Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Den Bioconjugation og radiosynthesis av Published: February 12, 2015 doi: 10.3791/52521
Automatic Translation
1, 1
1Department of Radiology, Memorial Sloan Kettering Cancer Center

Abstract

Den eksepsjonelle affinitet, spesifisitet og selektivitet av antistoffer gjør dem svært attraktive vektorer for tumormålrettet PET radiofarmasøytika. På grunn av deres multi-dagers biologisk halveringstid, må antistoffene merkes med positron-emitterende radionuklider med relativt lange fysisk råte halveringstider. Tradisjonelt har positron-emitterende isotoper 124 I (t 1/2 = 4,18 d), 86 Y (t 1/2 = 14,7 timer) og 64 Cu (t todel = 12,7 timer) har blitt brukt til å merke antistoffer for PET billeddiagnostikk. I den senere tid har imidlertid feltet vært vitne til en dramatisk økning i bruken av positron-emitterende radiometall 89 Zr i antistoffbaserte PET-avbildningsmidler. 89 Zr er en nesten ideell radioisotop for PET-avbildning med immunkonjugater, som det har en fysisk halv -livet (t 1/2 = 78,4 t) som er kompatibel med de in vivo farmakokinetikken av antistoffer og avgir en relativt lav eneRGY positron som produserer bilder med høy oppløsning. Videre kan antistoffer bli oversiktlig merket med 89 Zr hjelp av siderofor-avledet chelator desferrioksamin (DFO). I denne protokollen vil prostata-spesifikt membran antigen antistoff rettet J591 brukes som et modellsystem for å illustrere (1) bioconjugation av det bifunksjonelle chelateringsmiddel DFO-isotiocyanat til et antistoff, (2) den radiosynthesis og rensing av en 89 Zr- DFO-mAb radioimmunkonjugat, og (3) in vivo PET avbildning med en 89 Zr-DFO-mAb radioimmunkonjugat i en murin modell av kreft.

Introduction

På grunn av deres bemerkelsesverdige følsomhet, affinitet og selektivitet, har antistoffer lenge vært ansett som lovende vektorer for levering av radioisotoper til kreftceller. Imidlertid har sin søknad i positronemisjonstomografi (PET) bildebehandling blitt hemmet av mangel på et passende positron-emitting radioisotop for deres merking. 1-3 En av de mest kritiske betraktninger i utformingen av radioimmunoconjugates er samsvar den fysiske forfallet halv- levetiden av radioisotopen til de in vivo farmakokinetikk til antistoffet. Mer spesifikt antistoff har ofte forholdsvis lange, flere dager biologiske halveringstider og må derfor være merket med radioisotoper med sammenlignbare fysikalske halveringstider. For PET bildebehandlingsprogrammer, har antistoffer tradisjonelt vært radiomerket med 64 Cu (t 1/2 = 12,7 timer), 86 Y (t 1/2 = 14,7 timer), eller 124 I (t 1/2 = 4,18 d). 4, 5 Imidlertid, for hvertdisse radioisotoper besitter betydelige begrensninger som hindrer deres egnethet for klinisk imaging. Mens radioimmunoconjugates merket med 86 Y og 64 Cu har vist seg lovende i prekliniske undersøkelser, begge isotoper har fysiske halveringstider som er for kort til å være effektive for avbilding hos mennesker. 124 I, i motsetning til dette har en nesten ideell fysisk halveringstid etter avbildning med antistoffer, men det er dyrt og har suboptimale falltidskarakteristikk som fører til forholdsvis lav oppløsning kliniske bilder. Videre kan 124 I-merket radioimmunoconjugates være gjenstand for dehalogenering in vivo, en prosess som kan redusere tumor-til-bakgrunnsaktivitetsforhold. 6,7

Stasjonen for å finne et positron-emitting radioisotop å erstatte 64 Cu, 86 Y, og 124 jeg i radioimmunoconjugates har drevet siste økningen i forskning på 89 ZR-merkede antistoffer. 8-12 THan årsak til ankomsten av 89 Zr er enkel: radiometall besitter nesten ideelle kjemiske og fysikalske egenskaper for anvendelse i diagnostiske PET radioimmunoconjugates 13 89 Zr blir dannet via 89 Y (p, n) 89 Zr reaksjon på en syklotron ved hjelp av en. kommersielt tilgjengelige og 100% naturlig rikelig 89 Y målet. 14,15 Den radiometall har et positron utbytte på 23%, avtar med en halveringstid på 78,4 timer, og slipper ut positroner med forholdsvis lav energi på 395,5 keV (figur 1). 13,16,17 Det er viktig å merke seg at 89 Zr avgir også en høy energi 909 keV γ-stråle med 99% effektivitet. Mens dette utslippet ikke forstyrrer energimessig med de slippes ut 511 keV fotoner, krever det ekstra hensyn med hensyn til transport, håndtering, og dosimetri. Til tross for dette forbeholdet, disse falltidskarakteristikk til slutt føre til at 89 Zr har ikke bare en mer gunstig hAlf-liv for avbildning med antistoffer enn 86 y og 64 Cu, men kan også frembringe bilder med høyere oppløsning enn 124 I, som sender ut positroner med høyere energier av 687 og 975 keV, samt et antall fotoner med energier innenfor 100 til 150 keV i på 511 keV positron-laget fotoner. 13 Dessuten er 89 Zr også sikrere å håndtere og mindre kostbart å produsere, og residualizes i tumorer mer effektivt enn dens motstykke radiojod. 18,19 En mulig begrensning av 89 Zr er at det ikke trenger et terapeutisk isotopologue, f.eks, 86 Y (PET) vs. 90 Y (terapi). Dette utelukker bygging av kjemisk identiske, surrogatkontrastmidler som kan brukes som dosimetriske speidere for sine terapeutiske kolleger. Når det er sagt, undersøkelser tyder på at 89 ZR-merkede antistoffer har potensial som bildebehandlings surrogater for 90 Y- og 177 Lu-merket immunkonjugater.20,21

Fra et kjemisk standpunkt, som et gruppe IV-metall, 89 Zr eksisterer som en 4-kation i vandig oppløsning. Zr 4+ ion er sterkt belastet, relativt stor (effektiv ionisk radius = 0.84 Å), og kan klassifiseres som en "hard" kation. Som eksempel, oppviser det en preferanse for ligander som bærer opp til åtte harde, anioniske oksygengivere. Lett den vanligste chelator brukt i 89 Zr-merket radioimmunoconjugates er desferrioksamin (DFO), en siderofor-avledet, asyklisk chelator peiling tre hydroksamat grupper. Liganden stabilt koordinerer Zr 4+ kation raskt og rent ved RT i biologisk relevante pH-nivåer, og den resulterende Zr-DFO kompleks forblir stabil i løpet av flere dager i saltvann, blodserum, og fullblod. 22 Beregnings studiene tyder DFO som danner et kompleks med hexacoordinate Zr 4+ hvor metallet senter er koordinert til tre neutral og tre anioniske oksygen giverne av liganden samt to eksogene vann ligander (Figur 2). 23,24 In vivo oppførsel av radioimmunoconjugates ansette den 89 Zr-DFO konjugering stillaset har generelt vært utmerket. Men i noen tilfeller har bildebehandling og akutte biofordelingsstudier avslørt forhøyede aktivitetsnivå i beina i mus injisert med 89 ZR-merkede antistoffer, data som tyder på at osteophilic 89 4+ kasjon Zr frigjøres fra chelatoren in vivo og senere mineralizes i beinet. 25 Nylig, spesielt ligander en rekke undersøkelser i utviklingen av romanen 89 Zr 4+ chelatorene med åtte oksygen givere har dukket opp i litteraturen. 24,26,27 Likevel, i dag, DFO er den mest utbredte ansatt kelator i 89 Zr-merket radioimmunoconjugates med god margin. En rekke forskjelligebioconjugation strategier har blitt anvendt for å feste DFO til antistoffer, inkludert bioorthogonal klikk kjemi, omsetning av tiol-reaktive DFO konstruksjoner med cysteiner i antistoffet, og omsetning av aktivert ester bærende DFO konstruksjoner med lysiner i antistoffet. 4,28- 30 Det mest vanlige strategien har imidlertid vært bruken av et isotiocyanat bærende derivat av DFO, DFO-NCS (figur 2). 22 Det kommersielt tilgjengelige bifunksjonell chelator robust og pålitelig danner stabile, kovalente bindinger med thiourea lysinene i antistoff (figur 3).

I løpet av de siste årene, har et bredt utvalg av 89 Zr-DFO-merket radioimmunoconjugates blitt rapportert i litteraturen. Prekliniske undersøkelser har vært spesielt rikt, med antistoffer som strekker seg fra den mer kjente cetuximab, bevacizumab, og trastuzumab til mer esoteriske antistoffer som CD105-targeting TRC105 og fPSA målretting 5A10. 30-36 Mer nylig har et lite antall av tidlig-fase kliniske forsøk med 89 Zr-DFO-merkede antistoffer dukket opp i litteraturen. Spesielt har grupper i Nederland publiserte studier som syssels 89 Zr-DFO-cmAb U36, 89 Zr-DFO-ibritumomabtiuksetan, og 89 Zr-DFO-trastuzumab. 21,32,37 I tillegg er en rekke andre kliniske studier med 89 ZR-merkede radioimmunoconjugates er for tiden i gang, inkludert undersøkelser her på Memorial Sloan Kettering Cancer Center ved hjelp av PSMA målretting 89 Zr-DFO-J591 for prostatakreft bildebehandling og HER2-targeting 89 Zr-DFO-trastuzumab for brystkreft imaging. 23, 30 I tillegg, mens radiomerkede antistoffer forbli de vanligste 89 Zr-merket radiofarmaka, radiometall har også i økende grad blitt benyttet med andre vektorer, inkludert peptider, proteiner og nanomaterialer. 38-43

Den modularitet av dette 89 Zr-DFO merking metodikk er en enorm ressurs. Repertoaret av biomarkør-targeting antistoffer er stadig voksende, og interessen i å utføre in vivo PET avbildning ved hjelp av disse konstruksjonene vokser i raskt tempo. Som et resultat, tror vi at utviklingen av mer standardiserte rutiner og protokoller kan være til nytte feltet. En utmerket skrevet eksperimentell protokoll for DFO-NCS konjugering og 89 Zr radiomerking har allerede blitt publisert av Vosjan, et al. 22 Vi føler at visuell demonstrasjon levert av dette arbeidet ytterligere kan hjelpe etterforskerne nye til disse teknikkene. I protokollen for hånden, vil prostata-spesifikt membran antigen antistoff rettet J591 brukes som et modellsystem for å illustrere (1) bioconjugation av det bifunksjonelle chelateringsmiddel DFO-isotiocyanat til et antistoff, (2) den radiosynthesis og rensing av det 89 Zr-DFO-mAb'et radioimmunkonjugat,og (3) in vivo PET avbildning med en 89 Zr-DFO-mAb radioimmunkonjugat i en murin modell av kreft. 23,44,45

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle de in vivo dyreforsøk beskrevet ble utført i henhold til godkjent protokoll og under de etiske retningslinjene for Memorial Sloan Kettering Cancer Center Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC).

1. Bøyning av DFO-NCS til J591

  1. I et 1,7 ml mikrosentrifugerør, forberede en 2-5 mg / ml oppløsning av J591 i 1 ml av enten 1 x fosfatbufret saltløsning (pH 7,4) eller 0,5 M HEPES-buffer (pH 7,4).
  2. Oppløse DFO-NCS i tørr DMSO i en konsentrasjon mellom 5-10 mm (3.8 til 7.6 mg / ml). Sonikere eller vortex løsningen grundig for å lette fullstendig oppløsning.
  3. Juster pH til oppløsningen til J591 8,8 til 9,0 ved tilsetning av små porsjoner (<10 pl) 0,1 M Na 2 CO 3.
  4. Når antistoffløsningen er i riktig pH, tilsett et volum av DFO NCS-løsning tilsvarende en 3-4 gangers molart overskudd av den bifunksjonelle chelator.
    1. For eksamenpel legge 4-5 ul av en 10 mM (7,6 mg / ml) DFO-NCS-løsning (40.4 nmol DFO-NCS) til 1 ml av en 2 mg / ml J591 antistoffløsning (13,3 nmol J591). Mengden av DMSO i den endelige vandige reaksjonsblanding bør ikke overstige 2% v / v.
  5. Inkuber reaksjonen i 30 minutter ved 37 ° C på en varmeblokk agitert ved 350 rpm.
  6. Etter 1 time ved 37 ° C, rense den resulterende immunkonjugat ved anvendelse av en pre-pakket disponibel størrelseseksklusjonsavsaltingskolonne med en 50000 molekylvekt cut-off ved anvendelse av 0,5 M HEPES-buffer (pH 7,4) som elueringsmiddel. Dette trinnet vil gi en 2 ml oppløsning av den ferdige J591-DFO konstruere.
  7. Måle konsentrasjonen av J591-DFO konstruere på et UV-Vis spektrofotometer.
  8. Hvis en høyere konsentrasjon av konstruksjonen er ønsket, konsentrere J591-DFO løsning ved hjelp av en sentrifugal-filterenhet med en 50000 molekylvekt cut-off.
  9. Oppbevar løsningen av den ferdige J591-DFO immunkonjugatet ved -20 ° C i mørket.

2. Radiomerking J591-DFO med 89 Zr

ADVARSEL: Dette trinnet av protokollen involverer håndtering og manipulering av radioaktivitet. Før du utfører disse trinnene eller utføre annet arbeid med radioaktivitet forskere bør rådføre seg med sin hjemmeinstitusjonens Radiation Safety Department. Alle mulige skritt bør tas for å minimere eksponering for ioniserende stråling.

MERK: I interesse av riktig radiokjemisk note-holder, bør mengden av radioaktivitet i prøven måles ved hjelp av en dose kalibrator og registrert før og etter Steps 02.02 til 02.13 i protokollen under. Dette vil hjelpe til med nøyaktig bestemmelse av radiokjemiske avkastning og konkrete aktiviteter.

  1. Forbered en løsning av 0,5-2,0 mg J591-DFO i 200 mL 0,5 M HEPES buffer, pH 7,5.
  2. Pipette et volum av <sup> 89 Zr 4+ stamløsning (typisk levert i 1,0 M oksalsyre), tilsvarende 1,0 til 6,0 mCi (37-222 MBq) inn i en 2 ml plastskrukork mikrosentrifugerør. Justere volumet av denne løsningen til totalt 300 mL bruker 1,0 M oksalsyre.
  3. Juster pH-verdien til 89 Zr 4+ løsning på 6,8-7,5 ved hjelp av 1,0 M Na 2 CO 3. Begynner ved tilsetning av 250 ul 1,0 M Na 2 CO 3 til 89 Zr 4+ løsning og deretter å tilsette mindre (<10 ul) aliquoter av basen for å oppnå den ønskede pH.
  4. Legg den ønskede mengde av pH-justert 89 Zr 4+ løsning på J591-DFO oppløsning fremstilt i trinn 2.1.
  5. Kontroller pH-verdien for radiomerkingsreaksjonsblandingen for å sikre at det faller innenfor det ønskede område på 6,8 til 7,5.
  6. Inkuber radiomerkingsreaksjon i 60 minutter ved RT på en omrøringsvarmeblokk ved 350 rpm.
  7. Etter 60 min inkubasjon måle radiolabeling utbytte av reaksjonen ved hjelp av radio-TLC.
    1. For dette formål, spot en uCi av det radiomerkingsreaksjonsblandingen på en silika-TLC-impregnerte strimmel. La delmengde tørke, kjøre TLC ved hjelp av en elueringsmiddel av 50 mM DTPA (pH 5,5) og analysere TLC stripe ved hjelp av en radio-TLC scanner. 89 Zr 4+ bundet til J591-DFO konstruere vises i origo (R f <0,1), mens det frie 89 Zr 4+ kationer vil bli chelatert av DTPA, og vil elueres med løsningsmiddelfronten (Rf> 0,9).
    2. Beregn radiomerkingsutbytte av reaksjonen ved å integrere radiochromatogram, dividere arealet under kurven fra Rf 0,0 til 0,1 av det totale areal under kurven, og multiplisere med 100.
  8. Hvis radiomerkingsutbyttet er tilstrekkelig (typisk en teoretisk spesifikk aktivitet på> 2 mCi / mg), stans reaksjonen med 5 pl av 50 mM DTPA, pH 5.5.
  9. Rense den resulterende immunkonjugat USIng en pre-pakket disponibel størrelseseksklusjonsavsaltingskolonne med en 50000 molekylvekt cut-off ved bruk av en eluent av enten 0,9% sterilt saltvann med 5 mg / ml gentisinsyre eller 0,25 M natriumacetat (pH 5,5) med 5 mg / ml gentisinsyre . Dette trinnet vil gi en 2 ml oppløsning av den ferdige 89 Zr-DFO-J591 radioimmunkonjugat.
  10. Etter rensing kontrollere radiokjemiske renhet av 89 Zr-DFO-J591 ved hjelp av radio-TLC som beskrevet i trinn 2.7.
  11. Beregn den totale radiomerkingsutbytte av reaksjonen ved å dividere mengden av aktivitet opprinnelig tilsatt til antistoff oppløsningen av mengden av radioaktivitet isoleres med det rensede 89 Zr-DFO-J591 radioimmunkonjugat.
  12. Beregn den endelige spesifikke aktivitet ved å dividere mengden av aktivitet isoleres med det rensede 89 Zr-DFO-J591 radioimmunkonjugat ved initiell masse med DFO-J591 i radiomerkingsreaksjonen.
  13. Hvis en høyere konsentrasjon er ønsket, konsentrere the 89 Zr-DFO-J591 løsning ved hjelp av en sentrifugal-filterenhet med en 50000 molekylvekt cut-off.
    MERK: gentisinsyre anvendes i det endelige rensetrinn er et radiobeskyttelsesmiddel som anvendes for å minimalisere nedbrytning av antistoffet på grunn av radio 46 Mens lagring av 89 Zr-DFO-J591 radioimmunkonjugat i opp til 48 timer ved 4 ° C. er mulig, er det ikke anbefalt. Dersom radioimmunkonjugat skal lagres, bruke 0,25 M natriumacetat (pH 5,5) med 5 mg / ml gentisinsyre som lagringsbuffer for å minimalisere risikoen for hypokloritt-mediert radiolyse. 47

3. I Vivo PET avbildning med 89 Zr-DFO-J591

ADVARSEL: Som i protokoll Seksjon 2, dette trinnet av protokollen involverer håndtering og manipulering av radioaktivitet. Før du utfører disse trinnene forskere bør rådføre seg med sin hjemmeinstitusjonens Radiation Safety Department. All possible skritt bør tas for å minimere eksponering for ioniserende stråling.

  1. I hann atymiske nakne mus, subkutant implantat 5 x 10 6 LNCaP prostatakreftceller og tillater disse å vokse til en 100 til 150 mm3 xenograft (3-4 uker etter inokulering). 44
  2. Fortynn 89 Zr-DFO-J591 radioimmunkonjugat til en konsentrasjon på 1,0 mCi / ml i 0,9% steril saltoppløsning.
  3. Injisere 200 ul av 89 Zr-DFO-J591-oppløsning (200 uCi; 7,4 MBq). Inn i den laterale halevenen til de xenograft-bærende mus 48
  4. På det ønskede avbildnings tidspunkt (f.eks, 12, 24, 48, 72, 96 eller 120 timer etter injeksjon), bedøve mus med 2% isofluran: oksygengassblanding.
  5. Plasser musen på senga av den lille dyret PET skanner, og opprettholde anestesi under skanning ved hjelp av en 1% isofluran: oksygen gassblanding. Før plassere dyret på skanneren, verifisere anestesi ved bruk av tå-pinch metode og Apply oftalmisk salve til øynene til musen for å hindre uttørking under anestesi. 49
  6. Erverve PET-data for mus via en statisk scan med et minimum på 40 millioner sammenfallende hendelser ved bruk av en energivinduet i 350-700 keV og en tilfeldig tidsvindu på 6 ns. 50
  7. Etter å ha fullført oppkjøpet av bildet, ikke la musen uten tilsyn, og ikke legg den i et bur med andre mus før den har kommet til bevissthet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det første trinnet i denne protokollen konjugering av DFO-NCS til antistoffet er vanligvis ganske robust og pålitelig. Vanligvis kan det rensede, chelator-modifisert immunkonjugatet oppnås i et utbytte> 90%, og ved hjelp av tre molare ekvivalenter av DFO-NCS i den innledende konjugeringsreaksjonen vil gi en grad-av-merking av chelator på omtrent 1,0 til 1,5 DFO / mAb'et. De 89 radiomerkings Zr og rensetrinn av fremgangsmåten er likeledes enkel. Ved de konsentrasjoner som er beskrevet i protokollen ovenfor, radiomerkings utbytter på> 80% og dermed spesifikke aktiviteter av> 2,0 mCi / mg er typisk etter 60 min ved RT. Radio-TLC-kromatogram av den urene radiomerkingsblanding vil sannsynligvis vise noen DTPA-bundet 89 Zr 4+ som elueres ved løsningsmiddelfronten (figur 4A). Imidlertid, etter bråkjøling av reaksjonen med DTPA og rensing av 89 Zr-DFO-mAb konstruere via størrelsesutelukkende kromatografi, den radiochemical renheten av renset, isolert 89 Zr-DFO-mAb-konjugat bør være> 95% (figur 4B). I det tilfelle at den radiokjemiske renheten av det isolerte 89 Zr-DFO-mAb-konjugat er mindre enn 95%, bør renseprosedyren gjentas før utfører en in vitro eller in vivo eksperimenter.

Går videre til de in vivo eksperimenter i protokollen beskrevet ovenfor, atymiske nakne mus som bærer PSMA-uttrykkende, LnCap prostatakreft xenotransplantater ble anvendt for å undersøke in vivo-oppførsel av 89 Zr-DFO-J591. Både akutte biodistribusjon og PET bildebehandling eksperimenter viste at 89 Zr-DFO-J591 avtegner klart prostatakreft xenografter med utmerket bildekontrast og høye tumor-til-bakgrunn aktivitetsforhold (Figur 5). Opptaket av radioimmunkonjugat i tumoren er tydelig så tidlig som 24 timer (20,9% ± 5,6% ID / g), og aktivitetenkonsentrasjon i tumoren øker til et maksimum på 57,5% ± 5,3% ID / g ved 96 timer etter injeksjon. Som er typisk for radioimmunoconjugates, er en relativt høy konsentrasjon av radiomerkings tilstede i blodet ved tidlige tidspunkter (9,1% ± 5,3% ID / g ved 24 timer), etterfulgt av en langsom reduksjon i mengden av radioaktivitet i blodet via løpet av eksperimentet. Den ikke-målvev med den høyeste aktivitetskonsentrasjon var benet, som vist opptaksverdier rundt 10% ID / g i løpet av forsøket, antagelig som et resultat av in vivo frigjøring av osteophilic kation 89 Zr 4+. Alle andre organer, inkludert hjerte, lunge, lever, milt, mage, store og små tarmer, nyrer, muskel og vist forholdsvis lavt aktivitetskonsentrasjon, ofte godt under 5% ID / g. Som en kontroll, ble en ytterligere kohort av mus injisert ko-injisert 300 pg umerket DFO-J591 for å mette antigen og således illustrerer selektiv blokkering. Criti tisk, blokkering eksperiment senket opptak av radioimmunkonjugat i svulsten fra 48,9% ± 9,3% ID / g til 23,5% ± 11.1% ID / g på 72 timer etter injeksjon, som klart viser at 89 Zr-DFO-J591 selektivt rettet sin antigen.

Figur 1
Figur 1. (A) En forenklet forfall ordningen og (B) noen fremtredende forfallet kjennetegn ved 89 Zr 13,16,17 IT = isomere overgang.; EC = elektron-fangst. Modifisert og gjengitt med tillatelse fra Deri, et al. Nukleærmedisin og biologi. 40, 3-14 (2013). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

re to "src =" / files / ftp_upload / 52521 / 52521fig2highres.jpg "width =" 700px "/>
Figur 2. (A) Strukturen til DFO-NCS med de koordinerende oksygenatomer farget rød; (B) En DFT-avledet struktur av Zr-DFO koordinasjonskompleks. Modifisert og gjengitt med tillatelse fra Deri, et al. Journal of Medicinal Chemistry. 57, 4849-4860 (2014). Copyright 2014 American Chemical Society. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3

Figur 3. Scheme av bioconjugation og radiomerking av 89 Zr-DFO-J591.et = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Representative radio TLC kromatogrammer av det urene radiomerkingsblanding (A) og renset produkt (B) fra 89 Zr-DFO-J591. Radio-TLCS ble utført på silika strimler ved hjelp av et elueringsmiddel av 50 mM DTPA, pH 5.0. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5. Koronale PET-bilder av 89 Zr-DFO-J591 (11.01 til 12.09 MBq [300-345 jiCi] injiseres via halevenen i 200 mL 0,9% sterilt saltvann) i atymiske nakne mus med subkutan, PSMA-uttrykkeLNCaP prostatakreft xenografts (hvite piler) mellom 24 og 120 timer etter injeksjon. Modified og gjengitt med tillatelse fra Zeglis, et al. Bioconjugate kjemi. 24, 1057-1067 (2013). Copyright 2013 American Chemical Society. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mens bygging, radiomerking, og avbildning av 89 Zr-DFO-stemplet radioimmunoconjugates er generelt en ganske enkel prosedyre, er det viktig å holde noen viktige hensyn i tankene under hvert trinn i prosessen. For eksempel, kanskje den mest sannsynlige årsak til bekymring i konjugasjon trinn i prosedyren er aggregering av antistoffet under konjugeringsreaksjonen. Dette problemet er oftest et produkt av dårlig blanding av konjugeringsreaksjonen etter tilsetningen av den DFO-NCS stamløsning. 22 Når dette skjer, kan den ikke-homogen fordeling av DFO-NCS forårsake overdrevent høye nivåer av lokal reaksjon med antistoff, som igjen kan føre til aggregering. Dette problemet kan være forholdsvis lett omgås ved å tilsette DFO-NCS stamløsning i små porsjoner (<5 ul), grundig blanding av reaksjonsblandingen etter tilsetning av DFO-NCS, og omrøring av reaksjonsblandingen på en temperature-kontrollerte shaker. I tillegg, etter at konjugering og rensing av det DFO-mAb-konstruksjon, er det viktig å nøyaktig bestemme antall DFO konjugert til hver mAb. Den fullstendige karakterisering av antall DFO chelater per antistoff kan oppnås ved hjelp av radiometriske isotopisk fortynning eksperimenter tilsvarende de som utføres av Holland, et al., Og Anderson, et al., Selv om MALDI-TOF massespektrometri er et levedyktig alternativ. 14,23 , 30,51,52 Under radiomerking skritt, lett den vanligste problemet er lavere enn forventet radiomerkings avkastning. Hvis uventet lave avlinger forekomme til tross iherdig å følge protokollen ovenfor, tre forskjellige feilsøkingsstrategier er tilgjengelige: (1) inkubere radiomerking reaksjon for lengre mengder tid (for eksempel 2-3 timer); (2) å gjenta det radiomerkingsreaksjon ved bruk av en høyere konsentrasjon av antistoff; eller (3) å gjenta den første DFO-NCS konjugeringsreaksjonen ved hjelp av et høyere molart overskudd av the bifunksjonelt chelator.

Mens DFO-NCS konjugering er lettvinte og robust, en av sin unektelig svakheter er at det ikke er stedsspesifikke: DFO-NCS danner thiourea sammenhengene med tilgjengelige lysines i antistoff uavhengig av deres posisjon. Som et resultat, er det mulig at de chelatorer kan bli tilføyd til den antigen-bindende regionen til antistoffet, for derved ugunstig å påvirke immunoreaktiviteten av 89 Zr-DFO merkede konjugat. Derfor må en fin balanse bli truffet i konstruksjonen av 89 Zr-merket radioimmunoconjugates: høyere antall chelatorene per antistoff lette høyere spesifikke aktiviteter, men høyere grad av merking også øke risikoen for at det går immunoreaktiviteten av begrepet. Til slutt, er målet enkelt: feste så mange kelater som nødvendig uten at det går immunoreaktivitets. Etter oppnåelse av det rensede 89 Zr-DFO-mAb radioimmunkonjugat, er det avgjørende å bestemme in vivo eksperimentering. For dette formål anbefales det å bruke in vitro-metoder som er publisert av Lindmo et al. 53,54 Hvis immunoreaktiviteten av konstruksjonen blir lavere enn 80-90%, kan det være nødvendig å gå tilbake til konjugeringsreaksjonen og føyer færre DFO grupper per antistoff. Alternativt, hvis immunoreaktiviteten av det rensede 89 Zr-DFO-mAb er høy (> 90%) og høyere spesifikk aktivitet er ønsket, kan det være mulig å feste flere chelatorer til antistoffet uten å redusere immunoreaktivitet.

Til slutt, den in vivo oppførselen til en 89 Zr-DFO-merket antistoff er selvfølgelig svært avhengig av både identiteten til antistoffet og tumormodell som anvendes. I modellsystemet er presentert her, når den maksimale opptak i tumoren omtrent 60% ID / g; rapporterer imidlertid i litteraturen for maksimal tumoropptak values ​​varierer fra så lavt som 15 til 20% ID / g til så høyt som 80 til 90% ID / g 33,44,55-57 Likeledes kan mengden av opptak i ikke-målvev -. spesielt leveren og milten - kan variere mye avhengig av antistoff / antigen-systemet som studeres. Den spesifikke aktivitet av det 89 Zr-DFO-merkede antistoffet er en viktig faktor for in vivo eksperimenter. Litteraturverdier for de spesifikke aktivitetene til 89 Zr-DFO-mAb typisk i området 1-6 mCi / mg (37-222 mBq / mg). 8,10 Vanligvis, høyere spesifikke aktiviteter er å foretrekke, da de redusere sannsynligheten for utilsiktet metning av antigenet (dvs. selvblokkering). Dette blir spesielt viktig i systemer med lavere nivåer antigen uttrykk. Uavhengig av antistoff / antigen-systemet, er ingen in vivo-undersøkelse av en 89 Zr-DFO-merkede avbildningsmiddel fullstendig uten en demonstrasjon av selektivitet. Dette kan oppnås via blokkering av eksperimenter ved hjelpstore mengder av umerket biomolekyl eller bruk av en cellelinje som ikke uttrykker antigenet som det gjelder. I fremgangsmåten som her er beskrevet, ble det tidligere anvendt, men selektiviteten av 89 Zr-DFO-J591 har også blitt demonstrert ved hjelp av PSMA-negative PC3 prostatakreft xenografter. 23

Det er viktig å merke seg at til tross for sine klare fordeler, er ikke perfekt denne DFO-NCS-basert syntetisk metodikk. Som vi har diskutert, er DFO ikke en ideell chelator for 89 Zr 4+, og den ikke-stedsspesifikke natur konjugeringsreaksjonen kan bevise tungvint. For å omgå disse problemene, til spennende innsats utvikle nye kelater for 89 Zr 4+ og stedsspesifikke radiomerkings metoder er for tiden i gang, men disse nye teknologiene fortsatt trenger å være optimalisert og validert i både laboratoriet og klinikken. 24,26,27, 29,44 syvende og sist, DFO-NCS metodikk for bygging av89 Zr-DFO-merkede antistoffer har vist seg å være et svært effektivt verktøy for syntese av radioimmunoconjugates, og har potensiale til å bli brukt til å lage en rekke klinisk nyttige radiofarmasøytika.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne takker professor Thomas Reiner, Dr. Jacob Houghton, og Dr. Serge Lyaschenko for nyttige samtaler.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
p-SCN-Bn-DFO Macrocyclics B-705 Store at -80 °C
[89Zr]Zr-oxalate Various, including Perkin-Elmer Caution: Radioactive material
PD-10 Desalting Columns GE Healthcare 17-0851-01  Store at room temperature
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units EMD Millipore UFC805024 Store at room temperature
Silica Gel Impregnated RadioTLC Paper Agilent Technologies SGI0001 Cut into strips 0.5 cm wide

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wu, A. M. Antibodies and antimatter: The resurgence of immuno-PET. Journal of Nuclear Medicine. 50 (1), 2-5 (2009).
  2. Wu, A. M., Olafsen, T. Antibodies for molecular imaging of cancer. Cancer Journal. 14 (3), 191-197 (2008).
  3. Wu, A. M., Senter, P. D. Arming antibodies: prospects and challenges for immunoconjugates. Nature Biotechnology. 23 (9), 1137-1146 (2005).
  4. Zeglis, B. M., Lewis, J. S. A practical guide to the construction of radiometallated bioconjugates for positron emission tomography. Dalton Transactions. 40 (23), 6168-6195 (2011).
  5. Zalutsky, M. R., Lewis, J. S. Handbook of Radiopharmaceuticals. Welc, M. J., Redvanly, C. S. 24, Wiley. New York, NY. 685-714 (2003).
  6. Carrasquillo, J. A., et al. 124I-huA33 antibody PET of colorectal cancer. Journal of Nuclear Medicine. 52 (8), 1173-1180 (2011).
  7. Divgi, C. R., et al. Preoperative characterisation of clear-cell renal carcinoma using iodine-124-labelled antibody chimeric G250 (124I-cG250) and PET in patients with renal masses: a phase I trial. The Lancet Oncology. 8 (4), 304-310 (2007).
  8. Severin, G. W., Engle, J. W., Barnhart, T. E., Nickles, R. J. Zr-89 radiochemistry for positron emission tomography. Medicinal Chemistry. 7 (5), 389-394 (2012).
  9. Nayak, T. K., Brechbiel, M. W. Radioimmunoimaging with longer-lived positron-emitting radionuclides: potentials and challenges. Bioconjugate Chemistry. 20 (5), 825-841 (2009).
  10. Vugts, D. J., Van Dongen, G. 89Zr-labeled compounds for PET imaging guided personalized therapy. Drug Discovery Today. 8 (2), e53-e61 (2011).
  11. Dongen, G. A. M. S., Visser, G. W. M., de Hooge, M. N. L. ub-, de Vries, E. G., Perk, L. R. Immuno-PET: a navigator in monoclonal antibody development and applications. Oncologist. 12 (12), 1379-1389 (2007).
  12. Deri, M. A., Zeglis, B. M., Francesconi, L. C., Lewis, J. S. PET imaging with 89Zr: From radiochemistry to the clinic. Nuclear Medicine and Biology. 40 (1), 3-14 (2013).
  13. Holland, J. P., Williamson, M. J., Lewis, J. S. Unconventional nuclides for radiopharmaceuticals. Molecular Imaging. 9 (1), 1-20 (2010).
  14. Holland, J. P., Sheh, Y. C., Lewis, J. S. Standardized methods for the production of high specific-activity zirconium-89. Nuclear Medicine and Biology. 36 (7), 729-739 (2009).
  15. Meijs, W. E., et al. Production of highly pure no-carrier added 89Zr for the labelling of antibodies with a positron emitter. Applied Radiation and Isotopes. 45 (12), 1143-1147 (1994).
  16. Vugts, D. J., van Dongen, G. A. M. S. 89Zr-labeled compounds for PET imaging guided personalized therapy. Drug Discovery Today: Technologies. 8 (2-4), e53-e61 (2011).
  17. Severin, G. W., Engle, J. W., Barnhart, T. E., Nickles, R. J. 89Zr radiochemistry for positron emission tomography. Medicinal Chemistry. 11 (7), 389-394 (2011).
  18. Perk, L. R., et al. Quantitative PET imaging of Met-expressing human cancer xenografts with 89Zr-labelled monoclonal antibody DN30. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 35 (10), 1857-1867 (2008).
  19. Knowles, S. M., et al. Quantitative immunoPET of prostate cancer xenografts with Zr-89- and I-124-labeled anti-PSCA A11 minibody. Journal of Nuclear Medicine. 55 (3), 452-459 (2014).
  20. Rizvi, S. F., et al. radiation dosimetry and scouting of 90Y-ibritumomab tiuxetan therapy in patients with relapsed B-cell non-Hodgkin's lymphoma using 89Zr-ibritumomab tiuxetan and PET. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 39 (3), 512-520 (2012).
  21. Perk, L. R., et al. Preparation and evaluation of Zr-89-Zevalin for monitoring of Y-90-Zevalin biodistribution with positron emission tomography. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 33 (11), 1337-1345 (2006).
  22. Vosjan, M., et al. Conjugation and radiolabeling of monoclonal antibodies with zirconium-89 for PET imaging using the bifunctional chelate p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine. Nature Protocols. 5 (4), 739-743 (2010).
  23. Holland, J. P., et al. Zr-89-DFO-J591 for ImmunoPET of prostate-specific membrane antigen expression in vivo. Journal of Nuclear Medicine. 51 (8), 1293-1300 (2010).
  24. Deri, M. A., et al. Alternative chelator for (89)Zr-radiopharmaceuticals: Radiolabeling and evaluation of 3,4,3-(LI-1,2-HOPO). Journal of Medicinal Chemistry. 57 (11), 4849-4860 (2014).
  25. Abou, D. S., Ku, T., Smith-Jones, P. M. In vivo biodistribution and accumulation of 89Zr in mice. Nuclear Medicine and Biology. 38 (5), 675-681 (2011).
  26. Guerard, F., Lee, Y. S., Brechbiel, M. W. Rational design, synthesis, and evaluation of tetrahydroxaminc acid chelators for stable complexation of zirconium(IV). Chemistry: A European Journal. 20 (19), 5584-5591 (2014).
  27. Guerard, F., et al. Investigation of Zr(IV) and 89Zr(IV) complexation with hydroxamates: progress towards designing a better chelator than desferrioxamine B for immuno-PET imaging. Chemical Communications. 49 (10), 1002-1004 (2013).
  28. Zeglis, B. M., et al. Modular strategy for the construction of radiometalated antibodies for positron emission tomography based on inverse electron demand Diels-Alder click chemistry. Bioconjugate Chemistry. 22 (10), 2048-2059 (2011).
  29. Tinianow, J. N., et al. Site-specifically Zr-89-labeled monoclonal antibodies for ImmunoPET. Nuclear Medicine and Biology. 37 (3), 289-297 (2010).
  30. Holland, J. P., et al. Measuring the pharmacodynamic effects of a novel Hsp90 inhibitor on HER2/neu expression in mice using Zr-89-DFO-trastuzumab. PLoS ONE. 5 (1), (2010).
  31. Aerts, H., et al. Disparity between in vivo EGFR expression and Zr-89-labeled cetuximab uptake assessed with PET. Journal of Nuclear Medicine. 50 (1), 123-131 (2009).
  32. Nagengast, W. B., et al. Zr-89-Bevacizumab PET of early antiangiogenic tumor response to treatment with HSP90 inhibitor NVP-AUY922. Journal of Nuclear Medicine. 51 (5), 761-767 (2010).
  33. Nagengast, W. B., et al. In vivo VEGF imaging with radiolabeled bevacizumab in a human ovarian tumor xenograft. Journal of Nuclear Medicine. 48 (8), 1313-1319 (2007).
  34. Dijkers, E. C. F., et al. Development and characterization of clinical-grade Zr-89-trastuzumab for HER2/neu immunoPET imaging. Journal of Nuclear Medicine. 50 (6), 974-981 (2009).
  35. Ulmert, D., et al. Imaging androgen receptor signaling with a radiotracer targeting free prostate-specific antigen. Cancer Discovery. 2 (4), 320-327 (2012).
  36. Hong, H., et al. Positron emission tomography imaging of CD105 expression with 89Zr-Df-TRC105. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 39 (1), 138-148 (2012).
  37. Dijkers, E. C., et al. Biodistribution of Zr-89-trastuzumab and PET omaging of HER2-positive lesions in patients with metastatic breast cancer. Clinical Pharmacolog., & Therapeutics. 87 (5), 586-592 (2012).
  38. Heneweer, C., Holland, J. P., Divilov, V., Carlin, S., Lewis, J. S. Magnitude of enhanced permeability and retention effect in tumors with different phenotypes: Zr-89-abumin as a model system. Journal of Nuclear Medicine. 52 (4), 625-633 (2011).
  39. Holland, J. P., et al. Annotating MYC status with 89Zr-transferrin imaging. Nature Medicine. 18 (10), 1586-1591 (2012).
  40. Jacobson, O., et al. MicroPET imaging of integrin avB3 expressing tumors using 89Zr-RGD peptides. Molecular Imaging and Biology. 13 (6), 1224-1233 (2011).
  41. Keliher, E. J., et al. 89Zr-labeled dextran nanoparticles allow in vivo macrophage imaging. Bioconjugate Chemistry. 22 (12), 2383-2389 (2011).
  42. Abou, D. S., et al. 89Zr-labeled paramagnetic octreotide-liposomes for PET-MR imaging of cancer. Pharmaceutical Research. 30 (3), 878-888 (2013).
  43. Miller, L., et al. Synthesis, characterization, and biodistribution of multiple 89Zr-labeled pore-expanded mesoporous silica nanoparticles for PET. Nanoscale. 6 (9), 4928-4935 (2014).
  44. Zeglis, B. M., et al. An enzyme-mediated methodology for the site-specific radiolabeling of antibodies based on catalyst-free click chemistry. Bioconjugate Chemistry. 24 (6), 1057-1067 (2013).
  45. Nanus, D. M., et al. Clinical use of monoclonal antibody HuJ591 therapy: targeting prostate specific membrane antigen. Journal of Urology. 170 (6 Pt 2), S84-S88 (2003).
  46. Joshi, R., Gangabhagirathi, R., Venu, S., Adhikari, S., Mukherjee, T. Antioxidant activity and free radical scavenging reactions of gentisic acid: in vitro and pulse radiolysis studies. Free Radical Research. 46 (1), 11-20 (2012).
  47. Saran, M., Bors, W. Radiation chemistry of physiological saline reinvestigated: evidence that chloride-derived intermediates play a key role in cytotoxicity. Radiation Research. 147 (1), 70-77 (1997).
  48. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Prichett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), e2771 (2012).
  49. Collier, H., Warner, B. T., Skerry, R. Multiple toe-pinch method for testing analgesic drugs. British Journal of Pharmacology and Chemotherapeutics. 17, 28-40 (1961).
  50. Zanzonico, P. Positron emission tomography: a review of basic principles, scanner design and performance, and current systems. Seminars in Nuclear Medicine. 34 (2), 87-111 (2004).
  51. Anderson, C. J., et al. Copper-64-labeled antibodies for PET imaging. Journal of Nuclear Medicine. 33 (9), 1685-1691 (1992).
  52. Anderson, C. J., et al. Preparation, biodistribution and dosimetry of copper-64-labeled anti-colorectal carcinoma monoclonal antibody fragments 1A3-F(ab')2. Journal of Nuclear Medicine. 36 (5), 850-858 (1995).
  53. Lindmo, T., Boven, E., Cuttitta, F., Fedorko, J., Bunn, P. A. Determination of the immunoreactive fraction of radiolabeled monoclonal antibodies by linear extrapolation to binding at infinite antigen excess. Journal of Immunological Methods. 72 (1), 77-89 (1984).
  54. Lindmo, T., Bunn, P. A. Determination of the true immunoreactive fraction of monoclonal antibodies after radiolabeling. Methods in Enzymology. 121 (1), 678-691 (1986).
  55. Cohen, R., et al. Inert coupling of IRDye800CW to monoclonal antibodies for clinical optical imaging of tumor targets. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 1 (1), 31-43 (2011).
  56. Ruggiero, A., et al. Targeting the Internal Epitope of Prostate-Specific Membrane Antigen with Zr-89-7E11 Immuno-PET. Journal of Nuclear Medicine. 52 (10), 1608-1615 (2011).
  57. Nayak, T. K., Garmestani, K., Milenic, D. E., Brechbiel, M. W. PET and MRI of Metastatic Peritoneal and Pulmonary Colorectal Cancer in Mice with Human Epidermal Growth Factor Receptor 1-Targeted Zr-89-Labeled Panitumumab. Journal of Nuclear Medicine. 53 (1), 113-120 (2012).

Tags

Kjemi Positron Emission Tomography antistoff Bioconjugation Immunokonjugater Desferrioksamin,
Den Bioconjugation og radiosynthesis av<sup&gt; 89</sup&gt; Zr-DFO-merkede antistoffer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zeglis, B. M., Lewis, J. S. The… More

Zeglis, B. M., Lewis, J. S. The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies. J. Vis. Exp. (96), e52521, doi:10.3791/52521 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter