동결'는 이미지를 수집하는 이미지와 '시네 저장'을 시작합니다.
- 각각의 배아를 이미징 후 시네 루프 레이블. 를 눌러 '연구 관리', 롤러 볼을 사용하여 파일을 선택하고 적절하게 버튼을 눌러 '이미지 레이블'와 이름을 '선택'.
주입 후 태아의 8 취급
- 촬상 후, 원하는대로 (단두, 경추 탈구, 이산화탄소 질식, 또는 급속 냉동 또는 고정 하였다 마취를 통해), 트랜스 듀서를 이동 및 고정 해제 배아를 안락사.
- 이후의 각 배아 주입을 위해 신선한 해부 접시, 바늘, 주사기와 튜브 세그먼트는 해부 부흥 동안 마이크로 버블 주입 솔루션 일어나는의 다음 배치의 준비를 사용해야합니다.
- 추가 분석을위한 조직 샘플 (예를 들면, 꼬리, 뇌)을 저장 (예를 들어, 고립 된 꼬리 DNA, LacZ를 염색, 또는 서쪽 오 (21)를 사용하여 바이오 마커의 발현을 반 정량적 측정의 PCR 분석에 의해 결정 유전자형).
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Representative Results
전 자궁 마우스 배아에 초음파 조영제의 주입은 주입 및 관련 초음파 영상의 과정을 통해 자궁과 생존의 유지 보수에서 생활, 늦은 임신 단계 배아의 성공적인 분리에 따라 달라집니다. 배아가 표면화하고도 1에 도시 된 바와 같이, 위치되면 배아 혈관에 조영제 주입 조심 가능하다. E17.5 마우스 태아의 전형적인 B 모드 초음파 이미지는도 2a에 도시된다. 미세 기포 및 세척 - 대응 인핸스 대정맥에서, 심장, 뇌, 전체 동물 내함으로써이 기술의 가능성을 보여주는 비선형 콘트라스트 이미징 방법을 사용하여 포착 될 수있다. 개별 시점은도 2b에 도시 된 시간 경과에 콘트라스트의 변화를 표시한다.
전체 세척 -에 기록 및 세척 아웃으로 O마이크로 버블 루스 F를 관류 다양한 파라미터를 측정 할 수있다. 오프라인 분석에서 대조 영역 추적 도구는 배아 좌우 뇌 반구의 관심이 1.5 mm 영역 (ROI)을 생성하는데 사용 하였다. 이 ROI 영역 내의 평균 신호 강도는 시간의 함수로서 플롯 점과 7- 중앙값 필터를 사용하여 평활화 하였다. (도 2c에 도시 됨) 얻어진 콘트라스트 강도 곡선으로부터, 뇌 피크 향상을 구 하였다. 10 % 최대 피크 강화 (PE)의 50 % 사이의 기울기로서 정의 워시 - 인 비율은, 또한 계산 하였다. 마지막으로 피크 시간 (TTP)는 피크 시간 신호 향상의 개시로부터 계산 하였다. 다른 거품 타입에서 평균 관류 매개 변수의 차이는 별도의 t-테스트 (12)를 사용하여 테스트 하였다. 표 1에 요약 이들 결과는, 미세 기포 주입을 제공 가치있는 것을 입증발달 마우스에 중요한 혈류 매개 변수를 확인하는 방법에 대한 수.
배아 미세 기포 맥관계 내로의 도입은 또한 정의와 분자 초음파 영상의 정량적 용량을 특성화 모델 시스템과 같은 마우스 배아의 사용을 가능하게한다. 다음 예에서, 유전자 조작은 마우스 배아 endoglin의 이형과 동형 발현 패턴 생성 기능 모델의 손실은 유전자형을 구별하는 초음파 촬상 분자의 능력을 시험하는데 사용되었다. 미세 기포 주입 및 파괴 / 보충 이미지의 구축 후에 "포스트 - 파괴 '서열'사전 파괴 '의 평균 신호 강도의 비율 (콘트라스트가 전력 비율을 의미라는 CMPR을 분자 신호의 측정치를 생성하기 위해 사용 된 ). (다중 비교를 위해 만든 페로 니 조정과) 선형 혼합 모델은 와트 확인하기 위해 수행되었다 hether 공학과 + / + 또는 엔지니어링 +/- 배아 (꼬리 샘플의 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)을 통해 확인 된 포스트 분사)에 결합하는 타겟 endoglin, 제어, 표적화 미세 기포 사이에 상당한 차이가 있었다. 예상 CMPR 수단은 (평균 95 % 신뢰 구간 (CI) ±) 그림 3에서 각각의 마이크로 버블 및 배아 유형 제시 및 표 2에 요약되어있다.
이러한 발견은 살아있는 배아 절연 초음파 조영제의 주입을 달성 할 수 있음을 증명 콘크리트를 제공한다. 더욱이,이 프로토콜은 관류 매개 변수 평가를 용이하게하고, 분자 초음파 촬상의 용량을 규명하기위한 노력의 배아 혈관 질환 모델에서 바인딩 대상 마이크로 버블과 비교하기 위해 사용될 수있다.
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그림 1. 실험은 고립 된 배아에 미세 기포의 주입을위한 업을 설정합니다. 20 μL 마이크로 버블 솔루션을 유리 캐 뉼러를 사용하여 태반 정맥에 주입으로 21 MHz의 선형 배열 변환기는 표면화 생활 E16.5 배아 위에 위치. 스케일 바 = 10mm. Denbeigh에서, JM 등. 권한을 가진 (12). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 표면화 생활 E17.5 태아의 초음파 이미징. (A) 배아의 B 모드 초음파 이미지. 이전 타겟 미세 기포 (t = 0 초)의 주입에 관한 것이다. (B) 전후 미세 기포 주입 후 배아 비선형 대비 이미지. 비선형 대비 이미지의 PRI또는 주입 (t = 0 초) 마이크로 버블합니다. 만 강하게 반영 인터페이스 (예를 들어, 뼈)는 부드러운 조직에서 최소한의 신호와 함께 볼 수 있습니다. 다음, 일시 주사 후 t = 50 초, t = 120 초와 t = 420 초에서 배아 내에서 미세 기포의 비선형 대비 이미지. 대비는 심장과 뇌를 포함하여 동물에 걸쳐 감지된다. 시간 강도 곡선에서 유래 (C) 관류 매개 변수를. 배아 뇌에서 하나의 투자 수익 (ROI) 내에서 시간에 따른 미세 기포의 강도 줄거리. 관류 매개 변수는 피크 강화 (PE), 세척 된 속도 (기울기), 및 (TTP)을 피크 시간을 포함한 그래프로 식별된다. 화살촉 : R = 갈비, 하프 타임 = 심장, 브롬 = 뇌. 임의 단위, AU; ROI, 관심의 영역; 초, 초. 스케일 바 = 3mm. 이 수치는 Denbeigh에서 수정 된 JM 등. (12). 큰 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림의 버전입니다.
영어 +에서 (MB E) 대상 endoglin, 제어 (MB C) 및 타겟이 불분명 한 미세 기포 (MB U) 그림 3. 평균 대비 요약 평균 전력 비율 (CMPR는) / +와 영어 +/- 배아. endoglin에서 CMPRs은 대상 미세 기포 (유전자형과 관계없이, 서로 크게 다르지 않음), (***, p <0.001) 및 MB MB C U 수집보다 유의하게 높았다. MB E 바인딩이에 비해 영어 + / + 배아 (어두운 마커)에서 유의하게 높은 것으로 나타났다영어 +/- 배아 (라이트 마커). 결과는 평균 ± 95 % 신뢰 구간으로 제시. n은 각 카테고리에서 고유 배아의 수를 나타냅니다. Denbeigh에서, JM 등. 허가 22. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 마이크로 버블 유형 | T-테스트 | |||||
| p- 값 | ||||||
| 관류 매개 변수 | MB U | MB C | MB V | MB C 대 MB U | MB V 대 MB U | MB <MB V 대 서브> C |
| 피크 향상, PE (AU) | 0.427 ± 0.063 | 0.490 ± 0.079 | 0.499 ± 0.064 | 0.19 | 0.06 | 0.81 |
| 워시의 속도 (AU / 초) | 0.008 ± 0.002 | 0.009 ± 0.002 | 0.011 ± 0.002 | 0.18 | 0.01 | 0.09 |
| 피크, TTP (초)에 시간 | 53.75 ± 7.96 | 51.75 ± 4.46 | 45.00 ± 5.33 | 0.55 | 0.03 | 0.03 |
| # 배아 주입 | 4 | 4 | 3 | |||
표 E17.5 배아 관류 매개 변수 1. 개요. 모든 배아의 ROI에 대한 시간 강도 플롯에서 파생 ± 표준 편차 (평균.U. = 임의 단위). 표는 타겟이 불분명 대한 측정 (MB U)를 포함, IgG의 2 제어 (MB C) 대상과 VEGFR2이 (MB V) 마이크로 버블을 대상으로. 별도 t-테스트 그룹을 비교 하였다. 이 테이블은 Denbeigh, JM 등. (12)에서 수정되었습니다.
| 마이크로 버블 유형 | 유전자형 | CMPR 평균 | 95 % 신뢰 구간 | |
| MB E | 영어 + / + | 9.71 | 9.05, 10.38 | |
| 영어 +/- | 5.51 | 4.87, 6.15 | ||
| MB C | 영어 + / + | 1.42 | 0.41, 2.43 | |
| 영어 +/- | 1.46 | 0.45, 2.47 | ||
| MB U | 영어 + / + | 1.7 | 0.65, 2.75 | |
| 영어 +/- | 1.76 | 0.67, 2.84 | ||
| 선형 혼합 모델 : 사이 피사체 효과 | ||||
| DF | F | p 값 | ||
| 유전자형 | (1) | 12.75 | <0.001 | |
| 마이크로 버블 유형 | 이 | 147.65 | <0.001 | |
| 유전자형 * 마이크로 버블 유형 | 이 | 18.29 | <0.001 | |
선형 혼합 모델 분석 표 2. 요약미세 기포 다중 비교를 위해 본 페로 니 보정하여, 배아 바인딩. 유전자형 미세 기포 타입과 결합 상호 작용 (유전자형 * 미세 기포 타입)을 결정 CMPR 중요한 요인 인 것으로 확인되었다. 자유의 DF는 =도. Denbeigh에서, JM 등. 허가 (22).
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Discussion
초음파 조영제가 말기 임신 마우스 배아 및 비선형 대비 이미지로 주입 하였다는 관류 매개 변수를 측정하기 위해 취득 및 바인딩 마이크로 버블을 대상으로 하였다. 배아의 혈관계 내의 미세 기포 성공적인 이미징은 다수의 인자, 제 인 배아 생존에 의존했다. 모든 장치 및 장치가 분사의 시작에서 배아의 자궁 분리에 필요한 시간을 최소화하기 위해 사전에 준비 하였다. 쥐 배아 마취 단일 또는 반복 노출의 효과를 상세하게 연구되지 않았으므로, 어머니 마취 사용 전에 회피 16을 희생시켰다. 배아 분리 동안, 난황의 손상을 방지하고, 배아 자주 리프레쉬 배아 매체에서도 항상 냉장 보관 하였다 보장하기 위해 중요하다. 주사 전에 피닝 동안 배아 exteriorizing 때 주요 난황 혈관 likelihoo를 제한 하였다 회피치명적이 될 수 출혈, d의. 우리는 배아를 되살리는 때, 처음 앞뒤로 움직이는 태아에 초음파 젤을 적용하고 집게로 어떤 큰 거품을 제거하기 전에, PBS와 태반 다음 배아를 충당하기 위해 최선의 것을 발견했다. 페트리 접시의 나머지 부분은 다음 PBS로 가득 차 있었다. 겔과 PBS의 사용은 이미지 품질에 영향을 미칠 수있는 배아와 변환기 사이 공기 주머니의 가능성을 제한했다. 배아가 부활로, 피가 제대 정맥 23 밝은 빨강 등장하면서 눈에 띄게 제대 동맥에 펌프, 흐름을 시작했다. 참고로, 제대 정맥에서 발생하는 지점은 일반적으로 표면에 태반 대동맥으로부터 그 오버레이. 이 유동 환원 태반 출혈과 세정맥의 주사 방향으로 미세 기포를 주입, 태반 미로 세동맥 내로 주입 할 수 있었지만 또한 번째 순환 전 배아를 통해 직접 통과하도록 허용 된 미세 기포를거친 태반.
때문에 그들의 취약성에, 마이크로 버블 준비 및 취급은주의를 요구했다. 초음파 미세 기포는 고압 환경 하에서 파괴 될 수있다. 각각의 재구성 및 기포 농도 실험 일관성을 유지하는 동안 측정 하였다 따라서 동일한 절차를 반복 하였다. 마이크로 버블의 단일 유리 병은 약 5-7 배아 일반적으로 충분했다. 마이크로 버블은 3 시간에 최대의 유리 병 내에 안정적이기 때문에, 여러 병은 종종 하나의 실험을 위해 필요했다. 티슈가 찢어지지 않도록, 상기 주사 바늘의 유리 팁에 가장 선명하고 가능한 한 작은 각도로 용기에 접근하면서 약간의 각도에 컷했다. 일단 트림, 바늘의 팁은 기포가 응집하지 않고 단부를 통해 용이하게 흐르도록 충분히 크지했지만, 용기 안에서 용이하게 들어갈 정도로 작은. 이상적인 크기는 일반적이었다 100 μm의 <. 적절한 판단에 연습크기가 필요했다. 팁이 너무 많으면 절단하고, 또는 차단되었다고 경우, 새로운 유리 바늘을 도포 하였다. 이는 몇몇 경우, 그것은 약간 위에 바늘 막힘을 트리밍하는 것이 가능했다. 이것이 동물의 사망을 초래할 수 있으므로, 공기가 주입하는 동안 태아의 혈관 시스템을 입력 할 수 없습니다하는 것이 중요했고 기포가 태아의 혈관에 제출하고 초음파 영상에서 검출 될 수있다 (촬영 중 원하지 않는했다 인위적으로) 임의의 측정 된 신호를 증가시킨다. 이 프로토콜에서 수행 비선형 대비 영상은 특히 작은 동물 영상 (MS250)를 위해 설계 선형 배열에 대응 한 기술 고주파 (21 메가 헤르츠) 마이크로 초음파 시스템 (Vevo2100)의 상태를 사용했다. 마이크로 또는 고주파 -ultrasound이 시점에서, 뮤린 배아 및 신생아 16 생활의 고해상도 영상을 제공하기 위해, 수 소수의 일 양상이다. 이 시스템은 75 μm의 165 μ의 축 방향 및 횡 방향의 해상도를 달성 할 수있다각각 15mm로 큰 깊이에서 m. 그것은 일반적으로 임상 악기를 사용하여 달성 및 미세 기포의 음향 신호 (펄스 반전 및 진폭 변조 기술 (24)를 포함하여) 비선형 대비 이미징 방법을 사용하여 조직을 구별 할 수있는 것보다 훨씬 더 높은 해상도에 따라서 이미지 전체 배아 수 있었다. 우리는 여기에 설명 된 초음파 설정으로 최고의 성공을 거두었 있지만, 이러한 매개 변수에 어떤 조정도 만족스러운 결과를 얻을 가능성이있다. 모든 경우에, 저전력이 짧은 버스트가 미세 기포 인구의 작은 부분을 제거하면서, 버스트의 개시에 앞서 원하지 않는 미세 기포 파괴를 방지하기 위해 미세 기포 촬상 요구된다. 연습, 단일 배아위한 전체 절차는, 분자 초음파 영상의 완료 위치로부터 대략 15 분 걸렸다. 우리는 성공적으로 한 쓰레기에서 12 배아로 많은으로 주입 한단일 세션.
사출 실험으로 인해 배아의 제한된 생존에 4 시간 창으로 제한했다. 마이크로 버블의 분포가 배아 자체의 순환에 의존 이었기 때문에, 주사는 난황과 배꼽 순환 (E9.5)의 심장 박동 (E8.5) 및 검출 흐름 전에 자리를 차지할 수 없었다 (25)를 설립되었다. E14.5까지 완료되지 태반의 성숙과 함께, 태반 미로 통해 조영제를 주입 늦은 임신 주수 중순의 배아로 제한되었다. 관찰을 바탕으로, 용어에 가까운 배아는 강건한했고, 자신의 젊은 대응보다 더 잘 혈관 볼륨의 증가를 견딜 수있다. 결합, 개발 및 혈관 성장의 후기 단계에 배아 혈관의 대비 강화 된 초음파 이미징을 제한 요인. 수용체의 조작에 관여 VASC 때문에 이것은 트랜스 제닉 마우스 모델의 유용성에 영향을 미칠 수있는울라 개발 및 유지 보수 (예를 들어, VEGFR2는, VCAM-1) 배아 치사 또는 개발의 결함 및 배아 순환 시스템 (26, 27)의 규제가 발생할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 해당 모델 시스템의 수가 분자 -1 (31), 간 부착 분자 α이 β 일 28 α 브이 β (3) (29), 혈소판 내피 세포 부착 분자 -1 (30), 혈관 세포 부착 포함 관심 혈관 바이오 마커 가능한 (32) -1과 -2 33, P-34 셀렉틴. 무엇보다, 뇌 histogenesis 가능성이 조직에 혈관 마커의 발현을하여 분자 영상의 양적 측면을 평가하는 연구를위한 기존의 종양 모델에 우수한 대안을 제공 중반 임신 11 이후에 시작됩니다.
주사의 생체 특성은 일부 limitatio을 제시하지NS. 이 배아는 어머니와 구멍이 태반 미로에서 제거 된 후에는 반복 주사를 할 일반적으로 수 (도 바람직) 아니라는 것을 주목하는 것이 중요하다. 또한, 모체 혈액 순환에서 배아를 분리하는 영양분 및 O (2)의 공급을 제한하고, 배아 건강 악화 시간은 예상된다. 저온 및 부흥 배아의 생존을 연장하면서, 또한 심장 기능에 영향을 미칠 수있다. 예를 들어, 우리는 절연 배아 (데이터를 포함하지 않음, Denbeigh 등. 12 참조) (35) 이전에 생체 내에서 관찰 된 것과 비교하여 감소 된 심장 박동을 관찰했다. 심혈관 생리학을 평가하는 연구가 정확하게 생체 조건에 반영하지 않을 것으로 여겨진다. 살아있는 말기 마우스 배아 순환계 혈역학 특성화 몇몇 연구로, 그러나 이들 실험 조건은 ALT 수있는 정도 확실하게 말할 어렵다생리 학적 기능을 어. 하나의 대안이 방법은 도전 (11)의 그것의 자신의 세트를 제시 할 수 있지만, 복강경 절개 (36)를 통해 또는 임신 한 어머니가 직접 37의 뱃속을 통해 중, 자궁에 주사를 실시하는 것입니다. 어떤 경우에는, 배아의 분리 및 exteriorization 또한 난황에서 상당한 출혈이 발생할 수 있습니다. 우리는 초음파 젤 혈류를 저해하는 것을 발견 할 수 있지만, 피 상당한 손실은 마이크로 버블의 전달 및 농도에 영향을 미칠 수 있으며,이 동물은 분석에서 제외 하였다. 분리가 제한 산모 및 모션의 배아 소스를 수행하면서 마지막으로, 심장 활동에 관한주기 운동은 피할 수 없다. 우리는 직접 타겟팅 미세 기포 신호 수용체 발현에 미치는 영향, 실시간 모션 보상 조영 증강 초음파 촬상 38 월 그러나 구현을 조사하기 위해서, 화상에 정적 뇌 선출다른 기관에 이러한 연구를 확장 할 수 있습니다.
현재 생활 개발 마우스 배아의 혈관 풍경을 평가 할 수있는 몇 이미징 애플리케이션이 있습니다. 자기 공명 영상은, 혈관 부식 캐스트, microcomputed 단층 촬영 및 광학 프로젝션 단층 촬영 (16) 사후 구현 된 반면 일부 연구가 성공적으로 도플러 휩쓸 소스 빛 간섭 단층 촬영 (39, 40)를 사용하여 생체 쥐의 배아 혈액 흐름의 라이브 영상을 수행했습니다. 배아 성장이 기간 초기 혈관 개발 및 기능에 관한 중요한 정보를 공개 할 수 있기 때문에 이것은 불행한 일이다. 생활 배아 내에서 마이크로 버블 영상 그러므로 발달 생리학에 대한 우리의 이해에 기여할 수있다. 이 기술은 기존의 방법을 대체 할 가능성이 있지만, 또한 실시간으로 살아있는 마우스 태아의 전신의 바이오 마커 분포를 시각화하는데 이용 될 수있다 (포함 조직학배아 조직에서 분자 신호의 측정 및 형광 이미징). 배아 혈관 급속히 발전 질량 그러나 밀접 종양 혈관 형성 (41, 42)에서 확인 된 동일한 키 수용체의 많은 식 종양 성장 유사한 따라서 분자량의 정량적 능력을 조사 연구에 우수한 종양 대리로서 기능 할 수있다 초음파. 따라서 우리는 한 방법뿐만 아니라 평가 및 기능적 영상을 통해 혈관 건강과 질병의 배아 모델의 특성을 유용 할 것으로 예상하지만,뿐만 아니라 분자 영상의 강점과 한계를 탐구하기위한 수단을 제공합니다. 그 응용은 마이크로 버블이 마우스 태아 조직 (10)에 벗은 DNA를 전달하는 수단으로 테스트 한 자궁 내 유전자 전달 치료를 포함한 다른 흥미로운 조사 영역이 연장. 대안 적으로, 살아있는 배아 혈관 3D 매핑도 가능이는 유전자 변형 생쥐의 형태 학적 이상에 관한 귀중한 정보를 제공 할 수있다. 고립 된 생활 배아에 초음파 조영제의 소개 때문에 병원에 조영 증강 초음파 응용 프로그램을 혈관 질환에 대한 우리의 이해를 증가시키고 번역을위한 또 다른 도구가 될 수 있습니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Antibodies (biotinylated, eBioscience) — Antibody choice depends on the experiment | |||
|
eBioscience | 13-4321-85 | This antibody/microbubble combination is often required as experimental control |
|
eBioscience | 13-5821-85 | |
| Biotinylated rat MJ 7/18 antibody to mouse endoglin | In house hybridoma | Outside antibodies may also be appropriate: we have used eBioscience (13-1051-85 ) in the past | |
| Distilled water | |||
| Embryo media | |||
|
Sigma | D5796 | |
|
ATCC | 30-2020 | lot # 7592456 |
|
Gibco | 15630 | 5 ml, 1 M |
|
Gibco | 15140-122 | 5 ml, 10,000 units Pen., 10,000 μg Strep |
| Ethanol, 70% | |||
| Ice | |||
| Paraformaldehyde | Sigma | 76240 | 4% |
| Phosphate Buffered Saline [1x] | Sigma | D8537 | 1x, w/o calcium chloride & magnesium chloride |
| Pregnant mouse, CD-1 | Charles River Laboratories Inc. | ||
| 0.9% sodium chloride (saline) | Hospira | 0409-7984-11 | |
| Ultrasound contrast agent, target ready and untargeted | MicroMarker; VisualSonics Inc. | ||
| Ultrasound gel (Aquasonic 100, colourless) | CSP Medical | 133-1009 | |
| Equipment | |||
| Cell culture plates (4) : 100 x 20 mm | Fisher Scientific | 08-772-22 | |
| Cell culture plates (12) : 60 x 15 mm | Sigma | D8054 | |
| Centrifuge | Sorvall Legend RT centrifuge | ||
| Conical tubes, 50 ml BD Falcon | VWR | 21008-938 | |
| Diluent | Beckman Coulter | Isoton II Diluent, 8448011 | |
| Dissection scissors (Wagner) | Fine Science Tools | Wagner 14068-12 | |
| Forceps (2), Dumont SS (0.10 x 0.06 mm) | Fine Science Tools | 11200-33 | |
| Forceps, splinter | VWR | 25601-134 | |
| Glass beaker, 2 L (Griffin Beaker) | VWR | 89000-216 | |
| Glass capillaries, 1 x 90 mm GD-1 with filament | Narishige | GD-1 | |
| Glass needle puller | Narishige | PN-30 | |
| Gloves | Ansell | 4002 | |
| Gross anatomy probe | Fine Science Tools | 10088-15 | |
| Hot plate | VWR | 89090-994 | |
| Ice bucket | Cole Parmer | RK 06274-01 | |
| Imaging Platform | VisualSonics Inc. | Integrated Rail System | |
| Light source, fiber-optic | Fisher Scientific | 12-562-36 | Ideally has adjustable arms |
| Luers (12), polypropylene barbed female ¼-28 UNF thread | Cole Parmer | 45500-30 | |
| Micro-ultrasound system, high-frequency | VisualSonics Inc. | Vevo2100 | |
| Needles, 21 gauge (1”) | VWR | 305165 | |
| Particle size analyzer | Beckman Coulter | Multisizer 3 Coulter Counter | |
| Perforated spoon (Moria) | Fine Science Tools | MC 17 10373-17 | |
| Pins (6), black anodized minutien 0.15 mm | Fine Science Tools | 26002-15 | |
| Pipettors [2-20 μl, 20-200 μl, 100-1,000 μl] | Eppendorf | Research Plus adjustable 3120000038; 3120000054; 3120000062 | |
| Pipettor tips [2-200 μl, 50-1,000 μl] | Eppendorf | epT.I.P.S. 22491334; 022491351 | |
| Scissors | |||
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | ||
| Tubing, Tygon laboratory 1/32” x 3/32” | VWR | 63010-007 | |
| Wooden applicator stick (swab, cotton head) | VWR | CA89031-270 | |
| Surgical microscope 5-8X magnification | Fisher Scientific | Steromaster | |
| Syringes, 1 ml Normject | Fisher | 14-817-25 | |
| Syringes (10), 30 ml | VWR | CA64000-041 | |
| Syringe infusion pump | Bio-lynx | NE-1000 | |
| Thermometer, -20-110 °C | VWR | 89095-598 | |
| Timer | VWR | 33501-418 | |
| Tubes, Eppendorf | VWR | 20170-577 | |
| Tube racks (3) | VWR | 82024-462 | |
| Ultrasound transducer, 20 MHz | VisualSonics Inc. | MS250 | |
| Vannas-Tubingen, angled up | Fine Science Tools | 15005-08 | |
References
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