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Chemistry

バイオコンジュゲーションとのアルタン Published: February 12, 2015 doi: 10.3791/52521
Automatic Translation
1, 1
1Department of Radiology, Memorial Sloan Kettering Cancer Center

Abstract

例外的な親和性、特異性、および抗体の選択性は、それらの腫瘍標的PET放射性医薬品のための非常に魅力的なベクトルを作る。それらの複数日生物学的半減期に、抗体は、比較的長い物理的な崩壊の半減期を持つ陽電子放出放射性核種で標識されなければならない。伝統的に、陽電子放出同位体124 I（T 1/2 = 4.18 D）、86 Y（T 1/2 = 14.7時間）、および64のCu（T 1/2 = 12.7時間）がための抗体を標識するために使用されてきたPETイメージング。しかし、最近では、フィールドは、抗体ベースのPETイメージング剤における陽電子放出放射性金属89 Zrの使用の劇的な増加を目撃した。それは物理的な半分を所有として89 Zrは、免疫複合体のPETイメージングのためのほぼ理想的な放射性同位体である抗体のインビボ薬物動態と互換性があり、比較的低いエンを発する-Life（T 1/2 = 78.4時間）高解像度の画像を生成するRGY陽電子。さらに、抗体は、直接にシデロフォア由来のキレート剤デスフェリオキサミン（DFO）を使用して、89 Zrを用いて標識することができる。このプロトコルでは、前立腺特異的膜抗原のターゲティング抗体J591は、例示するためのモデル系として使用される（1）抗体、（2）放射性合成および89 Zr-の精製-イソチオシアネートDFO二官能性キレート剤のバイオコンジュゲーションDFO-mAbでの放射性免疫複合体、および癌のマウスモデルにおける89のZr-DFO-mAbでの放射性免疫複合体（3） のインビボ PETイメージング。

Introduction

それらの著しい感度、親和性、及び選択性は、抗体は、長い癌細胞への放射性同位体を送達するためのベクターとして有望と考えられてきた。しかしながら、陽電子放出断層撮影（PET）イメージングへの応用は、それらの標識に適した陽電子放出放射性同位体の欠如によって妨げられてきた。放射性免疫複合体の設計において最も重要な考慮事項1-3 One物理減衰に一致さ半二重抗体のin vivoでの薬物動態への放射性同位元素の生活。より具体的には、抗体は、しばしば、比較的長い、複数日の生物学的半減期を有し、従って、同等の物理的半減期を有する放射性同位体で標識されなければならない。 PETイメージング用途のために、抗体は、伝統的に64のCu（トン1/2 = 12.7時間）、86 Y（tの1/2 = 14.7時間）、または124 I（t 1/2は= 4.18 d）の放射性標識されている。4、 5しかし、それぞれのこれらの放射性同位元素は、臨床イメージングのための適性を妨げる重大な限界を有している。 86 Y及び64 Cuで標識された放射性免疫複合体は、前臨床研究において有望であることが証明されているが、両方の同位体は、ヒトでのイメージングのために有効であるには余りにも短い物理的半減期を有する。124 I、対照的に、のためのほぼ理想的な物理的半減期を有する抗体を用いたイメージングが、それは高価であり、比較的低解像度の臨床画像につながる次善の減衰特性を有している。さらに、124 I-標識放射性免疫複合体は、 インビボでの腫瘍対バックグラウンド活性比を低下させることができるプロセスを脱ハロゲン化の対象となることができる。6,7

64のCuに取って代わる陽電子放出放射性同位元素、86 Yを見つけるために、ドライブ、および放射性免疫複合体中の124 Iは89 Zrの標識抗体の研究の最近の急増に燃料を供給しています。8-12 T89 Zrの出現のために彼の理由は簡単である：放射性診断のPET放射性免疫複合体において使用するためのほぼ理想的な化学的および物理的特性を有している13 89 Zrは89 Y た（p、n）を用いてサイクロトロンでの89 Zrの反応を介して生成される。市販の100％天然に豊富な89 Yターゲット。14,15放射性金属は、23％の陽電子収率が78.4時間の半減期で崩壊し、395.5 keVの（ 図1）の比較的低いエネルギーで陽電子を放出する。 13,16,17これは、89 Zrは、高エネルギーを放出することに留意することが重要で、909 keVのγ線99％の効率を有する。この発光は放出される511keVの光子を精力的に干渉しないが、それは、輸送、取り扱い、および線量測定に関して余分な配慮を必要としません。この警告にもかかわらず、これらの減衰特性は、最終的に89 Zrをより良好な時間を持っていないだけであることを意味Cuの86 Yおよび64より抗体によるイメージングのためのアルフ寿命もより高い687と975 keVのエネルギーの同様の100-150 keVの内のエネルギーを有する光子の数と陽電子を放出する、124 Iよりも高い解像度の画像を生成することができる511keVの陽電子が作成した光子は。13また、89 Zrがまた製造するのに安価で、取扱いが安全で、より効果的に放射性ヨウ素の対応物よりも腫瘍においてresidualizes。89 Zrの18,19つの潜在的な制限は、それが持っていないということです治療アイソトポマー、 例えば 、86 Y（PET）対90 Y（療法）。これは、それらの治療の対応のための線量測定スカウトとして用いることができる化学的に同一の、サロゲート造影剤の構築を妨げる。とはいえ、調査は89 Zrの標識抗体が90 Y軸、177呂標識免疫複合体のためのイメージング·サロゲートとしての可能性を持っていることを示唆している。20,21

化学的な観点からは、第IV族金属として、89 Zrが水溶液中で4カチオンとして存在する。のZr 4+イオンが高度に、比較的大きな（有効イオン半径= 0.84オングストローム）で充電され、「ハード」カチオンとして分類することができる。このように、ハードディスク8、アニオン性酸素ドナーまで軸受リガンドに対する選好を示す。簡単に89 Zrの標識放射性免疫複合体で使用される最も一般的なキレート剤は、デスフェリオキサミン（DFO）、3ヒドロキ基を有するシデロフォア由来の、非環式キレート剤である。リガンドは、安定的に生物学的に関連するpHレベルでRTで迅速かつクリーンジルコニウム4+カチオンを調整し、得られたジルコニウム-DFO複合体は、生理食塩水、血清、全血における複数日にわたって安定なままである22計算の研究が強く示唆DFOは、金属中心三NEUTに配位しているのZr 4+を有する配位錯体を形成すること然とリガンドの三アニオン性酸素ドナーならびに2つの外因性の水のリガンド （ 図2）。23,24 89のZr-DFO抱合足場を採用した放射性免疫複合体のin vivoでの挙動は、一般的に優れたています。しかし、いくつかのケースでは、イメージングおよび急性生体内分布の研究は89 Zrの標識抗体を注射したマウスの骨において高活性レベルを明らかにし、データosteophilic 89のZr 4+イオンがインビボでキレート剤から放出され、その後、無機化されていることを示唆している骨に。8酸素ドナーが文献に登場していると25は最近、小説89のZr 4+キレート剤の開発の調査の数は特に、現在では、それにもかかわらず、24,26,27。リガンドDFOは、最も広く採用さキレート剤である大差で89 Zrの標識放射性免疫複合体で。異なるさまざまな生物結合戦略は、チオール反応性DFOの反応は抗体中のシステインを構築し、活性化エステル有利子DFOの反応は、抗体中のリジンを構築し、バイオ直交クリックケミストリーを含む、抗体にDFOを取り付けるために使用されてきた。4,28- 30は簡単に、最も一般的な戦略、しかし、DFO、DFO-NCS（ 図2）のイソチオシアネート-ベアリング誘導体の使用であった。22この市販の二官能性キレート剤は、堅牢かつ確実のリジンとの安定した、共有結合チオ尿素結合を形成し、抗体（ 図3）。

過去数年にわたり、89のZr-DFO標識放射性免疫複合体の多種多様な文献に報告されている。前臨床研究は、そのようなCD105を標的とするTとセツキシマブ、ベバシズマブ、およびトラスツズマブより難解な抗体に、よりよく知られているに至るまで抗体をフィーチャーし、特に豊富だったRC105とfPSAのターゲティング5A10は30-36より最近では、89のZr-DFO標識抗体を使用して初期段階の臨床試験の少数が文献に登場した。具体的には、オランダのグループは、89のZr-DFO-cmAb U36、89のZr-DFO-イブリツモマブチウキセタン、及び89のZr-DFO-トラスツズマブを用いた試験を公開している。加えて、21,32,37、89と他の臨床試験の範囲Zrの標識放射性免疫複合体は、前立腺癌のイメージングおよび乳癌イメージングのためのHER2を標的とする89のZr-DFO-トラスツズマブPSMAを標的と89のZr-DFO-J591を使用して、ここでメモリアルスローンケタリングがんセンターの調査を含め、現在進行中である。23、放射性標識された抗体は、最も一般的な89のZrで標識した放射性医薬品のままさらに30、放射性もますますペプチド、タンパク質、ナノ材料を含む他のベクターに用いられてきた。38-43

この89のZr-DFOラベリング方法論のモジュール性は途方もない資産である。バイオマーカーを標的とする抗体のレパートリーは、拡大を続けるであり、これらの構築物を用いて、生体 PETイメージングで行う際の関心はたちまち成長しています。その結果、我々はより標準化された実践とプロトコルの開発は、フィールドを利益を得ることができると信じています。 DFO-NCSの共役と89のZr放射性標識のための優れた書かれた実験プロトコルは、すでにら Vosjan、によって出版されました。22私たちは、この仕事が提供する視覚的なデモはさらにこれらの技術に新しい研究者を助けることができると感じています。手元プロトコルでは、前立腺特異的膜抗原のターゲティング抗体J591は、例示するためのモデル系として使用される（1）は、抗体へのDFO -イソチオシアネート、二官能性キレート剤のバイオコンジュゲーション、89（2）放射合成及び精製ZR-DFO-のmAb放射性免疫複合体、（3）癌のマウスモデルにおける89のZr-DFO-のmAb放射性免疫複合体によるインビボ PETイメージング。23,44,45

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Protocol

記載のin vivo動物実験のすべてが承認されたプロトコルとメモリアルスローンケタリングがんセンター施設内動物管理使用委員会（IACUC）の倫理指針の下で実施した。

DFO-NCSの1抱合J591へ

  1. 1.7ミリリットルのマイクロ遠心管中で、1×リン酸緩衝生理食塩水（pH7.4）中、0.5 M HEPES緩衝液（pH7.4）のいずれか1ml中J591 2-5 mg / mlの溶液を調製する。
  2. 5-10ミリ（3.8から7.6 mg / ml）での濃度で乾燥DMSOにDFO-NCSを溶かす。超音波処理または完全な溶解を容易にするために、溶液を十分にボルテックスする。
  3. 0.1 MのNa 2 CO 3の少量のアリコート（<10μl）を添加することにより、8.8から9.0へのJ591溶液のpHを調整します。
  4. 抗体溶液は、適切なpHであると、二官能性キレート剤の3-4倍のモル過剰に相当DFO-NCS溶液の容量を追加する。
    1. 試験を受験するPLE、2 mg / mlのJ591抗体溶液（13.3ナノモルJ591）の1ミリリットルに10ミリ（7.6 mg / ml）でDFO-NCS溶液（40.4 nmolのDFO-NCS）の4-5μlを添加する。最終水性反応混合物中のDMSOの量は2％v / vのを超えてはならない。
  5. 350 rpmで攪拌​​し、加熱ブロック上で37℃で30分間、反応をインキュベートする。
  6. 37°Cで1時間後、溶出液として0.5 M HEPES緩衝液（pH7.4）を使用して、分子量50,000カットオフを有する予め充填使い捨てサイズ排除脱塩カラムを使用して得られた免疫複合体を精製する。このステップでは、完成したJ591-DFOコンストラクトの2ミリリットルソリューションが得られます。
  7. 紫外可視分光光度計で構築J591-DFOの濃度を測定します。
  8. 構築物のより高い濃度が望まれる場合は50,000分子量カットオフ遠心フィルターユニットを用いてJ591-DFO液を濃縮する。
  9. 暗闇の中で-20℃で完成したJ591-DFOの免疫複合体の溶液を保管してください。

89のZr 2.放射性標識J591-DFO

注意：プロトコルのこのステップでは、放射能の取り扱いと操作を含む。これらの手順を実行するか、放射能の研究者と他の作業を行う前に、自宅の機関の放射線安全課に相談してください。すべての可能なステップは、電離放射線への暴露を最小限に抑えるよう注意が必要です。

注：適切な放射化学ノート保持性のために、試料中の放射能の量は、投与量較正器を用いて測定されるべきであると前に、以下のプロトコルのステップ2.2から2.13の後に記録された。これは放射化学収率および具体的な活動の正確な決定に役立ちます。

  1. 0.5 M HEPES緩衝液、pH7.5の200μlのJ591-DFOの0.5-2.0ミリグラムの溶液を調製する。
  2. の音量をピペット<SUP> 89のZr 4+ストック溶液（典型的には1.0 Mのシュウ酸で供給される）2ミリリットルプラスチック製スクリューキャップマイクロ遠心チューブに1.0から6.0 mCiの（37から222 MBqの）に対応する。 1.0Mのシュウ酸を用いて合計300μlにこの溶液の体積を調整します。
  3. 1.0 MのNa 2 CO 3を使用して、6.8から7.5への89のZr 4+溶液のpHを調整します。ソリューション4+ 89のZrに1.0 MのNa 2 CO 3250μlのを追加することから始め、その後、所望のpHを達成するためにベースの小さい（<10μl）をアリコートを追加します。
  4. ステップ2.1で作成J591-DFO溶液にpH調整した89のZr 4+溶液の所望の量を追加します。
  5. それは6.8〜の所望の範囲内にあることを確実にするために、放射性標識化反応混合物のpHをチェックする。
  6. 350 rpmで攪拌​​し、加熱ブロック上に室温で60分間の放射標識反応をインキュベートする。
  7. インキュベーションの60分後に、ラジアン測定放射性TLCを用いて反応の収率をiolabeling。
    1. この目的のために、シリカ含浸TLCストリップ上に放射標識反応混合物を1μCiのスポット。 50 mMのDTPA（pHは5.5）の溶離液を使用して、TLCを実行し、アリコートを乾燥させると放射性TLCスキャナーを使用してTLCストリップを分析する。89のZr 4+、原点に表示されますJ591-DFOコンストラクトに結合している（R F <0.1）、Zrの89自由しばらく4+陽イオンはDTPAによってキレート化され、溶媒の先端（R fに溶出することになる> 0.9）。
    2. 、ラジオクロマトグラムを統合する曲線下の総面積で0.0から0.1 F Rから曲線下面積を分割して、100を掛けることにより反応の放射性標識収量を計算します。
  8. 放射能標識収率は十分（通常は> 2のmCi / mgでの理論的な比活性）である場合、50 mMのDTPA、pH5.5で5μlので反応をクエンチした。
  9. 生じた免疫複合体のUSIを精製ngの5 mg / mlのゲンチシン酸5mg / mlのゲンチシン酸又は0.25 M酢酸ナトリウム（pH5.5）中0.9％滅菌生理食塩水のいずれかの溶離液を使用して分子量50,000カットオフを有する予め充填された使い捨てのサイズ排除脱塩カラム。このステップでは、完成した89のZr-DFO-J591の放射性免疫複合体の2ミリリットルソリューションが得られます。
  10. ステップ2.7で説明したように精製した後、放射性TLCを用いて、89のZr-DFO-J591の放射化学的純度を確認する。
  11. 最初に精製された89のZr-DFO-J591の放射性免疫複合体を用いて単離した放射能の量によって抗体溶液に加え活動量を分割することによって反応の全体的な放射性標識の収量を計算します。
  12. 放射標識反応におけるDFO-J591の初期質量によって精製89のZr-DFO-J591の放射性免疫複合体を用いて分離活性量で除して、最終的な比活性を計算します。
  13. より高い濃度が望まれる場合、第集中分子量50,000カットオフ遠心フィルターユニットを使用して電子89のZr-DFO-J591溶液。
    注：最終精製工程で使用ゲンチシン酸は放射線分解に起因する抗体の分解を最小限にするために用いられる放射性保護で46ながら4℃で最大48時間、89のZr-DFO-J591の放射性免疫複合体の貯蔵。ことが可能であり、これはお勧めしません。放射性免疫複合体を保存する場合には、次亜塩素酸塩媒介性放射線分解のリスクを最小限にするために、保存緩衝液として5 mg / mlのゲンチシン酸を0.25 M酢酸ナトリウム（pHは5.5）を使用する。47

89のZr-DFO-J591によるインビボ PETイメージング3.

注意：プロトコル2節と同様に、プロトコルのこのステップでは、放射能の取り扱いと操作を含む。これらの手順を実行する前に研究者は、自宅の機関の放射線安全課に相談してください。すべてのpossibルステップは、電離放射線への暴露を最小限に抑えるように注意すべきである。

  1. オスの無胸腺ヌードマウスでは、皮下インプラント5×10 6のLNCaP前立腺癌細胞と、これらは100〜150ミリメートル3異種移植片（接種後3〜4週間）に成長することができます。44
  2. 0.9％滅菌生理食塩水で1.0 mCiの/ mlの濃度になるように89のZr-DFO-J591の放射性免疫複合体を希釈する。
  3. 異種移植片担持マウスの外側尾静脈に48; 89のZr-DFO-J591溶液（7.4 MBqの200μCiの）200μlを注入する。
  4. 酸素ガス混合物：所望の撮影時点（ 例えば、12、24、48、72、96、または120時間後に注射）で、2％イソフルランでマウスを麻酔。
  5. 小動物PETスキャナーのベッドの上にマウスを置き、1％イソフルラン使用して、スキャン中に麻酔を維持：酸素ガス混合物を。スキャナベッドの上で動物を配置する前に、つま先ピンチ方式とAPPLを使用して麻酔を検証麻酔中の乾燥を防ぐために、マウスの目にyの眼軟膏。49
  6. 350〜700 keVのエネルギーウィンドウと6ナノ秒の一致タイミングウィンドウを使用して4000万一致するイベントの最小限の静的スキャンを経由して、マウス用のPETデータを取得する。50
  7. 画像の取得を完了した後、無人のマウスを残していないし、それが意識を取り戻したまで他のマウスとケージに入れないでください。

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Representative Results

抗体にこのプロトコルの最初のステップDFO-NCSの結合は、一般的に非常に堅牢で信頼性の高いです。一般的に、精製され、キレート剤で修飾された免疫複合体は、> 90％の収率で得ることができ、初期結合反応にDFO-NCSの3モル当量を使用する度標識約1.0~1.5 DFOのキレート剤が得られる/モノクローナル抗体。手順の89 Zrの放射性標識および精製工程も同様に簡単です。上記のプロトコルに概説された濃度80％>の放射性標識収率および> 2.0 mCiの/ MGのため、具体的な活動で、室温で60分後に典型的なものである。粗製の放射標識混合物の放射性TLCクロマトグラムは、おそらく溶媒の先端（ 図4A）で溶出するいくつかのDTPA結合89のZr 4+を明らかにする。しかし、DTPAとの反応をクエンチし、89のZr-DFO-mAbでの精製後、サイズ排除クロマトグラフィー、radiocを介して構築する精製され、孤立した89のZr-DFO-のmAb結合体のhemical純度は> 95％（ 図4B）である必要があります。単離された89のZr-DFO-mAbの結合体の放射化学的純度は95％未満である場合に、精製手順の前に、in vitroまたはin vivo実験で任意に実行することに繰り返されるべきである。

上述のプロトコルにおけるインビボ実験、PSMA発現を有する無胸腺ヌードマウスに移動する、のLNCaP前立腺癌異種移植片89のZr-DFO-J591 のインビボでの挙動を調査するために使用した。急性生体内分布およびPET画像化実験の両方が89のZr-DFO-J591は明らかに優れた画像コントラストと高い腫瘍対バックグラウンド活性比（ 図5）と前立腺癌異種移植片の輪郭を描くことを明らかにした。腫瘍中の放射性免疫複合体の取り込みは、初期の24時間（5.6％のID / gの±20.9％）、及び活性などのように明らかである96時間、注射後で57.5％±5.3％のID / gを最大に腫瘍が増大する濃度。放射性免疫複合体のための典型的なように、放射性トレーサーの比較的高濃度の過血液中の放射能の量でゆっくり減少した後、初期の時点（24時間で9.1％±5.3％のID / g）に、血液中に存在する実験の過程。最も高い活性濃度の非標的組織は、おそらくosteophilicカチオン89のZr 4+のインビボ放出の結果として、実験を通して10％ID / gの周り取り込み値を表示骨た。他のすべての心臓、肺、肝臓、脾臓、胃、大腸および小腸を含む器官、腎臓、および筋肉がしばしばうまく5％ID / g未満、比較的低い放射能濃度を示した。コントロールとして、マウスの追加のコホートは、抗原を飽和させ、従って、選択的な遮断を示すために同時注入300μgの非標識DFO-J591を注射した。 Criti的には、ブロッキング実験は、89のZr-DFO-J591は、選択的にそのターゲットのことを示す、72時間後の注射で11.1％のID / gの±23.5％に9.3％のID / gの±48.9％から腫瘍における放射性免疫複合体の取り込みを低下させ抗原。

図1
図1（A）単純化された減衰方式と、（B）89 Zrの一部の顕著な減衰特性13,16,17 ITは、異性体の移行を=。 EC =電子捕獲。修正やらデリ、から許可を得て転載。核医学と生物学 。40、3-14（2013）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

2再 "SRC =" /ファイル/ ftp_upload / 52521 / 52521fig2highres.jpg "幅=" 700px "/>
図2（A）赤色配位酸素原子とDFO-NCSの構造。 （B）のZr-DFO配位錯体のDFT由 ​​来の構造。修正やらデリ、から許可を得て転載。医薬品化学のジャーナル。57、4849から4860（2014）。著作権2014米国化学会。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3

89のZr-DFO-J591の生体接合及び放射性標識の図3.スキーム。ら= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4
89のZr-DFO-J591の粗放射性標識混合物（A）と精製された生成物（B）の図4.代表放射性TLCクロマトグラム。ラジオのTLCは、50 mMのDTPA、pHが5.0の溶離液を使用したシリカのストリップ上で実行された。 してくださいこの図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

図5
図89のZr-DFO-J591（11.1から12.9 MBqの[300から345μCiの]200μlの0.9％滅菌生理食塩水に尾静脈を介して注入）皮下を保有する無胸腺ヌードマウスにおいて、PSMA発現の5冠状PET画像を24と120時間後の注射の間のLNCaP前立腺癌異種移植片（白矢印）。修正と、 ら Zeglisから許可を得て転載。バイオコンジュゲートケミ ​​ストリー 。24、1057から1067（2013）。著作権2013米国化学会。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Discussion

89のZr-DFO-表示のある放射性免疫複合体の建設、放射性標識、およびイメージングは、一般的に、むしろ簡単な手順ですが、それはプロセスの各ステップの間に念頭に置いて、いくつかの重要な考慮事項を維持することが重要である。例えば、おそらく手続きの共役工程中の懸念の原因として最も可能性が高い結合反応中の抗体の集合体である。この問題は、ほとんどの場合、DFO-NCSストック溶液の添加後、結合反応の不十分な混合の生成物である。この場合、DFO-NCSの非均質な分布を有する局所反応の過度に高いレベルを引き起こす可能性が22今度は集計につながること抗体。この問題は、比較的容易に徹底的DFO-NCSの添加後、反応混合物を混合し、temperaturに反応混合物を攪拌し、少量のアリコート（<5μlの）でDFO-NCSのストック溶液を添加することによって回避することができる電子制御シェーカー。また、DFO-mAbの構築物のコンジュゲーション及び精製の後、それは正確に各mAbに結合体化DFOの数を決定することが重要である。抗体当たりDFOキレートの数の完全な特徴付けは、オランダによって実行されるものと同様の放射同位体希釈実験を用いて達成することができるら 、アンダーソンら 、MALDI-TOF質量分析法でありながら実行可能な代案。14,23 、放射性標識工程の間30,51,52は 、簡単に、最も一般的な問題は、予想を下回る放射性標識の利回りである。予想外に低い利回りが熱心に上記のプロトコルを以下にもかかわらず発生した場合には、三つの異なるトラブルシューティングの戦略が用意されています（1）時間の長い量のための放射能標識反応をインキュベートする（ 例えば、2〜3時間）; （2）抗体の高い濃度を用いて放射標識反応を繰り返す。または（3）番目の高いモル過剰を使用して初期DFO-NCSの抱合反応を繰り返すことE二官能性キレート剤。

DFO-NCSの結合が容易かつ堅牢である一方、その紛れもない弱点の一つは、サイト固有ではないということです：DFO-NCSは関係なく、自分の位置の抗体で利用可能なリジンとチオ尿素結合を形成している。その結果、キレート剤が悪影響89のZr-DFO標識結合体の免疫反応性に影響を与え、抗体の抗原結合領域に付加さになる可能性がある。そのため、微妙なバランスは89 Zrの標識放射性免疫複合体の構築に打たれている必要があります。抗体あたりキレート剤のより高い数字はより高い具体的な活動を促進しますが、ラベル付けの高い度も構築体の免疫反応性を損なうことのリスクを増大させる。最終的に、目標は単純です：免疫反応性を損なうことなく、必要な限り多くのキレート剤を添付します。精製された89のZr-DFO-mAbでの放射性免疫複合体を得た後、それを判断することが重要であるin vivoでの実験に先立って、構築物のin vitroでの免疫反応性。この目的のために、我々は他 Lindmo、によって出版インビトロ法を使用することを推奨。53,54構築物の免疫反応性が80〜90％未満である場合は、結合反応に戻り、DFOより少ない部分を追加する必要があるかもしれない抗体あたり。精製された89のZr-DFO-mAbの免疫反応性が高い（> 90％）およびより高い特異的活性が望まれる場合代わりに、それは免疫反応性を低下させることなく抗体にさらにキレート剤を付着させることも可能である。

最後に、89のZr-DFO標識抗体のインビボでの挙動は、抗体の同定および使用する腫瘍モデルの両方に大きく依存し、もちろんである。ここに提示されたモデル系では、腫瘍の最大取り込み値は約60％ID / gに達した。しかし、最大の腫瘍の取り込みvについて文献で報告されalues ​​は、低い15〜20％のID / gで80〜90％ID / gと高い範囲で33,44,55-57同様に、非標的組織における取り込み量-特に肝臓および脾臓を - 研究された抗体/抗原系に応じて広く変えることができる。 89のZr-DFO標識抗体の比活性は、 インビボ実験のための重要な検討事項である。 89のZr-DFO-mAbの具体的な活動のための文献値は、一般的に1-6 mCiの/ MG（37から222 MBQ / mg）の範囲である。彼らは不注意の可能性を減少させるように8,10一般的に、より高い具体的な活動は、好ましい抗原（ すなわち、自己ブロッキング）の飽和。これは、より低いレベルの抗原発現を備えたシステムでは特にそうなります。関係なく、抗体/抗原システムの、89のZr-DFO標識造影剤のin vivoの調査は、選択のデモンストレーションなしで完全ではない。これは、使用したブロッキング実験を介して達成することができる非標識の生体分子または当該抗原を発現しない細胞株の使用を大量。本明細書中に記載された手順では、前者を採用したが、89のZr-DFO-J591の選択はまた、PSMA陰性PC3前立腺癌異種移植片を使用して実証されている。23

それは明らかな利点にもかかわらず、このDFO-NCSベースの合成法が完全でないことに注意することが重要である。私たちが議論してきたように、DFOは、89のZr 4+のための理想的なキレート剤ではなく、結合反応の非サイト固有の性質は、面倒な証明することができます。これらの問題を回避するために、89のZr 4+およびサイト固有の放射性標識の方法論の新たなキレート剤を開発するための刺激的な努力が現在進行中で、まだこれらの新技術は、まだ研究室や診療所の両方に最適化され、検証される必要がある。24,26,27、最終的に29,44、建設のためのDFO-NCSの方法論89のZr-DFO標識抗体は、放射性免疫複合体の合成のための非常に強力なツールであることが証明され、臨床的に有用な放射性医薬品の多種多様を作成するために使用される可能性を有している。

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Disclosures

著者らは、開示することは何もない。

Acknowledgments

著者は役立つ会話教授トーマス·ライナー、博士ヤコブホートン、博士セルジュLyaschenkoに感謝。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
p-SCN-Bn-DFO Macrocyclics B-705 Store at -80 °C
[89Zr]Zr-oxalate Various, including Perkin-Elmer Caution: Radioactive material
PD-10 Desalting Columns GE Healthcare 17-0851-01  Store at room temperature
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units EMD Millipore UFC805024 Store at room temperature
Silica Gel Impregnated RadioTLC Paper Agilent Technologies SGI0001 Cut into strips 0.5 cm wide

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References

  1. Wu, A. M. Antibodies and antimatter: The resurgence of immuno-PET. Journal of Nuclear Medicine. 50 (1), 2-5 (2009).
  2. Wu, A. M., Olafsen, T. Antibodies for molecular imaging of cancer. Cancer Journal. 14 (3), 191-197 (2008).
  3. Wu, A. M., Senter, P. D. Arming antibodies: prospects and challenges for immunoconjugates. Nature Biotechnology. 23 (9), 1137-1146 (2005).
  4. Zeglis, B. M., Lewis, J. S. A practical guide to the construction of radiometallated bioconjugates for positron emission tomography. Dalton Transactions. 40 (23), 6168-6195 (2011).
  5. Zalutsky, M. R., Lewis, J. S. Handbook of Radiopharmaceuticals. Welc, M. J., Redvanly, C. S. 24, Wiley. New York, NY. 685-714 (2003).
  6. Carrasquillo, J. A., et al. 124I-huA33 antibody PET of colorectal cancer. Journal of Nuclear Medicine. 52 (8), 1173-1180 (2011).
  7. Divgi, C. R., et al. Preoperative characterisation of clear-cell renal carcinoma using iodine-124-labelled antibody chimeric G250 (124I-cG250) and PET in patients with renal masses: a phase I trial. The Lancet Oncology. 8 (4), 304-310 (2007).
  8. Severin, G. W., Engle, J. W., Barnhart, T. E., Nickles, R. J. Zr-89 radiochemistry for positron emission tomography. Medicinal Chemistry. 7 (5), 389-394 (2012).
  9. Nayak, T. K., Brechbiel, M. W. Radioimmunoimaging with longer-lived positron-emitting radionuclides: potentials and challenges. Bioconjugate Chemistry. 20 (5), 825-841 (2009).
  10. Vugts, D. J., Van Dongen, G. 89Zr-labeled compounds for PET imaging guided personalized therapy. Drug Discovery Today. 8 (2), e53-e61 (2011).
  11. Dongen, G. A. M. S., Visser, G. W. M., de Hooge, M. N. L. ub-, de Vries, E. G., Perk, L. R. Immuno-PET: a navigator in monoclonal antibody development and applications. Oncologist. 12 (12), 1379-1389 (2007).
  12. Deri, M. A., Zeglis, B. M., Francesconi, L. C., Lewis, J. S. PET imaging with 89Zr: From radiochemistry to the clinic. Nuclear Medicine and Biology. 40 (1), 3-14 (2013).
  13. Holland, J. P., Williamson, M. J., Lewis, J. S. Unconventional nuclides for radiopharmaceuticals. Molecular Imaging. 9 (1), 1-20 (2010).
  14. Holland, J. P., Sheh, Y. C., Lewis, J. S. Standardized methods for the production of high specific-activity zirconium-89. Nuclear Medicine and Biology. 36 (7), 729-739 (2009).
  15. Meijs, W. E., et al. Production of highly pure no-carrier added 89Zr for the labelling of antibodies with a positron emitter. Applied Radiation and Isotopes. 45 (12), 1143-1147 (1994).
  16. Vugts, D. J., van Dongen, G. A. M. S. 89Zr-labeled compounds for PET imaging guided personalized therapy. Drug Discovery Today: Technologies. 8 (2-4), e53-e61 (2011).
  17. Severin, G. W., Engle, J. W., Barnhart, T. E., Nickles, R. J. 89Zr radiochemistry for positron emission tomography. Medicinal Chemistry. 11 (7), 389-394 (2011).
  18. Perk, L. R., et al. Quantitative PET imaging of Met-expressing human cancer xenografts with 89Zr-labelled monoclonal antibody DN30. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 35 (10), 1857-1867 (2008).
  19. Knowles, S. M., et al. Quantitative immunoPET of prostate cancer xenografts with Zr-89- and I-124-labeled anti-PSCA A11 minibody. Journal of Nuclear Medicine. 55 (3), 452-459 (2014).
  20. Rizvi, S. F., et al. radiation dosimetry and scouting of 90Y-ibritumomab tiuxetan therapy in patients with relapsed B-cell non-Hodgkin's lymphoma using 89Zr-ibritumomab tiuxetan and PET. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 39 (3), 512-520 (2012).
  21. Perk, L. R., et al. Preparation and evaluation of Zr-89-Zevalin for monitoring of Y-90-Zevalin biodistribution with positron emission tomography. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 33 (11), 1337-1345 (2006).
  22. Vosjan, M., et al. Conjugation and radiolabeling of monoclonal antibodies with zirconium-89 for PET imaging using the bifunctional chelate p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine. Nature Protocols. 5 (4), 739-743 (2010).
  23. Holland, J. P., et al. Zr-89-DFO-J591 for ImmunoPET of prostate-specific membrane antigen expression in vivo. Journal of Nuclear Medicine. 51 (8), 1293-1300 (2010).
  24. Deri, M. A., et al. Alternative chelator for (89)Zr-radiopharmaceuticals: Radiolabeling and evaluation of 3,4,3-(LI-1,2-HOPO). Journal of Medicinal Chemistry. 57 (11), 4849-4860 (2014).
  25. Abou, D. S., Ku, T., Smith-Jones, P. M. In vivo biodistribution and accumulation of 89Zr in mice. Nuclear Medicine and Biology. 38 (5), 675-681 (2011).
  26. Guerard, F., Lee, Y. S., Brechbiel, M. W. Rational design, synthesis, and evaluation of tetrahydroxaminc acid chelators for stable complexation of zirconium(IV). Chemistry: A European Journal. 20 (19), 5584-5591 (2014).
  27. Guerard, F., et al. Investigation of Zr(IV) and 89Zr(IV) complexation with hydroxamates: progress towards designing a better chelator than desferrioxamine B for immuno-PET imaging. Chemical Communications. 49 (10), 1002-1004 (2013).
  28. Zeglis, B. M., et al. Modular strategy for the construction of radiometalated antibodies for positron emission tomography based on inverse electron demand Diels-Alder click chemistry. Bioconjugate Chemistry. 22 (10), 2048-2059 (2011).
  29. Tinianow, J. N., et al. Site-specifically Zr-89-labeled monoclonal antibodies for ImmunoPET. Nuclear Medicine and Biology. 37 (3), 289-297 (2010).
  30. Holland, J. P., et al. Measuring the pharmacodynamic effects of a novel Hsp90 inhibitor on HER2/neu expression in mice using Zr-89-DFO-trastuzumab. PLoS ONE. 5 (1), (2010).
  31. Aerts, H., et al. Disparity between in vivo EGFR expression and Zr-89-labeled cetuximab uptake assessed with PET. Journal of Nuclear Medicine. 50 (1), 123-131 (2009).
  32. Nagengast, W. B., et al. Zr-89-Bevacizumab PET of early antiangiogenic tumor response to treatment with HSP90 inhibitor NVP-AUY922. Journal of Nuclear Medicine. 51 (5), 761-767 (2010).
  33. Nagengast, W. B., et al. In vivo VEGF imaging with radiolabeled bevacizumab in a human ovarian tumor xenograft. Journal of Nuclear Medicine. 48 (8), 1313-1319 (2007).
  34. Dijkers, E. C. F., et al. Development and characterization of clinical-grade Zr-89-trastuzumab for HER2/neu immunoPET imaging. Journal of Nuclear Medicine. 50 (6), 974-981 (2009).
  35. Ulmert, D., et al. Imaging androgen receptor signaling with a radiotracer targeting free prostate-specific antigen. Cancer Discovery. 2 (4), 320-327 (2012).
  36. Hong, H., et al. Positron emission tomography imaging of CD105 expression with 89Zr-Df-TRC105. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 39 (1), 138-148 (2012).
  37. Dijkers, E. C., et al. Biodistribution of Zr-89-trastuzumab and PET omaging of HER2-positive lesions in patients with metastatic breast cancer. Clinical Pharmacolog., & Therapeutics. 87 (5), 586-592 (2012).
  38. Heneweer, C., Holland, J. P., Divilov, V., Carlin, S., Lewis, J. S. Magnitude of enhanced permeability and retention effect in tumors with different phenotypes: Zr-89-abumin as a model system. Journal of Nuclear Medicine. 52 (4), 625-633 (2011).
  39. Holland, J. P., et al. Annotating MYC status with 89Zr-transferrin imaging. Nature Medicine. 18 (10), 1586-1591 (2012).
  40. Jacobson, O., et al. MicroPET imaging of integrin avB3 expressing tumors using 89Zr-RGD peptides. Molecular Imaging and Biology. 13 (6), 1224-1233 (2011).
  41. Keliher, E. J., et al. 89Zr-labeled dextran nanoparticles allow in vivo macrophage imaging. Bioconjugate Chemistry. 22 (12), 2383-2389 (2011).
  42. Abou, D. S., et al. 89Zr-labeled paramagnetic octreotide-liposomes for PET-MR imaging of cancer. Pharmaceutical Research. 30 (3), 878-888 (2013).
  43. Miller, L., et al. Synthesis, characterization, and biodistribution of multiple 89Zr-labeled pore-expanded mesoporous silica nanoparticles for PET. Nanoscale. 6 (9), 4928-4935 (2014).
  44. Zeglis, B. M., et al. An enzyme-mediated methodology for the site-specific radiolabeling of antibodies based on catalyst-free click chemistry. Bioconjugate Chemistry. 24 (6), 1057-1067 (2013).
  45. Nanus, D. M., et al. Clinical use of monoclonal antibody HuJ591 therapy: targeting prostate specific membrane antigen. Journal of Urology. 170 (6 Pt 2), S84-S88 (2003).
  46. Joshi, R., Gangabhagirathi, R., Venu, S., Adhikari, S., Mukherjee, T. Antioxidant activity and free radical scavenging reactions of gentisic acid: in vitro and pulse radiolysis studies. Free Radical Research. 46 (1), 11-20 (2012).
  47. Saran, M., Bors, W. Radiation chemistry of physiological saline reinvestigated: evidence that chloride-derived intermediates play a key role in cytotoxicity. Radiation Research. 147 (1), 70-77 (1997).
  48. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Prichett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), e2771 (2012).
  49. Collier, H., Warner, B. T., Skerry, R. Multiple toe-pinch method for testing analgesic drugs. British Journal of Pharmacology and Chemotherapeutics. 17, 28-40 (1961).
  50. Zanzonico, P. Positron emission tomography: a review of basic principles, scanner design and performance, and current systems. Seminars in Nuclear Medicine. 34 (2), 87-111 (2004).
  51. Anderson, C. J., et al. Copper-64-labeled antibodies for PET imaging. Journal of Nuclear Medicine. 33 (9), 1685-1691 (1992).
  52. Anderson, C. J., et al. Preparation, biodistribution and dosimetry of copper-64-labeled anti-colorectal carcinoma monoclonal antibody fragments 1A3-F(ab')2. Journal of Nuclear Medicine. 36 (5), 850-858 (1995).
  53. Lindmo, T., Boven, E., Cuttitta, F., Fedorko, J., Bunn, P. A. Determination of the immunoreactive fraction of radiolabeled monoclonal antibodies by linear extrapolation to binding at infinite antigen excess. Journal of Immunological Methods. 72 (1), 77-89 (1984).
  54. Lindmo, T., Bunn, P. A. Determination of the true immunoreactive fraction of monoclonal antibodies after radiolabeling. Methods in Enzymology. 121 (1), 678-691 (1986).
  55. Cohen, R., et al. Inert coupling of IRDye800CW to monoclonal antibodies for clinical optical imaging of tumor targets. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 1 (1), 31-43 (2011).
  56. Ruggiero, A., et al. Targeting the Internal Epitope of Prostate-Specific Membrane Antigen with Zr-89-7E11 Immuno-PET. Journal of Nuclear Medicine. 52 (10), 1608-1615 (2011).
  57. Nayak, T. K., Garmestani, K., Milenic, D. E., Brechbiel, M. W. PET and MRI of Metastatic Peritoneal and Pulmonary Colorectal Cancer in Mice with Human Epidermal Growth Factor Receptor 1-Targeted Zr-89-Labeled Panitumumab. Journal of Nuclear Medicine. 53 (1), 113-120 (2012).

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化学、問題96、陽電子放射断層撮影法、抗体、バイオコンジュゲーション、免疫結合体、デスフェリオキサミン、
バイオコンジュゲーションとのアルタン<sup&gt; 89</sup&gt;のZr-DFO標識抗体
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Zeglis, B. M., Lewis, J. S. The… More

Zeglis, B. M., Lewis, J. S. The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies. J. Vis. Exp. (96), e52521, doi:10.3791/52521 (2015).

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