Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Den biokonjugering och radiosynthesis av Published: February 12, 2015 doi: 10.3791/52521
Automatic Translation
1, 1
1Department of Radiology, Memorial Sloan Kettering Cancer Center

Abstract

Den exceptionella affinitet, specificitet och selektivitet av antikroppar gör dem utomordentligt attraktiva vektorer för tumörinriktade PET radioaktiva läkemedel. På grund av deras flera dagar biologisk halveringstid, måste antikroppar märkas med positron-emitterande radionuklider med relativt långa fysiska sönderfallshalveringstider. Traditionellt positron-emitterande isotoper 124 I (t 1/2 = 4,18 d), 86 Y (t 1/2 = 14,7 tim), och 64 Cu (t 2/1 = 12,7 tim) har använts för att märka antikroppar för PET-avbildning. På senare tid har dock fältet bevittnat en dramatisk ökning av användningen av positron-emitterande radiometall 89 Zr i antikroppsbaserade PET imaging agenter. 89 Zr är en nästan perfekt radioisotop för PET avbildning med immunkonjugat, eftersom den har en fysisk halvan -Livet (t 2/1 = 78,4 tim) som är kompatibel med de in vivo farmakokinetiken för antikroppar och avger en relativt låg -enRGY positron som producerar högupplösta bilder. Vidare kan antikroppar rakt märkta med 89 Zr använder siderofor-härledda kelator desferrioxamin (DFO). I detta protokoll kommer prostataspecifikt membranantigen inriktning antikropps J591 användas som ett modellsystem för att illustrera (1) i biokonjugering av bifunktionella kelator DFO-isotiocyanat till en antikropp, (2) den radiosynthesis och rening av en 89 Zr- DFO-mAb radioimmunoconjugate, och (3) in vivo PET avbildning med en 89 Zr-DFO-mAb radioimmunoconjugate i en musmodell av cancer.

Introduction

På grund av deras anmärkningsvärda känslighet, affiniteten och selektiviteten har antikroppar länge ansetts lovande vektorer för leverans av radioisotoper till cancerceller. Dock har deras tillämpning i positronemissionstomografi (PET) avbildning hämmats av bristen på en lämplig positron-emitterande radioisotop för sin märkning. 1-3 En av de mest kritiska överväganden vid utformningen av radioimmunoconjugates är att matcha den fysiska förfall halv- liv av radioisotopen till de vivo farmakokinetiken av antikroppen i. Mer specifikt antikroppar har ofta relativt långa, flerdagars biologiska halveringstider och därför måste märkas med radioisotoper med jämförbara fysiska halveringstider. För PET bildprogram, har antikroppar traditionellt varit radioaktivt med 64 Cu (t 1/2 = 12,7 tim), 86 Y (t 1/2 = 14,7 tim), eller 124 I (t 1/2 = 4,18 d). 4, 5 Men var och en avDessa radioisotoper besitter betydande begränsningar som hämmar deras lämplighet för klinisk avbildning. Medan radioimmunoconjugates märkta med 86 Y och 64 Cu har visat lovande prekliniska undersökningar, båda isotoper besitter fysiska halveringstider som är för kort för att vara effektiv för avbildning i människor. 124 Jag, däremot, har en nästan perfekt fysikalisk halveringstid för avbildning med antikroppar, men det är dyrt och har suboptimala sönderfallsegenskaper som leder till relativt låg upplösning kliniska bilder. Vidare kan 124 I-märkt radioimmunoconjugates vara föremål för dehalogenering in vivo, en process som kan sänka tumör-till-bakgrundsaktivitetsförhållanden. 6,7

Satsningen på att hitta en positron-emitterande radioisotop att ersätta 64 Cu, 86 Y och 124 jag i radioimmunoconjugates har underblåst den senaste tidens uppsving i forskningen på 89 Zr-märkta antikroppar. 8-12 THan skäl för tillkomsten av 89 Zr är enkel: den radiometall besitter nästan perfekt kemiska och fysikaliska egenskaper för användning i diagnostiska PET radioimmunoconjugates 13 89 Zr produceras via 89 Y (p, n) 89 Zr reaktion på en cyklotron med hjälp av en. kommersiellt tillgängliga och 100% naturligt rikligt 89 Y mål. 14,15 Den radiometall har en positron avkastning på 23%, sönderfaller med en halveringstid på 78,4 timmar, och avger positroner med relativt låg energi av 395,5 keV (Figur 1). 13,16,17 Det är viktigt att notera att 89 Zr avger också en hög energi, 909 keV γ-stråle med 99% effektivitet. Även om detta utsläpp inte stör energiskt med de utsända 511 keV fotoner, det kräver extra hänsyn när det gäller transporter, hantering och dosimetri. Trots denna varning, dessa sönderfallsegenskaper innebär i slutändan att 89 Zr har inte bara en mer gynnsam half-liv för avbildning med antikroppar än 86 Y och 64 Cu men kan också ge högre upplösning än 124 I, som avger positroner med högre energier 687 och 975 keV samt ett antal fotoner med energier inom 100-150 keV av de 511 keV positron-skapade fotoner. 13 Dessutom är 89 Zr också säkrare att hantera, billigare att tillverka, och residualizes i tumörer mer effektivt än dess radiojod motsvarighet. 18,19 En potentiell begränsning av 89 Zr är att den inte har en terapeutisk isotopologue, t.ex., 86 Y (PET) vs 90 Y (terapi). Detta utesluter byggandet av kemiskt identiska, surrogat agenter avbildnings som kan användas som dosimetriska scouter för sina terapeutiska motsvarigheter. Som sagt, utredningar tyder på att 89 Zr-märkta antikroppar har potential som avbildnings surrogat för 90 Y- och 177 Lu-märkta immunkonjugat.20,21

Ur kemisk synpunkt, som en grupp IV metall, existerar 89 Zr som +4 görs i vattenlösning. Den Zr 4+ jon mycket laddad, relativt stora (effektiv jonradie = 0,84 Å), och kan klassificeras som en "hård" katjon. Som sådan uppvisar den en preferens för ligander som bär upp till åtta hårda, anjoniska syredonatorer. Lätt den vanligaste kelator användes i 89 Zr-märkta radioimmunoconjugates är desferrioxamin (DFO), en siderofor härledd, acykliska chelator bär tre hydroxamat grupper. Den liganden samordnar stabilt Zr 4+ katjon snabbt och snyggt vid RT på biologiskt relevanta pH-nivåer, och den resulterande Zr-DFO komplex förblir stabil under loppet av flera dagar i saltlösning, blodserum, och helblod. 22 Computational studier tyder starkt att DFO bildar en hexacoordinate komplex med Zr 4+ i vilken metallkärnan är koordinerad till tre Neutral och tre anjoniska syre givare av liganden samt två exogena vattenligander (Figur 2). 23,24 In vivo beteende radioimmunoconjugates utnyttjar 89 Zr-DFO konjugering klätterställning har generellt varit utmärkt. Men i vissa fall har bildbehandling och akuta biodistributionsstudier avslöjade förhöjda aktivitetsnivåer i benen av möss som injicerats med 89 Zr-märkta antikroppar, data som tyder på att osteophilic 89 Zr 4+ katjon frigörs från kelator in vivo och därefter mineralizes i benet. 25 Nyligen speciellt ligander ett antal utredningar i utvecklingen av nya 89 Zr 4+ kelatorer med åtta syredonatorer har dykt upp i litteraturen. 24,26,27 Ändå närvarande DFO är den mest sysselsatta kelator i 89 Zr-märkta radioimmunoconjugates med bred marginal. En mängd olikabiokonjugering strategier har använts för att fästa DFO till antikroppar, inklusive bioorthogonal klick kemi, reaktionen av tiolreaktivt DFO-konstruktioner med cysteiner i antikroppen, och reaktionen av aktiverad ester bärande DFO-konstruktioner med lysiner i antikroppen. 4,28- 30 Lätt den vanligaste strategin har dock varit användningen av ett isotiocyanat bärande derivat av DFO, DFO-NCS (Figur 2). 22 Detta kommersiellt tillgängliga bifunktioneli kelator robust och tillförlitligt bildar stabila, kovalenta tiokarbamid kopplingar till lysinema av antikropp (Figur 3).

Under de senaste åren har ett stort antal 89 Zr-DFO-märkta radioimmunoconjugates rapporterats i litteraturen. Prekliniska undersökningar har varit särskilt riklig, med antikroppar som sträcker sig från de mer välkända cetuximab, bevacizumab, och trastuzumab till mer esoteriska antikroppar såsom CD105-inriktning TRC105 och fPSA-targeting 5A10. 30-36 På senare tid har ett litet antal tidiga fas kliniska prövningar med 89 Zr-DFO-märkta antikroppar uppstått i litteraturen. Specifikt har grupper i Nederländerna publicerade studier som sysselsätter 89 Zr-DFO-cmAb U36, 89 Zr-DFO-ibritumomab tiuxetan, och 89 Zr-DFO-trastuzumab. 21,32,37 Dessutom en rad andra kliniska prövningar med 89 ZR-märkta radioimmunoconjugates pågår, inklusive undersökningar här på Memorial Sloan Kettering Cancer Center med hjälp av PSMA-targeting 89 Zr-DFO-J591 för prostatacancer avbildning och HER2-targeting 89 Zr-DFO-trastuzumab för bröstcancer avbildning. 23, 30 Dessutom medan radiomärkta antikroppar fortfarande de vanligaste 89 Zr-märkta radiofarmaka, den radiometall har också allt varit anställd med andra vektorer, inklusive peptider, proteiner och nanomaterial. 38-43

Modularitet detta 89 Zr-DFO märkningsmetod är en enorm tillgång. Repertoaren av biomarkörer inriktning antikroppar är ständigt expanderande, och intresset för att utföra in vivo PET avbildning med dessa konstruktioner växer i snabb takt. Som ett resultat, tror vi att utvecklingen av mer standardiserade metoder och protokoll kan dra nytta fältet. En utmärkt skriven försöksprotokoll för DFO-NCS konjugering och 89 Zr radiomärkning har redan publicerats av Vosjan, et al. 22 Vi anser att den visuella demonstrationen från detta arbete ytterligare kan hjälpa utredarna nya till dessa tekniker. I protokollet till hands, kommer prostataspecifikt membranantigen inriktning antikropps J591 användas som ett modellsystem för att illustrera (1) i biokonjugering av bifunktionella kelator DFO-isotiocyanat till en antikropp, (2) den radiosynthesis och rening av 89 ZR-DFO-mAb radioimmunoconjugate,och (3) in vivo PET avbildning med en 89 Zr-DFO-mAb radioimmunoconjugate i en musmodell av cancer. 23,44,45

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla de in vivo djurförsök beskrivna utfördes enligt ett godkänt protokoll och under de etiska riktlinjerna i Memorial Sloan Kettering Cancer Center Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC).

1. Konjugering av DFO-NCS till J591

  1. I en 1,7 ml mikrocentrifugrör, förbereda en 2-5 mg / ml lösning av J591 i en ml av antingen 1x fosfatbuffrad saltlösning (pH 7,4) eller 0,5 M HEPES-buffert (pH 7,4).
  2. Lös DFO-NCS i torr DMSO vid en koncentration mellan 5-10 mM (3,8-7,6 mg / ml). Sonikera eller virvel lösningen noggrant för att underlätta fullständig upplösning.
  3. Justera pH i J591 lösningen till 8,8-9,0 genom tillsats av små alikvoter (<10 pl) av 0,1 M Na 2 CO 3.
  4. När antikroppslösningen är på rätt pH, lägga till en volym av DFO-NCS-lösning som motsvarar en 3-4-faldigt molöverskott av bifunktionella kelator.
    1. För examenpel, lägga 4-5 pl av en 10 mM (7,6 mg / ml) DFO-NCS-lösning (40,4 nmol DFO-NCS) till 1 ml av en 2 mg / ml J591 antikroppslösning (13,3 nmol J591). Mängden DMSO i den slutliga vattenhaltiga reaktionsblandningen bör inte överstiga 2% volym / volym.
  5. Inkubera reaktionen under 30 min vid 37 ° C på en omrörande värmeblock vid 350 varv per minut.
  6. Efter 1 h vid 37 ° C, rena den resulterande immunkonjugatet med användning av en i förväg packad engångs storleksuteslutningskromatografi avsaltningskolonn med en 50.000 molekylvikt cut-off med användning 0,5 M HEPES-buffert (pH 7,4) som elueringsmedel. Detta steg kommer att ge en 2 ml lösning av den färdiga J591-DFO konstruktion.
  7. Mät koncentration av J591-DFO konstruera på en UV-Vis spektrofotometer.
  8. Om en högre koncentration av konstruktionen önskas koncentrera den J591-DFO-lösning med användning av en centrifugfilterenhet med en 50.000 molekylvikt cut-off.
  9. Förvara lösningen i det färdig J591-DFO immunkonjugat vid -20 ° C i mörker.

2. Radiomärkning J591-DFO med 89 Zr

VARNING: Detta steg i protokollet innebär hantering och manipulering av radioaktivitet. Innan du utför dessa steg eller gör något annat arbete med radioaktivitet forskare bör rådgöra med sin hemmainstitutets Strålsäkerhetsmyndigheten avdelning. Alla tänkbara åtgärder bör vidtas för att minimera exponeringen för joniserande strålning.

OBS: Med tanke på riktig radiokemisk notering bevarande, bör mängden radioaktivitet i provet mätas med en doskalibrator och registreras före och efter Steg 2,2-2,13 i protokollet nedan. Detta kommer att hjälpa till med noggrann bestämning av radiokemiska avkastning och särskilda aktiviteter.

  1. Bered en lösning av 0,5 till 2,0 mg av J591-DFO i 200 ul av 0,5 M HEPES-buffert, pH 7,5.
  2. Pipettera en volym av <sup> 89 Zr 4+ stamlösning (typiskt levereras i 1,0 M oxalsyra) motsvarande 1,0 till 6,0 mCi (37-222 MBq) i en 2 ml plastskruvlock mikrocentrifugrör. Justera volymen av denna lösning till totalt 300 pl använder 1,0 M oxalsyra.
  3. Justera pH i 89 Zr 4+ lösning på 6,8-7,5 med hjälp 1,0 M Na 2 CO 3. Börja genom tillsats 250 pl av 1,0 M Na 2 CO 3 till 89 Zr 4+ lösning och därefter tillsätta mindre (<10 | il) alikvoter av bas för att uppnå önskat pH.
  4. Lägg den önskade mängden pH-justeras 89 Zr 4+ lösning på J591-DFO-lösning som framställts i steg 2.1.
  5. Kontrollera pH i radiomärkningsreaktionsblandningen så att den faller inom det önskade intervallet 6,8-7,5.
  6. Inkubera radiomärkningsreaktionen för 60 min vid RT på en omrörande värmeblock vid 350 varv per minut.
  7. Efter 60 min av inkubation, mät radiolabeling utbytet av reaktionen med användning av radio TLC.
    1. För detta ändamål, spot 1 pCi av radiomärkningsreaktionsblandningen på en kiseldioxid-impregnerad TLC remsa. Låt alikvot torka, köra TLC använder ett elueringsmedel av 50 mM DTPA (pH 5,5) och analysera TLC band med hjälp av en radio TLC scanner. 89 Zr 4+ bunden till J591-DFO konstruktionen kommer att visas i origo (R f <0,1), medan fria 89 Zr 4+ katjoner ska kelaterad av DTPA och kommer eluera med lösningsmedelsfronten (Rf> 0,9).
    2. Beräkna radiomärknings utbytet av reaktionen genom att integrera radiokromatogram, dividera ytan under kurvan från Rf 0,0-0,1 med den totala arean under kurvan, och multiplicera med 100.
  8. Om radiomärkningsutbytet är tillräckligt (typiskt en teoretisk specifik aktivitet av> 2 mCi / mg), släcka reaktionen med 5 | il av 50 mM DTPA, pH 5,5.
  9. Rena den resulterande immunkonjugatet USIng en förpackad disponibel storleksuteslutningskromatografi avsaltningskolonn med en 50.000 molekylviktsgräns med användning av en eluant av antingen 0,9% steril saltlösning med 5 mg / ml gentisinsyra eller 0,25 M natriumacetat (pH 5,5) med 5 mg / ml gentisinsyra . Detta steg kommer att ge en 2 ml lösning av den färdiga 89 Zr-DFO-J591 radioimmunoconjugate.
  10. Efter rening, kontrollera den radiokemiska renheten av 89 Zr-DFO-J591 använder radio TLC som beskrivs i steg 2.7.
  11. Beräkna det totala radiomärknings utbytet av reaktionen genom att dividera mängden aktivitet som ursprungligen sattes till antikroppslösningen genom mängden radioaktivitet isoleras med det renade 89 Zr-DFO-J591 radioimmunoconjugate.
  12. Beräkna den slutliga specifika aktiviteten genom att dividera mängden aktivitet isolerade med det renade 89 Zr-DFO-J591 radioimmunoconjugate av den ursprungliga massan av DFO-J591 i radiomärkning reaktionen.
  13. Om en högre koncentration önskas, koncentrera the 89 Zr-DFO-J591 lösningen med en centrifugal filterenhet med en 50.000 molekylvikt cut-off.
    OBS: gentisinsyra som användes i det slutliga reningssteget är en radio-Protectant utnyttjas för att minimera nedbrytningen av antikroppen på grund av radiolys 46 Medan lagring av 89 Zr-DFO-J591 radioimmunoconjugate för upp till 48 timmar vid 4 ° C. är möjligt, är det inte rekommenderas. Om radioimmunoconjugate skall lagras, använder 0,25 M natriumacetat (pH 5,5) med 5 mg / ml gentisinsyra som buffertlagret i syfte att minimera risken för hypoklorit-medierad radiolys. 47

3. In Vivo PET Imaging med 89 Zr-DFO-J591

VARNING: Som i protokoll 2 §, detta steg av protokollet innefattar hantering och manipulering av radioaktivitet. Innan du utför dessa steg forskare bör rådgöra med sin hemmainstitutets Strålsäkerhetsmyndigheten avdelning. Alla possible åtgärder bör vidtas för att minimera exponeringen för joniserande strålning.

  1. I manliga atymiska nakna möss, subkutant implantat 5 x 10 6 LNCaP prostatacancerceller och låta dem växa till en 100-150 mm 3 xenograft (3-4 veckor efter ympning). 44
  2. Späd 89 Zr-DFO-J591 radioimmunoconjugate till en koncentration av 1,0 mCi / ml i 0,9% steril saltlösning.
  3. Injicera 200 ìl av 89 Zr-DFO-J591 lösning (200 ^ Ci; 7.4 MBq). I den laterala svansvenen av xenograft bärande möss 48
  4. Vid den önskade avbildningstiden punkt (t.ex., 12, 24, 48, 72, 96, eller 120 h efter injektion), söva musen med en isofluran 2%: syre gasblandning.
  5. Placera musen på sängen av den lilla djuret PET-kamera, och underhålla anestesi under genomsökningen med hjälp av en isofluran 1%: syre gasblandning. Före placera djuret på skanner sängen, kontrollera anestesi använder toe-nypa-metoden och apply oftalmologiska salva till ögonen på musen för att förhindra uttorkning under anestesi. 49
  6. Förvärva data PET för musen via en statisk scan med minst 40 miljoner sammanfallande händelser med en energifönster 350-700 keV och en tillfällighet timing fönster 6 ns. 50
  7. Efter att ha avslutat förvärvet av bilden, inte lämna musen utan tillsyn och inte placera den i en bur med andra möss tills den har återfått medvetandet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det första steget i detta protokoll konjugering av DFO-NCS till antikroppen är typiskt ganska robust och tillförlitlig. Generellt kan det renade, kelator modifierade immunkonjugat erhållas i> 90% utbyte, och med användning av 3 molekvivalenter DFO-NCS i initial konjugeringsreaktionen kommer att ge en grad-av-märkning av kelatorn av ungefär 1,0-1,5 DFO / mAb. De 89 Zr radiomärkning och reningssteg i förfarandet är också enkelt. Vid koncentrationerna anges i protokollet ovan, radiomärkning utbyten av> 80% och därmed specifika aktiviteter> 2,0 mCi / mg är typiska efter 60 min vid RT. Radio-TLC kromatogram av den råa radiomärkningsblandningen kommer sannolikt att avslöja några DTPA bunden 89 Zr 4+ som eluerar vid lösningsmedelsfronten (Figur 4A). Men efter släckning av reaktionen med DTPA och rena den 89 Zr-DFO-mAb konstruera via storleksuteslutningskromatografi, den radiochemical renhet av det renade, isolerade 89 Zr-DFO-mAb konjugat bör vara> 95% (Figur 4B). I händelse av att den radiokemiska renheten hos den isolerade 89 Zr-DFO-mAb konjugat är mindre än 95%, bör förfarandet renings upprepas innan du utför någon in vitro eller in vivo-experiment.

Går vidare till experimenten in vivo, i det protokoll som beskrivs ovan, atymiska nakna möss som bär PSMA-uttrycker, LNCaP prostatacancer xenografter användes för att undersöka in vivo beteende 89 Zr-DFO-J591. Både akut biodistribution och PET imaging experiment visade att 89 Zr-DFO-J591 skisserar klart prostatacancer xenografter med utmärkt bildkontrast och höga tumör-till-bakgrundsaktivitetsförhållanden (Figur 5). Upptaget av den radioimmunoconjugate i tumören är uppenbart så tidigt som 24 tim (20,9% ± 5,6% ID / g), och aktivitetenkoncentration i tumör ökar till ett maximum av 57,5% ± 5,3% ID / g vid 96 h efter injektion. Såsom är typiskt för radioimmunoconjugates, är en relativt hög koncentration av radiospår närvarande i blodet vid tidiga tidpunkter (9,1% ± 5,3% ID / g vid 24 h), följt av en långsam minskning i mängden av radioaktivitet i blodet över experimentets förlopp. Den icke-målvävnad med den högsta aktivitetskoncentrationen var benet, vilket visade upptagsvärden omkring 10% ID / g under hela experimentet, förmodligen som ett resultat av frisättningen av osteophilic katjonen 89 Zr 4+ in vivo. Alla andra organ, inklusive hjärta, lungor, lever, mjälte, mage, stora och tunntarm, njure, och muskler visade relativt låga aktivitetskoncentrationer, ofta långt under 5% ID / g. Som kontroll tillsattes ytterligare kohort av möss som injicerats sam-injicerade 300 ng omärkt DFO-J591 för att mätta antigenet och sålunda illustrerar selektiv blockering. Criti tiskt, sänkte blockeringsexperiment upptag av radioimmunoconjugate i tumören från 48,9% ± 9,3% ID / g till 23,5% ± 11,1% ID / g vid 72 timmar efter injektion, tydligt pekar på att 89 Zr-DFO-J591 riktar selektivt dess antigen.

Figur 1
Figur 1. (A) Ett förenklat förfall system och (B) några framträdande sönderfallsegenskaper 89 Zr 13,16,17 IT = isomer övergång. EG = elektroninfångnings. Ändrad och omtryckt med tillstånd från Deri, et al. Nuclear Medicine and Biology. 40, 3-14 (2013). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

re 2 "src =" / filer / ftp_upload / 52521 / 52521fig2highres.jpg "width =" 700px "/>
Figur 2. (A) Strukturen på DFO-NCS med koordinerande syreatomer färgade rött; (B) En DFT-härledda strukturen hos den Zr-DFO koordinationskomplex. Ändrad och omtryckt med tillstånd från Deri, et al. Journal of Medicinal Chemistry. 57, 4849-4860 (2014). Copyright 2014 American Chemical Society. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3

Figur 3. Schema för biokonjugering och radiomärkning av 89 Zr-DFO-J591.et = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4
Figur 4. Representativa radio TLC kromatogram av den råa radiomärkningsblandningen (A) och renad produkt (B) av 89 Zr-DFO-J591. Radio-TLC kördes på kiseldioxidpartiklar remsor med användning av en eluant av 50 mM DTPA, pH 5,0. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5
Figur 5. Coronal PET bilder av 89 Zr-DFO-J591 (11,1-12,9 MBq [300-345 xCi] injiceras via svansvenen i 200 pl 0,9% steril saltlösning) i atymiska nakna möss med subkutana, PSMA-uttryckLNCaP prostatacancer xenografter (vita pilar) mellan 24 och 120 timmar efter injektion. Modifierad och återges med tillstånd från Zeglis, et al. Bioconjugate Chemistry. 24, 1057-1067 (2013). Copyright 2013 American Chemical Society. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Medan bygg-, radiomärkning, och avbildning av 89 Zr-DFO-labled radioimmunoconjugates är i allmänhet ett ganska enkelt förfarande, är det viktigt att hålla några viktiga överväganden i åtanke under varje steg i processen. Till exempel, kanske den mest sannolika orsaken till oro under konjugering steg i proceduren är sammanläggning av antikroppen under konjugeringsreaktionen. Detta problem är oftast en produkt av dålig blandning av konjugeringsreaktionen efter tillsats av DFO-NCS stamlösning. 22 När detta händer, kan den icke-homogen fördelning av DFO-NCS orsaka alltför höga nivåer av lokal reaktion med antikropp, som i sin tur kan leda till aggregation. Denna fråga kan relativt enkelt kringgås genom att lägga till DFO-NCS stamlösning i små alikvoter (<5 pl), noggrann omblandning av reaktionsblandningen efter tillsatsen av DFO-NCS, och omröring av reaktionsblandningen på en temperature kontrollerad skakare. Dessutom, efter konjugeringen och rening av DFO-mAb-konstruktionen, är det viktigt att exakt bestämma antalet DFO konjugerad till varje mAb. Den fullständiga karakterisering av antalet DFO kelat per antikropp kan uppnås med användning av radiometriska isotoputspädnings experiment liknande de som utförs av Holland et al. Och Anderson, et al., Även om MALDI-TOF masspektrometri är ett genomförbart alternativ. 14,23 , 30,51,52 Under radiomärkningssteget, det vanligaste problemet är lätt lägre än väntat radiomärkning avkastning. Om oväntat låg avkastning uppstår trots flitigt efter protokollet ovan, tre olika felsökningsstrategier finns: (1) inkubering av radiomärkningsreaktionen för längre tidsperioder (t.ex. 2-3 timmar); (2) att upprepa radiomärkningsreaktionen med användning av en högre koncentration av antikroppen; eller (3) att upprepa den inledande DFO-NCS konjugeringsreaktion använder en högre molöverskott av the bifunktioneli kelator.

Medan DFO-NCS konjugering är enkel och robust, en av dess obestridliga svagheter är att det inte är platsspecifik: DFO-NCS bildar tiokarbamid kopplingar med tillgängliga lysiner i antikroppen oavsett position. Som ett resultat, är det möjligt att de kelatorer kan bli fogas till antigenbindande regionen av antikroppen och därigenom negativt påverka immunoreaktiviteten av 89 Zr-DFO-märkt konjugat. Därför måste en fin balans i byggandet av 89 Zr-märkta radioimmunoconjugates: högre antal kelatorer per antikropp underlättar högre specifika aktiviteter, men högre grader av märkning ökar också risken för att äventyra immunreaktivitet av konstruktionen. I slutändan är målet enkelt: bifoga så många kelatbildare som nödvändiga utan att kompromissa immunreaktivitet. Efter att ha fått det renade 89 Zr-DFO-mAb radioimmunoconjugate, är det viktigt att bestämma in vivo-experiment. Därför rekommenderar vi att du använder de in vitro-metoder som publicerats av Lindmo, et al. 53,54 Om immunreaktiviteten av konstruktionen är lägre än 80-90%, kan det vara nödvändigt att återgå till konjugeringsreaktionen och lägga färre DFO-delar per antikropp. Alternativt, om immunoreaktiviteten av det renade 89 Zr-DFO-mAb är hög (> 90%) och högre specifika aktiviteter önskas, kan det vara möjligt att fästa fler chelatorer till antikroppen utan att minska immunreaktivitet.

Slutligen beteendet hos en 89 Zr-DFO märkt antikropp in vivo är naturligtvis mycket beroende på både identiteten av antikroppen och tumörmodell som används. I systemmodell som presenteras här, det maximala upptaget värde i tumören når ca 60% ID / g; Men, rapporterar i litteraturen för maximal tumörupptag values ​​variera från så lågt som 15 till 20% ID / g till så högt som 80 till 90% ID / g 33,44,55-57 Likaså mängden upptag i icke-målvävnader -. i synnerhet levern och mjälten - kan variera mycket beroende på antikropp / antigen-system som studeras. Den specifika aktiviteten hos 89 Zr-DFO märkt antikropp är en viktig faktor för in vivo experiment. Litteraturvärden för specifika verksamheter 89 Zr-DFO-mAbs rad typiskt från 1-6 mCi / mg (37-222 mBq / mg). 8,10 Generellt högre specifika aktiviteter är att föredra, eftersom de minskar sannolikheten för oavsiktlig mättnad av antigen (dvs själv blockering). Detta blir särskilt sant i system med lägre nivåer antigenuttryck. Oberoende av antikropp / antigen-systemet, finns ingen in vivo undersökning av en 89 Zr-DFO-märkta avbildningsmedel komplett utan en demonstration av selektivitet. Detta kan uppnås genom blockeringsexperiment med användning avstora mängder av omärkt biomolekyl eller användning av en cellinje som inte uttrycker antigenet ifråga. I det förfarande som beskrivs häri, har det tidigare användes, men selektiviteten för 89 Zr-DFO-J591 har också demonstrerats med användning av PSMA-negativa PC3 prostatacancer xenografter. 23

Det är viktigt att notera att trots sina klara fördelar, är inte perfekt här DFO-NCS-baserade syntetiska metoden. Som vi har diskuterat, är DFO inte en idealisk kelator för 89 Zr 4+, och den icke-platsspecifik karaktär konjugeringsreaktionen kan bevisa besvärligt. För att kringgå dessa problem, till spännande satsningar utveckla nya kelatorer för 89 Zr 4+ och platsspecifika radiomärkning metoder pågår, men den nya tekniken fortfarande måste optimeras och valideras i både laboratoriet och kliniken. 24,26,27, 29,44 Ytterst DFO-NCS metodik för byggande av89 Zr-DFO-märkta antikroppar har visat sig vara ett mycket kraftfullt verktyg för syntes av radioimmunoconjugates och har potential att användas för att skapa ett brett utbud av kliniskt användbara radioaktiva läkemedel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna.

Acknowledgments

Författarna tackar Prof. Thomas Reiner, Dr Jacob Houghton, och Dr. Serge Lyaschenko för hjälp konversationer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
p-SCN-Bn-DFO Macrocyclics B-705 Store at -80 °C
[89Zr]Zr-oxalate Various, including Perkin-Elmer Caution: Radioactive material
PD-10 Desalting Columns GE Healthcare 17-0851-01  Store at room temperature
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units EMD Millipore UFC805024 Store at room temperature
Silica Gel Impregnated RadioTLC Paper Agilent Technologies SGI0001 Cut into strips 0.5 cm wide

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wu, A. M. Antibodies and antimatter: The resurgence of immuno-PET. Journal of Nuclear Medicine. 50 (1), 2-5 (2009).
  2. Wu, A. M., Olafsen, T. Antibodies for molecular imaging of cancer. Cancer Journal. 14 (3), 191-197 (2008).
  3. Wu, A. M., Senter, P. D. Arming antibodies: prospects and challenges for immunoconjugates. Nature Biotechnology. 23 (9), 1137-1146 (2005).
  4. Zeglis, B. M., Lewis, J. S. A practical guide to the construction of radiometallated bioconjugates for positron emission tomography. Dalton Transactions. 40 (23), 6168-6195 (2011).
  5. Zalutsky, M. R., Lewis, J. S. Handbook of Radiopharmaceuticals. Welc, M. J., Redvanly, C. S. 24, Wiley. New York, NY. 685-714 (2003).
  6. Carrasquillo, J. A., et al. 124I-huA33 antibody PET of colorectal cancer. Journal of Nuclear Medicine. 52 (8), 1173-1180 (2011).
  7. Divgi, C. R., et al. Preoperative characterisation of clear-cell renal carcinoma using iodine-124-labelled antibody chimeric G250 (124I-cG250) and PET in patients with renal masses: a phase I trial. The Lancet Oncology. 8 (4), 304-310 (2007).
  8. Severin, G. W., Engle, J. W., Barnhart, T. E., Nickles, R. J. Zr-89 radiochemistry for positron emission tomography. Medicinal Chemistry. 7 (5), 389-394 (2012).
  9. Nayak, T. K., Brechbiel, M. W. Radioimmunoimaging with longer-lived positron-emitting radionuclides: potentials and challenges. Bioconjugate Chemistry. 20 (5), 825-841 (2009).
  10. Vugts, D. J., Van Dongen, G. 89Zr-labeled compounds for PET imaging guided personalized therapy. Drug Discovery Today. 8 (2), e53-e61 (2011).
  11. Dongen, G. A. M. S., Visser, G. W. M., de Hooge, M. N. L. ub-, de Vries, E. G., Perk, L. R. Immuno-PET: a navigator in monoclonal antibody development and applications. Oncologist. 12 (12), 1379-1389 (2007).
  12. Deri, M. A., Zeglis, B. M., Francesconi, L. C., Lewis, J. S. PET imaging with 89Zr: From radiochemistry to the clinic. Nuclear Medicine and Biology. 40 (1), 3-14 (2013).
  13. Holland, J. P., Williamson, M. J., Lewis, J. S. Unconventional nuclides for radiopharmaceuticals. Molecular Imaging. 9 (1), 1-20 (2010).
  14. Holland, J. P., Sheh, Y. C., Lewis, J. S. Standardized methods for the production of high specific-activity zirconium-89. Nuclear Medicine and Biology. 36 (7), 729-739 (2009).
  15. Meijs, W. E., et al. Production of highly pure no-carrier added 89Zr for the labelling of antibodies with a positron emitter. Applied Radiation and Isotopes. 45 (12), 1143-1147 (1994).
  16. Vugts, D. J., van Dongen, G. A. M. S. 89Zr-labeled compounds for PET imaging guided personalized therapy. Drug Discovery Today: Technologies. 8 (2-4), e53-e61 (2011).
  17. Severin, G. W., Engle, J. W., Barnhart, T. E., Nickles, R. J. 89Zr radiochemistry for positron emission tomography. Medicinal Chemistry. 11 (7), 389-394 (2011).
  18. Perk, L. R., et al. Quantitative PET imaging of Met-expressing human cancer xenografts with 89Zr-labelled monoclonal antibody DN30. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 35 (10), 1857-1867 (2008).
  19. Knowles, S. M., et al. Quantitative immunoPET of prostate cancer xenografts with Zr-89- and I-124-labeled anti-PSCA A11 minibody. Journal of Nuclear Medicine. 55 (3), 452-459 (2014).
  20. Rizvi, S. F., et al. radiation dosimetry and scouting of 90Y-ibritumomab tiuxetan therapy in patients with relapsed B-cell non-Hodgkin's lymphoma using 89Zr-ibritumomab tiuxetan and PET. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 39 (3), 512-520 (2012).
  21. Perk, L. R., et al. Preparation and evaluation of Zr-89-Zevalin for monitoring of Y-90-Zevalin biodistribution with positron emission tomography. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 33 (11), 1337-1345 (2006).
  22. Vosjan, M., et al. Conjugation and radiolabeling of monoclonal antibodies with zirconium-89 for PET imaging using the bifunctional chelate p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine. Nature Protocols. 5 (4), 739-743 (2010).
  23. Holland, J. P., et al. Zr-89-DFO-J591 for ImmunoPET of prostate-specific membrane antigen expression in vivo. Journal of Nuclear Medicine. 51 (8), 1293-1300 (2010).
  24. Deri, M. A., et al. Alternative chelator for (89)Zr-radiopharmaceuticals: Radiolabeling and evaluation of 3,4,3-(LI-1,2-HOPO). Journal of Medicinal Chemistry. 57 (11), 4849-4860 (2014).
  25. Abou, D. S., Ku, T., Smith-Jones, P. M. In vivo biodistribution and accumulation of 89Zr in mice. Nuclear Medicine and Biology. 38 (5), 675-681 (2011).
  26. Guerard, F., Lee, Y. S., Brechbiel, M. W. Rational design, synthesis, and evaluation of tetrahydroxaminc acid chelators for stable complexation of zirconium(IV). Chemistry: A European Journal. 20 (19), 5584-5591 (2014).
  27. Guerard, F., et al. Investigation of Zr(IV) and 89Zr(IV) complexation with hydroxamates: progress towards designing a better chelator than desferrioxamine B for immuno-PET imaging. Chemical Communications. 49 (10), 1002-1004 (2013).
  28. Zeglis, B. M., et al. Modular strategy for the construction of radiometalated antibodies for positron emission tomography based on inverse electron demand Diels-Alder click chemistry. Bioconjugate Chemistry. 22 (10), 2048-2059 (2011).
  29. Tinianow, J. N., et al. Site-specifically Zr-89-labeled monoclonal antibodies for ImmunoPET. Nuclear Medicine and Biology. 37 (3), 289-297 (2010).
  30. Holland, J. P., et al. Measuring the pharmacodynamic effects of a novel Hsp90 inhibitor on HER2/neu expression in mice using Zr-89-DFO-trastuzumab. PLoS ONE. 5 (1), (2010).
  31. Aerts, H., et al. Disparity between in vivo EGFR expression and Zr-89-labeled cetuximab uptake assessed with PET. Journal of Nuclear Medicine. 50 (1), 123-131 (2009).
  32. Nagengast, W. B., et al. Zr-89-Bevacizumab PET of early antiangiogenic tumor response to treatment with HSP90 inhibitor NVP-AUY922. Journal of Nuclear Medicine. 51 (5), 761-767 (2010).
  33. Nagengast, W. B., et al. In vivo VEGF imaging with radiolabeled bevacizumab in a human ovarian tumor xenograft. Journal of Nuclear Medicine. 48 (8), 1313-1319 (2007).
  34. Dijkers, E. C. F., et al. Development and characterization of clinical-grade Zr-89-trastuzumab for HER2/neu immunoPET imaging. Journal of Nuclear Medicine. 50 (6), 974-981 (2009).
  35. Ulmert, D., et al. Imaging androgen receptor signaling with a radiotracer targeting free prostate-specific antigen. Cancer Discovery. 2 (4), 320-327 (2012).
  36. Hong, H., et al. Positron emission tomography imaging of CD105 expression with 89Zr-Df-TRC105. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 39 (1), 138-148 (2012).
  37. Dijkers, E. C., et al. Biodistribution of Zr-89-trastuzumab and PET omaging of HER2-positive lesions in patients with metastatic breast cancer. Clinical Pharmacolog., & Therapeutics. 87 (5), 586-592 (2012).
  38. Heneweer, C., Holland, J. P., Divilov, V., Carlin, S., Lewis, J. S. Magnitude of enhanced permeability and retention effect in tumors with different phenotypes: Zr-89-abumin as a model system. Journal of Nuclear Medicine. 52 (4), 625-633 (2011).
  39. Holland, J. P., et al. Annotating MYC status with 89Zr-transferrin imaging. Nature Medicine. 18 (10), 1586-1591 (2012).
  40. Jacobson, O., et al. MicroPET imaging of integrin avB3 expressing tumors using 89Zr-RGD peptides. Molecular Imaging and Biology. 13 (6), 1224-1233 (2011).
  41. Keliher, E. J., et al. 89Zr-labeled dextran nanoparticles allow in vivo macrophage imaging. Bioconjugate Chemistry. 22 (12), 2383-2389 (2011).
  42. Abou, D. S., et al. 89Zr-labeled paramagnetic octreotide-liposomes for PET-MR imaging of cancer. Pharmaceutical Research. 30 (3), 878-888 (2013).
  43. Miller, L., et al. Synthesis, characterization, and biodistribution of multiple 89Zr-labeled pore-expanded mesoporous silica nanoparticles for PET. Nanoscale. 6 (9), 4928-4935 (2014).
  44. Zeglis, B. M., et al. An enzyme-mediated methodology for the site-specific radiolabeling of antibodies based on catalyst-free click chemistry. Bioconjugate Chemistry. 24 (6), 1057-1067 (2013).
  45. Nanus, D. M., et al. Clinical use of monoclonal antibody HuJ591 therapy: targeting prostate specific membrane antigen. Journal of Urology. 170 (6 Pt 2), S84-S88 (2003).
  46. Joshi, R., Gangabhagirathi, R., Venu, S., Adhikari, S., Mukherjee, T. Antioxidant activity and free radical scavenging reactions of gentisic acid: in vitro and pulse radiolysis studies. Free Radical Research. 46 (1), 11-20 (2012).
  47. Saran, M., Bors, W. Radiation chemistry of physiological saline reinvestigated: evidence that chloride-derived intermediates play a key role in cytotoxicity. Radiation Research. 147 (1), 70-77 (1997).
  48. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Prichett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), e2771 (2012).
  49. Collier, H., Warner, B. T., Skerry, R. Multiple toe-pinch method for testing analgesic drugs. British Journal of Pharmacology and Chemotherapeutics. 17, 28-40 (1961).
  50. Zanzonico, P. Positron emission tomography: a review of basic principles, scanner design and performance, and current systems. Seminars in Nuclear Medicine. 34 (2), 87-111 (2004).
  51. Anderson, C. J., et al. Copper-64-labeled antibodies for PET imaging. Journal of Nuclear Medicine. 33 (9), 1685-1691 (1992).
  52. Anderson, C. J., et al. Preparation, biodistribution and dosimetry of copper-64-labeled anti-colorectal carcinoma monoclonal antibody fragments 1A3-F(ab')2. Journal of Nuclear Medicine. 36 (5), 850-858 (1995).
  53. Lindmo, T., Boven, E., Cuttitta, F., Fedorko, J., Bunn, P. A. Determination of the immunoreactive fraction of radiolabeled monoclonal antibodies by linear extrapolation to binding at infinite antigen excess. Journal of Immunological Methods. 72 (1), 77-89 (1984).
  54. Lindmo, T., Bunn, P. A. Determination of the true immunoreactive fraction of monoclonal antibodies after radiolabeling. Methods in Enzymology. 121 (1), 678-691 (1986).
  55. Cohen, R., et al. Inert coupling of IRDye800CW to monoclonal antibodies for clinical optical imaging of tumor targets. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 1 (1), 31-43 (2011).
  56. Ruggiero, A., et al. Targeting the Internal Epitope of Prostate-Specific Membrane Antigen with Zr-89-7E11 Immuno-PET. Journal of Nuclear Medicine. 52 (10), 1608-1615 (2011).
  57. Nayak, T. K., Garmestani, K., Milenic, D. E., Brechbiel, M. W. PET and MRI of Metastatic Peritoneal and Pulmonary Colorectal Cancer in Mice with Human Epidermal Growth Factor Receptor 1-Targeted Zr-89-Labeled Panitumumab. Journal of Nuclear Medicine. 53 (1), 113-120 (2012).

Tags

Kemi positronemissionstomografi Antibody biokonjugering Immunkonjugat Desferrioxamin,
Den biokonjugering och radiosynthesis av<sup&gt; 89</sup&gt; Zr-DFO-märkta antikroppar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zeglis, B. M., Lewis, J. S. The… More

Zeglis, B. M., Lewis, J. S. The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies. J. Vis. Exp. (96), e52521, doi:10.3791/52521 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter