Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

שבב microfluidic למבוא לדוגמא ICPMS

Published: March 5, 2015 doi: 10.3791/52525
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Chemistry and Applied Biosciences, ETH Zurich

Summary

אנו מציגים מערכת מבוא מדגם אגל דיסקרטית לספקטרומטריית מצמידים אינדוקטיבי פלזמה המונית (ICPMS). הוא מבוסס על שבב microfluidic זול וחד פעמי שיוצר טיפות monodisperse ביותר בטווח גודל של 40-60 מיקרומטר בתדרים בין 90 ל -7,000 הרץ.

Abstract

פרוטוקול זה דן בייצור ושימוש בשבב חד פעמי עלות הנמוכה microfluidic כמערכת מבוא לדוגמה עבור ספקטרומטריית מצמידים אינדוקטיבי פלזמה המונית (ICPMS). השבב מייצר טיפות מדגם מימיות monodisperse בperfluorohexane (PFH). גודל ותדירות של הטיפות מימיות יכולים להיות מגוון בטווח של 40 עד 60 מיקרומטר ובין 90 ל -7,000 הרץ, בהתאמה. הטיפות נפלטות מהשבב עם זרימה שנייה של PFH ולהישאר שלמים בפליטה. מערכת desolvation שהותקן מסירה PFH ומעבירה את הטיפות לתוך ICPMS. כאן, אותות יציבים מאוד עם חלוקת עוצמת צרה ניתן למדוד, המראים את monodispersity של הטיפות. אנו מראים כי מערכת ההקדמה יכולה לשמש כדי לקבוע כמותית ברזל בתאי דם אדום אחת שור. בעתיד, היכולות של מכשיר ההקדמה יכולות בקלות להיות מורחבות על ידי האינטגרציה של מודולים microfluidic נוספים.

Introduction

ניתוח יסודות של דגימות נוזל על ידי ספקטרומטריית מסת פלזמה בשילוב אינדוקטיבי (ICPMS) מתבצע בדרך כלל תוך שימוש nebulizers בשילוב עם תאי תרסיס כמערכת מבוא 1. במדגם מערכת ההקדמה הזו המדגם הוא ריסס על ידי nebulizer ליצור תרסיס polydisperse. תא תרסיס במורד הזרם משמש לסינון טיפות גדולות. שיטה זו מקושרת עם הצריכה גבוהה מדגם (> 0.3 מיליליטר -1 דקות) 2 ותחבורת מדגם חלקית. לפיכך, הוא הופך להיות מעשי עבור יישומים בהם כרכי מדגם microliter רק זמינים, כמו במחקרים ביולוגיים, זיהוי פלילי, טוקסיקולוגי וקליניים 3. כדי להפחית את צריכת המדגם, nebulizers עם ממדים קטנים יותר זרבובית פותחו 3. עם זאת, גודל הנחיר המופחת מגדיל את הסיכון לסתימה כאשר דגימות של נוזלים ביולוגיים לא מעוכלים או פתרונות מלח מרוכזים צריכים להיות מנותחות 3.

"Jove_content"> גישה שונה להקדמת מדגם הוצעה על ידי et al Olesik. 4. המחברים הזריקו נוזל לתוך ICPMS בצורה של microdroplets הבדיד monodisperse, שיוצרו על ידי micropump מונע piezo-חשמלי. למרות שמערכת זו מאוד לא מצאה יישום רחב, זה שיזם את הפיתוח נוסף של הרעיון של הקדמת אגל דיסקרטית בICPMS. היום, piezo-חשמלי המונעים מחלק מערכות, אשר יכולה ליצור טיפות בגודל של 30, 50, 70 ו -100 מיקרומטר ובתדרים של 100-2,000 הרץ, ניתן לרכוש. יכולות להיות מועברים הטיפות לתוך ICPMS עם קרוב ליעילות של 100% 5. מכשירי microdroplet אלה יושמו לכמותית מדידת חלקיקים אחת 5,6 כמו גם אפיון תאים ביולוגיים בודדים 7. מערכת דומה המבוססת על טכנולוגיית הזרקת דיו תרמית 8 נבדקה לצורך הניתוח של דגימות ביולוגיות 9. למרות avaiמערכות הקדמת טיפה אחת lable הן יעילים מאוד, יכול לשמש לכרכי מדגם קטנים ומבטיחות לניתוח של חלקיקים ותאים, יש להם כמה מגבלות. לגודל נחיר קבוע, גודל הטיפה יכול להיות מגוון רק מעט (אלא אם כן הגדרות מותאמות אישית המשמשות 10). שינויים של התכונות הפיסיקליות של הנוזלים (pH, תוכן מלח) יכולים לשנות את מאפייני אגל (גודל, מהירות זריקה). כמו כן, מכשירים אלה הם יקרים למדי, נוטים לסתימה וקשה לנקות.

שיטה נוספת ליצירת טיפות ידועה בתחום מיקרופלואידיקה רביב 11. בשנים האחרונות מיקרופלואידיקה רביב צברה ריבית ל( ביולוגית) תגובות כימיות 12-15 וללימודי תא בודדים 16,17. בנוסף, טכניקה זו יושמה להחדרת דגימות בספקטרומטר מסת יינון electrospray 18,19 ולהכנת דגימות בdesorption / ionizatio לייזר בסיוע מטריקסספקטרומטר מסת n 20,21.

לאחרונה, הצגנו מערכת מבוססת microfluidic להקדמת מדגם ב -22 ICPMS. המרכיב המרכזי של מערכת המבוא שלנו הוא פליטת אגל שבב הנוזל סייע (אדה). שבב זה מורכב מפולי (dimethylsiloxane) (PDMS) לחלוטין. בצומת הערוץ הראשונה לזרום התמקדות הוא משמש לייצור טיפות monodisperse של תמיסה מימית מדגם (איור 1). למטרה זו (נקודת רתיחה של C ° 58-60 23) בתנודתיות הגבוהה וperfluorohexane מוביל immiscible שלב (PFH) משמשת (איור 1). תכונות אלה מאפשרות PFH דור אגל יציב והסרת מהירה של השלב המוביל. שינויים במאפיינים של מדגם השפעת נוזל שיטת הדור הזה פחות, בהשוואה לגנרטורים טיפה אחרות. גודל הטיפה הוא מתכוונן על פני טווח רחב על ידי שינוי שיעורי הזרימה של השלב המימי וPFH. בsecondar במורד הזרםצומת y, יותר PFH מתווספת להגדיל את מהירות הזרימה לשנייה במרחק של לפחות 1 -1. במהירות זו הנוזל יכול להיפלט מהשבב במטוס יציב וישר (איור 1) ללא הרס אגל (איור הבלעה 1). עיצוב כפול צומת זו מאפשר שליטה על יציבות הסילון העצמאית של דור אגל. הטיפות מועברות לICPMS עם מערכת תחבורה מותאמת אישית. מערכת זו כוללת צינור נופל וdesolvator קרום להסיר את PFH. השאריות מיובשות של הטיפות מימיות מיוננות לאחר מכן בפלזמה של ICPMS ואמצעי גלאי מסת היונים. החלק הקדמי של השבב הוא להבטיח קשר הדוק עם מערכת תחבורת אגל בצורת חבית. הפליטה של ​​המדגם המימי כמו טיפות בPFH מועילה, משום שמגע עם הזרבובית הוא נמנע. זה משמעותי מוריד את הסיכון לסתימת נחיר, מה שיכול להיות בעיה בעבודה עם השעיות תא או שיתוףפתרונות מלח ncentrated. שבבי אדה, מפוברקים על ידי PDMS יתוגרפיה הרכה, זולים (2 עלות חומר כ $ לכל שבב), חד פעמיות וקלים לשנות. בשילוב עם הייצור שדורש רק כמות קטנה של עבודה ידנית כל ניסוי ניתן לבצע עם שבב חדש. לכן, ניקוי מפרך אין צורך וזיהום לחצות ממוזער.

כאן, הייצור של שבב אדה על ידי יתוגרפיה הרכה ובקשתה לICPMS מתוארים. דוגמאות למדידות עם תמיסה מימית והשעית תא מוצגות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ייצור Master-8 SU (איור 2)

הערה: בצע את הייצור של תבניות ההורים SU-8 בחדר נקי כדי למנוע ליקויים שנגרמו על ידי חלקיקי אבק. שני הוופלים נדרשים לייצור, רקיק אחד עם תכונות microfluidic ואחד בלי.

  1. הכן את תבניות ההורים לשבב microfluidic. ראשון ליישם שכבת הדבקה לפרוסות סיליקון.
    1. ליבש פרוסות סיליקון במשך 10 דקות ב 200 מעלות צלזיוס. לקרר את הרקיק עד RT ולטעון אותו למעייל coater ספין והספין אותו עם SU-8 2002 עם הפרוטוקול הבא.
    2. לוותר על 3 מיליליטר להתנגד על גבי פרוסות סיליקון.
    3. ספין הרקיק ב 500 סל"ד במשך 10 שניות כדי להפיץ להתנגד על פני כל הרקיק.
    4. ספין הרקיק ב2,000 סל"ד למשך 30 שניות כדי להשיג גובה להתנגד של כ 2 מיקרומטר.
  2. Remove להתנגד עודף מקצה הרקיק עם ספוגית טבולה אצטון, כדי למנועדבק של פרוסות סיליקון לצלחת החמה בשלב הבא. אופים את פרוסות במשך 60 שניות על 95 מעלות צלזיוס על פלטה חשמלית.
  3. לחשוף את כל הרקיק עם אור אולטרה סגול (80 mJ / 2 סנטימטר ב365 ננומטר). Post-לאפות את הרקיק עבור 120 שניות עד 95 מעלות צלזיוס.
  4. לקרר את הרקיק למטה ולהסתובב מייד מעיל הרקיק שוב באמצעות הפרוטוקול עבור SU-8 2,050 הבא:
    1. ספין הרקיק בבמשך 20 שניות 100 סל"ד (לוותר על 3 מיליליטר SU-8 להתנגד בשלב זה).
    2. ספין הרקיק ב 500 סל"ד במשך 10 שניות כדי להפיץ להתנגד על פני כל הרקיק.
    3. ספין הרקיק ב3,250 סל"ד למשך 30 שניות וכתוצאה מכך עובי להתנגד של כ -40 מיקרומטר.
  5. שוב, להסיר עודפים להתנגד מקצה הרקיק עם ספוגית אצטון ספוגה ואופים רכים הרקיק על פלטה חשמלית במשך 180 שניות על 65 מעלות צלזיוס ול -360 שניות על 95 מעלות צלזיוס.
  6. הכן את photomask ידי Sticking אותו לכוס סודה-סיד. ראה איור 3 לעיצוב המסכה. השתמש aligner מסכה לחשוף להתנגד באור אולטרה סגול (160 mJ / 2 סנטימטר, הנמדד ב365 ננומטר) באמצעות המסכה מוכנה. אופים את פרוסות נחשפו שוב על פלטה חשמלית במשך 60 שניות על 65 מעלות צלזיוס ול -360 שניות על 95 מעלות צלזיוס.
  7. לאחר הקירור למטה הרקיק לRT, לטבול אותו בצלחת פטרי זכוכית מלאה עם יזם במשך 5 דקות כדי לפתח להתנגד. בעדינות להתסיס את צלחת פטרי להסיר את SU-8 שלא נחשפו. יש לשטוף את הרקיק עם isopropanol ולפוצץ אותו יבש עם אקדח חנקן.
  8. לבחון את הרקיק תחת מיקרוסקופ. במקרה מפותח להתנגד שרידים על התכונות, לפתח את הרקיק שוב במשך כמה דקות, כמתואר בשלב 1.7.
  9. הסר את כל ממס שיורי ידי אפיית הוופלים לשעה 2 ב 200 מעלות צלזיוס. בדוק את הגובה של התכונות עם מאבחן צעד. במקרה הגובה נמדד שונה מהגובה הרצוי להתחיל עם זה פרוטוCOL שוב ולהתאים את מהירות הסחיטה בשלב 1.1.4.
  10. כדי למנוע הידבקות של PDMS לרקיק silanize זה ע"י הצבתו בתא ייבוש יחד עם 50 μl של 1 H, H 1, 2 H, 2 -perfluorodecyltrichlorosilane H בצלחת חרסינה קטנה. להפחית את הלחץ בתא הייבוש עד 100 mbar דגירה הרקיק לשעה 12.
    1. לPDMS הריק חלקים silanize פרוסות סיליקון אחרת בשיטה של ​​צעד 1.10. כדי לשמור silanize הזמן שני הוופלים באותו הזמן בתא ייבוש אחד.

ייצור 2. שבב אדה

הערה: שבב אדה הוא עשוי משני חלקים שמחוברים יחד על ידי מליטה הדבקה 24 PDMS. החלק הראשון מכיל את תכונות microfluidic. החלק האחר הוא שטוח ומשמש לאטום ערוצים. מלוכדים יחד, הם יוצרים צורה העגולה הנחוצה לממשק השבב עם מערכת תחבורת אגל. כאן, הייצור שלשני החלקים והחיבור ביניהם מתואר. כל שלבי התהליך מוצגים באיור 4.

  1. הכן 44 גרם של PDMS על ידי ערבוב 40 גרם של prepolymer עם 4 גרם של PDMS סוכן ריפוי (זה יגרום לעד 6 שבבים). דגה PDMS בייבוש עד שהוא בועה חופשית (זה ייקח בערך 20 דקות).
  2. דפוס העתק של החצאים מובנים.
    1. מניחים את צורת הליהוק על גבי הפרוסות סיליקון והצמידה אותו למקום באמצעות המבנים המנחים סביב העיצוב (ראה איור 5). דלג על snapping למקום לHalve PDMS השטוח.
    2. יוצקים 3 עד 4 g כ של PDMS degased בצורת הליהוק ולמקם אותו במשך 6 דקות על צלחת חמה ב 150 מעלות צלזיוס. להתקרר PDMS נרפא בצורת הליהוק ולהרים את רקיק צורת ליהוק בעזרת מרית בזהירות.
    3. על מנת למנוע כל זיהום של ערוצי microfluidic לכסות את הצד השני של השבב שהיה בעבר בwi קשרth הרקיק עם קלטת. לחתוך בזהירות את הקלטת בשולי חלק PDMS להסיר PDMS העודף.
  3. לפברק את החצאים PDMS השטוח לחזור 2.2.1 צעדים הנ"ל ל2.2.3 עם רקיק silanized הריק.
  4. פיל של הקלטת ולנקב חורי חיבור נוזל לתוך חצאים מובנים עם אגרופן ביופסיה. להגן על המבנים עם קלטת במהלך האחסון.
  5. בונד חלקי PDMS יחד על ידי מליטה הדבקה באמצעות PDMS סוכן ריפוי 24.
    1. קח פרוסות סיליקון שלא טופלו ולסובב אותו עם מעיל PDMS סוכן הריפוי במשך 30 שניות ב6,000 סל"ד. קח הרקיק מתוך coater הספין.
    2. הסר את הסרט מחצי מובנים ולמקם אותם במבנים פונים כלפי מטה על גבי פרוסות סיליקון. דחפו בעדינות על גבי PDMS כדי להסיר בועות אוויר.
    3. הסר את הסרט מהחצאים PDMS הריקים. קח Halve מובנה מהרקיק ויישר אותו באופן ידני על גבי Halve PDMS השטוח. יש ללחוץ בעדינותלהיפרד יחד כדי להסיר בועות אוויר ולתת את תרופת השבב התאסף במשך 24 שעות בRT. אל תדחף את החלקים יחד עם כוח כמו זה יכול לגרום לקריסת הערוצים.
  6. חותך את הקצה של השבב לאורך הקו מאונך המחוון לערוץ הזרבובית עם סכין שירות כדי לפתוח את פיית היציאה. השתמש במכשיר יישור כדי להבטיח חתך ישר, אשר הכרחי לפליטת נוזל ישר. בדוק את השבב תחת מיקרוסקופ לפגמים בערוצי microfluidic וחלקיקי אבק. שים סרט על חורי הכניסה כדי להגן על השבבים במהלך האחסון.
  7. חבר בקבוק Woulff עם צינורות למקור חנקן יבש ולכל פתחי הכניסה של שבב אדה. פיקדון 50 μl של H 1, 1 H, 2 H, -perfluorodecyltrichlorosilane 2 H בתחתית בקבוק Woulff ולסגור אותו.
  8. Silanize ערוצי microfluidic על ידי שטיפת כל הערוצים במשך 20 דקות עם זרם חנקן ביצוע 1 H, 1 H H, -perfluorodecyltrichlorosilane 2 H בקצב זרימה של כ 1 מיליליטר / sec. השבבים מוכנים לניסויים ויכולים להיות מאוחסן במשך לפחות כמה שבועות בRT.

3. הכנות למערכת מדידה / אגל תחבורה

הערה: לבנות את כל מערכת תחבורת אגל על ​​גבי שולחן אופטי, שכן הוא הכרחי כדי לבנות מבנה תומך יציב להתקנה. תכנית של מערכת התחבורה אגל כל מתוארת באיור 6.

  1. התקן פולי ציקלונית מותאמת אישית (methacrylate מתיל) מתאם (PMMA) עם 50 סנטימטרים מצורפים צינור נירוסטה אנכית. חבר את המתאם למקור הליום עם זרימה המונית בקר. צרף מצלמה (במהירות גבוהה) ומנורה למתאם באתרים ההפוך להדמיה אגל.
  2. הנח דוד מחסנית באמצע צינור הפלדה ולהשתמש פולי (ויניל כלוריד) צינורות (PVC) וצינור Legrisמחבר לחבר את הקצה של צינור הפלדה עם הכניסה של desolvator הקרום.
  3. חבר את היציאה של desolvator עם עוד צינורות PVC לזרימה למינרית מתאם, אשר מחובר ישירות לכניסת ICPMS. חבר את הזרימה למינרית המתאם למקור ארגון עם זרימה המונית בקר ובהמשך להשתמש בו כדי admix ארגון כדי להשיג מצב פעולה יציב.
  4. יישר את המתאם כמו גם צינור הפלדה אנכי עם פלס. אם היישור אינו מדויק, זה עלול להוביל להפסדים משמעותיים של טיפות. הכנס תקע המתאם כדי למנוע גזים דולפים החוצה במערכת בזמן להתחמם.
  5. התחל תזרים גז כל הנ"ל ומכשירים שמשתמשים בהגדרות מטבלת 1. אפשר למערכת כדי להתחמם במשך 15 דקות. דוד המחסנית צריך 2 שעות כדי לייצב את הטמפרטורה, הפעל אותו מראש.
  6. הנח את משאבות מזרק על מדף בגובה של מתאם הליום ציקלונית. שמור המרחק ביןמשאבות מזרק והמתאם קצר ככל האפשר.

4. מדידות

הערה: הפרוטוקול הבא נכתב באופן כללי בגלל המגוון של פתרונות והשעיות, שניתן להשתמש. עם זאת, צריכה להיות מדוללים השעיות תא לריכוז של <1 x 10 7 מיליליטר תאים /, כאשר ניתוח תא בודד מתבצע, על מנת להבטיח כי הרוב המכריע של הטיפות לשאת רק תא אחד. למדידות עם תאים למקם את משאבות המזרק בזווית כך ששקע של המזרקים מצביע כלפי מטה ולהתקין את צינורות בצורה כזו שהם מצביעים כלפי מטה.

  1. צרף צינורות למזרקים. טען שני 5 מיליליטר מזרקים עם perfluorohexane ומזרק 1 מיליליטר אחד עם פתרון מדגם או השעיה. הסר את כל הבועות לכודות במזרקים וצינורות.
  2. התקן את המזרקים במשאבת מזרק ולחבר אותם לפתחי הכניסה של השבב. התחל משאבות המזרק באמצעות הגדרות ההתחלה מטבלת 1 (או ספיקות גבוהות יותר). תן התזרים 3 עד 5 דקות לייצוב.
    1. הסר את נוזלי עודפים מקצה השבב עם רקמה. הנוזלים צריכים עכשיו להוציא מהשבב במטוס ישר. אם פליטה ישר לא יכולה להיות מושגת על ידי מנגב עם רקמה להחליף את השבב ולהתחיל מחדש עם הצעד הזה.
  3. הסר את התקע מהמתאם ולהכניס את השבב למתאם בזהירות. לשמן את השבב עם FC-40 במידת צורך. שבב יכול לשמש לפחות 2 שעות של ניסויים.
  4. לשנות את קצב הזרימה להיות בתוך הגדרות מדידה המומלצת מטבלת 1. קצב זרימה תחתון של PFH חוסך PFH לא רק, אלא גם מפחית רקע אות, הנגרם על ידי הפרעות isobaric.
  5. תן מערכת 2-5 דקות לייצוב (תלוי בספיקות נבחרו). לייעל את ICPMS לעוצמת האות הגבוהה ביותר של analytes של עניין.
    1. ברציפות להתאים את התזרים של כל gases על הזרימה ההמונית הבקרים (ראה טווחים המומלצים בטבלה 1) עד עוצמת האות המקסימלי של analytes עניין מושגת. Tune כוח הפלזמה ומתחים המתמקדים עדשה (על פי הטווחים המומלצים על ידי היצרן) על ICPMS באותה הדרך.
  6. הגדר את ICPMS ללהתעכב זמן של 10 אלפיות שניים (בקשה למאוד ICPMS משמש אך ניתן להתאים עם מכשירים אחרים, כדי להבטיח רכישת זמן נפתרו). להתחיל להקליט את האות של m / z מסוים תוך שימוש בפרוטוקול של היצרן.
  7. לאחר המדידה, להעביר את הנתונים הגולמיים לתכנית ניתוח נתונים להערכה. הנתונים, בהתחשב בספירה לכל 10 אלפיות שניים, עם מובנה בפונקציה, ועלילה וכתוצאה מכך ערכי מרכז בן נגד סעיפי סל. תתאים לכל שיא בהיסטוגרמה חלוקת התדר זממה עם פונקצית גאוס. הממוצע וסיגמא של הכושר מייצגים את עוצמת האות הממוצעת וסטיית התקן שלה, בהתאמה.
<class = "jove_title" p> 5. כיול קונספט

  1. מדוד פתרון יחיד או סטנדרטי מרכיב רב המכיל את הרכיב או אלמנטים של עניין באותו ספיקות כמדגם.
  2. הנח שבב אדה בצלחת פטרי במיקרוסקופ. לאיכות תמונה טובה יותר להשתמש בשבב שאינו עגול. לפברק שבב זה כמתואר בשלב 2, אבל באמצעות טופס ליהוק מלבני פשוט במקום באופן חלקי בצורת סיבוב אחד.
  3. בצע את השלבים 4.1 ל4.2.1 להתחיל דור אגל. הגדר את ספיקות לספיקות המשמשות בשלב 5.1.
  4. שיא תמונות של הטיפות מימיות עם מצלמה במהירות גבוהה המחובר למיקרוסקופ (אובייקטיבי 20X). השתמש בתוכנת ניתוח תמונה כמו morphometry אגל ותוכנת velocimetry ידי Basu 25 כדי לקבל את קוטר הטיפה הממוצע מההקלטות.
  5. השתמש בקוטר טיפה ממוצע לצורך חישוב טיפת הנפח, בהנחה שרביב היא אובייקט כדורי.
    1. מכרך זה וknריכוז של של אנליטי בטיפה לחשב את מספר האטומים המתאימים. מחלקים את המספר של יונים נמדדו לאגל במספר האטומים כדי להשיג את יעילות הגילוי. השתמש ביעילות גילוי זה כדי לחשב את מספר האטומים במדגם לא ידוע.
      הערה: מאחר שההבדלים בין שבבים בודדים קטנים 22, זה לא צורך לחזור על מדידת גודל טיפה לכל שבב או פתרון אם ספיקות נשארות אותו הדבר. רשימה של גדלי אגל ותדרים לפי שיעורי הזרימה הספציפיים מתפרסמת על ידי et al Verboket. 22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

המערכת הוצגה יכולה להיות מועסק על מנת למדוד כמויות קטנות של פתרונות או השעיות המכילות תאים או חלקיקים. דוגמאות למדידה ואפיון פתרון סטנדרטיים של תאים בודדים מוצגות כאן. ניתן למצוא דוגמאות נוספות בet al Verboket. 22.

בדרך כלל את האות של טיפה אחת של פתרון הוא אירוע קצר מאוד. זה נמשך בדרך כלל לכמה 100 μsec 26. עם ICPMS משמש כאן (להתעכב זמן 10 אלפיות שניות) אותות קצרים כמו אלה לא ניתן לפתור באופן זמני. 7 א איור ואיור 7 ב להראות היסטוגרמה אותות והפצת תדירות של פתרון סטנדרטי Na. הטיפות מגיעות לפלזמה עם ריצוד> 10 msec זמני. זיהוי הוא לא מסונכרן. אותותיו של אחד (201 ± 24), שתי (381 ± 34) או שלושה (560 ± 45) טיפות מזוהות בתוך הזמן להתעכב אחד. וריאציה נמוכה בעוצמת אות מרמזת גבוה dromonodispersity plet. שיא tailing הראשון צפוי התוצאה של שברי טיפה; הסיבה לפיצול זה היא עדיין בחקירה.

גישת הכיול המתוארת ב5 (באמצעות פה פתרון סטנדרטי) נבדקה לקביעת תוכן Fe של תאי דם אדום שור / עגל בודד (6-7 מיקרומטר בקוטר) התלויה בופר פוספט (PBS). ההשעיה של 1 x 10 7 מיליליטר תאים -1 שימשה כדי להבטיח כי הרוב המכריע של טיפות לשאת רק תא אחד. איור 8 מראה את האותות מהתאים כהיסטוגרמה חלוקת תדר. בממוצע בכל תא מכיל x 5.3 ± 1.2 10 8 אטומים Fe (ראה Verboket et al. 22).

איור 1
איור 1. מיקרוסקופ של דור אגל, תאוצה ופליטה. בjunct זרימת התמקדותיון, טיפות מימיות monodisperse נוצרות בזרם של PFH. PFH נוסף מתווסף בצומת שנייה. בהמשך לכך, זרם הנוזל נפלט משבב אדה דרך נחיר. חצים מצביעים על כיוון הזרימה. בר סולם הוא 500 מיקרומטר. הבלעה: מיקרוסקופ של אגל המימי בקליפת PFH לאחר פליטה משבב אדה. בר סולם 100 מיקרומטר. מותאם באישור 22. 2,014 האגודה אמריקנית לכימיה זכויות יוצרים. נתון זה השתנה עם נתונים ממחקר שנערך מאז פרסום במעבדה של PS דיטריך. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. סכמטי של עיבוד SU-8. ראשית שכבת הדבקה מצופה. פרוסות סיליקון היא ספיןמצופה בSU-8 2002, רך אפוי, מבול חשוף באור אולטרה סגול ופוסט אפוי. על גבי שכבה זו מבני microfluidic מיוצרים. הרקיק הוא הספין מצופה SU-8 שינה 2050, ורך אפויות. העיצוב של מבני microfluidic מועבר לרקיק על ידי חשיפתה באור אולטרה סגול באמצעות photomask. לאחר לאפות postexposure, photoresist מפותח וhardbake מתבצע. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
עיצוב איור 3. photomask לאדה השבב המכיל את התכונות הבאות: מבנים) מנחים לטופס הליהוק, ב) כניסה לPFH להאצת אגל, ג) כניסה לPFH לדור אגל וד) כניסה לדוגמא המימית.ה) קו מחוון לחיתוך מחוץ לקצה של השבב. רוחב ערוץ f) = 40 מיקרומטר, g) = 20 מיקרומטר וh) = 25 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4. תרשים תהליך של ייצור שבבי אדה. ראשית המובנה וPDMS השטוח חלקים מיוצרים על ידי דפוס העתק. שתי החתיכות מחוברות יחד על ידי מליטה הדבקה. לבסוף, בקצה של השבב מנותק וערוצי microfluidic הם silanized. מותאם באישור 22. 2,014 האגודה אמריקנית לכימיה זכויות יוצרים. נתון זה השתנה מאז פרסום. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 5
איור 5. ציור טכני של טופס יציקת אלומיניום לשבב אדה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6
איור 6. ציור סכמטי של ההתקנה (לא בקנה מידה). המערכת מורכבת משבב אדה, מתאם ציקלונית, צינור פלדה מחומם, desolvator קרום, וICPMS. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו .

טען / 52525 / 52525fig7highres.jpg "/>
היסטוגרמה 7. (א) חלוקת תדר אותות של טיפות עשויות משל 1 מ"ג לקילו -1 פתרון סטנדרטי Na. (ב) איור של אותות אלה. ב 10 האלפיות השניים להתעכב אותות זמן של אחד (צהוב), שני (אדום) או שלוש טיפות (כחולות) נרשמו. תוחלת וסטיית תקן של האותות נקבעו על ידי פונקציות גאוס הולמים. ספיקות בשימוש היו 0.5, 50, ו -60 דקות μl - 1 מתוך מדגם המימי, PFH לדור אגל, וPFH להאצת אגל, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 8
היסטוגרמה הפצת 8. תדר איור 56 Fe + מסמנת generated על ידי תאי דם אדומים. ממוצע וסטיית התקן של האותות נקבעו על ידי התאמת פונקצית גאוס. ספיקות בשימוש היו 2, 80, ו -80 דקות μl - 1 השעיה תא, PFH לדור אגל, וPFH להאצת אגל, בהתאמה.

הוא גז קצב זרימה .6-.8 L דקות -1
דוד מחסנית 30 W
טמפרטורת קרום Desolvator 160 ° C
גז קצב זרימה לטאטא Desolvator 3-4 דקות L -1
קצב זרימת גז Ar 0.1 L דקות -1
כוח הפלזמה ICP 1,300 W
קצב זרימת מדגם להתחיל 1 μl דקות -1
מדידה 0.3-15 μl דקות -1
שיעור זרימה של דור אגל PFH להתחיל 60 דקות μl -1
מדידה 35-80 דק 'μl -1
שיעור זרימה של אצת אגל PFH להתחיל 60 דקות μl -1
מדידה 35-80 דק 'μl -1

טבלה 1. הגדרות התחל והגדרות מומלצים למדידת ICPMS ומשאבות המזרק.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

למרות שהייצור של השבבים הוא אמין מאוד יש כמה נקודות קריטיות במהלך הייצור הדורשים תשומת לב מיוחדת. ראשית, ניקיון באסיפה חשוב מאוד על מנת למנוע זיהום של השבב על ידי אבק. האבק עלול לחסום את הערוצים ולמנוע דור אגל יציב. שנית, חשוב במיוחד שהקצה הוא לחתוך מאונך לערוץ הזרבובית. הזווית של החתך מאוד משפיעה על זווית הפליטה. אם הנוזל נפלט בזווית זה יכול לגרום לאובדן של הטיפות נפלטו.

בעת בניית תוכנית ההתקנה לוודא שהוא יציב. היישור האנכי של צינור המתכת והמתאם חשוב. כמו כן, במהלך המדידות יש כמה נקודות שצריכות תשומת לב מיוחדת. החדרת השבב למתאם צריכה להתבצע בזהירות. זה יכול לקרות כי במהלך החדרת המטוס משתבש ועוצר. למדידות עם תאי העמדה וorientation של משאבות המזרק והצינורות חשובים. המיקום הנכון שלהם יכול להפחית את היישוב של התאים במזרק ואת צינורות.

יש שבב אדה מוצג כאן כמה יתרונות על פני גנרטורים אגל מסחריים קיימים. המערכת היא חזקה יותר, מספקת מגוון גודל טיפה רחב יותר, אשר יכול להתארך עוד יותר על ידי שינוי של הגיאומטריה הערוץ, והוא חד פעמי. מכשיר ליחד הוא של עניין מיוחד לניתוח דגימות עם תכולה גבוהה של מלחים או שאריות מוצקות, כמו לחלקיקים למשל או השעיות תא, אשר עלול להדביק ערוצים זעירים ולא תמיד יכול להיות דהויה בקלות. ההובלה של microdroplets היחיד שנוצר על ידי אדה לטרשת הנפוצה היא עדיין צעד מגביל במערכת שלנו וצריכה להיות מותאמים יותר. ההרכבה תחבורת אגל הנוכחית, למרות שמסיר את אדי PFH, שאחרת היה ליצור רפאים נוספים והפרעות שאינם רפאים וגורמים לחוסר יציבות פלזמה, אבל Stiתוצאות ll בריצוד זמני גבוה של הגעת אגל בטרשת הנפוצה ותחבורת אגל לא שלמה. בהשוואה למערכות הקדמת אגל הזמינות המסחרית במערכת התחבורה להתקנה זו דורשת יותר ציוד. השבב הנוכחי מיועד להקדמת מדגם בלבד. עם זאת, בשינויים קלים של ההקדמה המתקדמת העיצוב והכנת מדגם צעדי ענן ייושם על-שבב, למשל, דילול 27-29, תגובות מהירות במיוחד ערבוב 30, כימיות 31, 32-34 הפרדה, או מיון תא 35,36. תחת התקני מבוא מתקדמים אנו מבינים לדוגמא מבוא של טיפות מדגם וסטנדרטיים ברצף או במקביל לשבב יחיד. זה יגדיל את התפוקה ולשפר את הדיוק של ניתוח כמותי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicon wafer 100 mm Si-Mat (Kaufering, Germany)
SU-8 2002 Microchem Corp. (Massachusetts, U.S.A.)
SU-8 2050 Microchem Corp. (Massachusetts, U.S.A.)
Acetone Merk VWR (Darmstadt, Germany) 100014
MR-developer 600 Microresist Technology GmbH (Berlin, Germany)
Isopropanol Merk VWR (Darmstadt, Germany) 109634
1H,1H,2H,2H-perfluorodecyltrichlorosilane ABCR-Chemicals (Karlsruhe, Germany) AB111155
Sylgard 184 silicone elastomer kit (PDMS) Dow Corning (Michigan, U.S.A.) 39100000
Perfluorohexane 99% Sigma-Aldrich (Missouri, U.S.A.) 281042
FC-40 ABCR-Chemicals (Karlsruhe, Germany) AB103511
Phosphate-buffered saline  Life Technologies (Paisley, U.K.)  10010-015
Red blood cells in phosphate-buffered saline Rockland Immunochemicals Inc. (Pennsylvania, U.S.A.)  R400-0100
Single-element standard solutions Na, Fe Inorganic Ventures (Virginia, U.S.A.)
Multielement standard solution  Merck Millipore (Massachusetts, U.S.A.) IV
Nitric acid Sub-boiled
Ultrahigh-purity water Merck Millipore (Massachusetts, U.S.A.)
Hot plate HP 160 III BM Sawatec (Sax, Switzerland) used for wafer preparation
Spin modules SM 180 BM Sawatec (Sax, Switzerland) used for wafer preparation
High resolution film photomask Microlitho (Essex, U.K.)
Step profiler Dektak XT advanced Bruker  (Massachusetts, U.S.A.)
Hot plate MR 3002 Heidolph (Schwabach, Germany) used for replica molding 
1.5 mm biopsy puncher Miltex (Pennsylvania, U.S.A.) 33-31AA/33-31A
Spin coater  WS-400 BZ-6NPP/LITE Laurell (Pennsylvania, U.S.A.) used for adhesive bonding
Syringe pump neMESYS Cetoni (Korbussen, Germany)
1 ml syringe  Codan (Lensahn, Germany)  62.1002
5 ml syringe  B. Braun (Melsungen, Germany)  4606051V
PTFE tubing  PKM SA (Lyss, Switzerland)  PTFE-AWG-TFT20.N
Quadrupole-based ICPMS ELAN6000 PerkinElmer (Massachusetts, U.S.A.) 
Membrane desolvator CETAC6000AT+ CETAC Technologies (Nebraska, U.S.A.)  only the desolvator unit is used
High speed camera Miro M110 Vision Research (New Jersey, U.S.A.)
Data analysis program Origin pro OriginLab Corp. (Massachusetts, U.S.A.) version 8.6
Microscope Olympus (Tokyo, Japan) IX71

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Todoli, J. -L., Mermet, J. -M. Liquid sample introduction in ICP spectrometry: A Practical Guide. , Elsevier. Amsterdam. 10-1016 (2008).
  2. Sutton, K. L., B'Hymer, C., Caruso, J. A. Ultraviolet absorbance and inductively coupled plasma mass spectrometric detection for capillary electrophoresis - A comparison of detection modes and interface designs. J. Anal. At. Spectrom. 13 (9), 885-891 (1998).
  3. Todoli, J. -L., Mermet, J. -M. Sample introduction systems for the analysis of liquid microsamples by ICP-AES and ICP-MS. Spectrochim. Acta, Part B. 61 (3), 239-283 (2006).
  4. Olesik, J. W., Hobbs, S. E. Monodisperse dried microparticulate injector - A new tool for studying fundamental processes in inductively-coupled plasma. Anal. Chem. 66 (20), 3371-3378 (1994).
  5. Gschwind, S., Hagendorfer, H., Frick, D. A., Günther, D. Mass quantification of nanoparticles by single droplet calibration using inductively coupled plasma mass spectrometry. Anal. Chem. 85 (12), 5875-5883 (2013).
  6. Garcia, C. C., Murtazin, A., Groh, S., Horvatic, V., Niemax, K. Characterization of single Au and SiO2 nano- and microparticles by ICP-OES using monodisperse droplets of standard solutions for calibration. J. Anal. At. Spectrom. 25 (5), 645-653 (2010).
  7. Shigeta, K., et al. Sample introduction of single selenized yeast cells (Saccharomyces cerevisiae) by micro droplet generation into an ICP-sector field mass spectrometer for label-free detection of trace elements. J. Anal. At. Spectrom. 28 (5), 637-645 (2013).
  8. Orlandini v. Niessen, J. O., Schaper, J. N., Petersen, J. H., Bings, N. H. Development and characterization of a thermal inkjet-based aerosol generator for micro-volume sample introduction in analytical atomic spectrometry. J. Anal. At. Spectrom. 26 (9), 1781-1789 (2011).
  9. Orlandini v. Niessen, J. O., Petersen, J. H., Schaper, J. N., Bings, N. H. Comparison of novel and conventional calibration techniques for the analysis of urine samples using plasma source mass spectrometry combined with a new dual-drop-on-demand aerosol generator. J. Anal. At. Spectrom. 27 (8), 1234-1244 (2012).
  10. Shigeta, K., et al. Application of a micro-droplet generator for an ICP-sector field mass spectrometer - optimization and analytical characterization. J. Anal. At. Spectrom. 28 (5), 646-656 (2013).
  11. Teh, S. -Y., Lin, R., Hung, L. -H., Lee, A. P. Droplet microfluidics. Lab on a Chip. 8 (2), 198-220 (2008).
  12. Zheng, B., Tice, J. D., Ismagilov, R. F. Formation of arrayed droplets by soft lithography and two-phase fluid flow, and application in protein crystallization. Adv. Mater. 16 (15), 1365-1368 (2004).
  13. Theberge, A. B., et al. Microfluidic platform for combinatorial synthesis in picolitre droplets. Lab Chip. 12 (7), 1320-1326 (2012).
  14. Li, L., et al. Nanoliter microfluidic hybrid method for simultaneous screening and optimization validated with crystallization of membrane proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103 (51), 19243-19248 (2006).
  15. Zhang, Q., Liu, X., Liu, D., Gai, H. Ultra-small droplet generation via volatile component evaporation. Lab Chip. 14 (8), 1395-1400 (2014).
  16. Baret, J. C., Beck, Y., Billas-Massobrio, I., Moras, D., Griffiths, A. D. Quantitative cell-based reporter gene assays using droplet-based microfluidics. Chem. Biol. 17 (5), 528-536 (2010).
  17. Brouzes, E., et al. Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (34), 14195-14200 (2009).
  18. Pei, J., Li, Q., Lee, M. S., Valaskovic, G. A., Kennedy, R. T. Analysis of samples stored as individual plugs in a capillary by electrospray ionization mass spectrometry. Anal. Chem. 81 (15), 6558-6561 (2009).
  19. Kelly, R. T., Page, J. S., Marginean, I., Tang, K., Smith, R. D. Dilution-free analysis from picoliter droplets by nano-electrospray ionization mass spectrometry. Angew. Chem., Int. Ed. 48 (37), 6832-6835 (2009).
  20. Küster, S. K., et al. Interfacing droplet microfluidics with matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: label-free content analysis of single droplets. Anal. Chem. 85 (3), 1285-1289 (2013).
  21. Pabst, M., Jefimovs, K., Zenobi, R., Dittrich, P. S. High-Resolution Droplet-Based Fractionation of Nano-LC Separations onto Microarrays for MALDI-MS Analysis. Analytical Chemistry. 86 (10), 4848-4855 (2014).
  22. Verboket, P. E., Borovinskaya, O., Meyer, N., Günther, D., Dittrich, P. S. A New Microfluidics-Based Droplet Dispenser for ICPMS. Analytical Chemistry. 86 (12), 6012-6018 (2014).
  23. Ammerman, C. N., You, S. M. Determination of the boiling enhancement mechanism caused by surfactant addition to water. J. Heat Transfer. 118 (2), 429-435 (1996).
  24. Samel, B., Chowdhury, M. K., Stemme, G. The fabrication of microfluidic structures by means of full-wafer adhesive bonding using a poly(dimethylsiloxane) catalyst. J Micromech Microeng. 17 (8), 1710-1714 (2007).
  25. Basu, A. S. Droplet morphometry and velocimetry (DMV): a video processing software for time-resolved, label-free tracking of droplet parameters. Lab Chip. 13 (10), 1892-1901 (2013).
  26. Dziewatkoski, M. P., Daniels, L. B., Olesik, J. W. Time-resolved inductively coupled plasma mass spectrometry measurements with individual, monodisperse drop sample introduction. Anal. Chem. 68 (7), 1101-1109 (1996).
  27. Abate, A. R., Hung, T., Mary, P., Agresti, J. J., Weitz, D. A. High-throughput injection with microfluidics using picoinjectors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107 (45), 19163-19166 (2010).
  28. Bremond, N., Thiam, A. R., Bibette, J. Decompressing emulsion droplets favors coalescence. Phys. Rev. Lett. 100 (2), 024501 (2008).
  29. Niu, X., Gulati, S., Edel, J. B., deMello, A. J. Pillar-induced droplet merging in microfluidic circuits. Lab Chip. 8 (11), 1837-1841 (2008).
  30. Song, H., Ismagilov, R. F. Millisecond kinetics on a microfluidic chip using nanoliters of reagents. J. Am. Chem. Soc. 125 (47), 14613-14619 (2003).
  31. Song, H., Chen, D. L., Ismagilov, R. F. Reactions in droplets in microflulidic channels. Angew. Chem., Int. Ed. 45 (44), 7336-7356 (2006).
  32. Lombardi, D., Dittrich, P. S. Droplet microfluidics with magnetic beads: a new tool to investigate drug-protein interactions. Anal. Bioanal. Chem. 399 (1), 347-352 (2011).
  33. Edgar, J. S., et al. Compartmentalization of chemically separated components into droplets. Angew. Chem., Int. Ed. 48 (15), 2719-2722 (2009).
  34. Edgar, J. S., et al. Capillary electrophoresis separation in the presence of an immiscible boundary for droplet analysis. Anal. Chem. 78 (19), 6948-6954 (2006).
  35. Baret, J. C., et al. Fluorescence-activated droplet sorting (FADS): efficient microfluidic cell sorting based on enzymatic activity. Lab Chip. 9 (13), 1850-1858 (2009).
  36. Agresti, J. J., et al. Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107 (9), 4004-4009 (2010).

Tags

ביו-הנדסה גיליון 97 ספקטרומטריה ICPMS מיקרופלואידיקה מיקרופלואידיקה רביב monodisperse מבוא מדגם שבב תאי דם אדומים אריתרוציטים ניתוח תא בודד
שבב microfluidic למבוא לדוגמא ICPMS
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Verboket, P. E., Borovinskaya, O.,… More

Verboket, P. E., Borovinskaya, O., Meyer, N., Günther, D., Dittrich, P. S. A Microfluidic Chip for ICPMS Sample Introduction. J. Vis. Exp. (97), e52525, doi:10.3791/52525 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter