Introduction
מבחני תרבות התא הנוכחיים monolayer או השעיה לפיתוח תרופות לא מצליחין לחקות את microenvironment הסלולרי האנושי, ולכן, להוביל לdedifferentiation ואובדן התפקוד בתרביות תאים אנושיים ראשוניות מהירים. דגמי רקמה עם הרלוונטיות פיסיולוגיות גבוהות יותר יש צורך לחזות את היעילות ובטיחות של תרכובות לפני שהודית להם בניסויים קליניים. לאחרונה, סטנדרטי בטכניקות תרבית תאים במבחנה התפתח מתרבויות monolayer דו-ממדיות לדגמים רב-תאיים תלת-ממדיים, במטרה לחקות את in vivo מייקרו-סביבת הרקמות. מערכות אלה כבר הראו שיפורים משמעותיים לקראת חיזוי מדויק יותר של אופן פעולה של תרכובות 1,2. יתר על כן, התאמה במבחנה תנאי התרבות לצרכי מיוחדים מאוד של תאים היא עניין מיוחד.
תחת תקן בתנאי מבחנה, מגוון רחב של רחוב ללא מוצא חשובפרמטרים ture, כגון אספקת חומרי מזון וחמצן, הסרת מוצרי צבירה, וכוח מכאני הפועלים על התאים לעתים קרובות לא ניתן לשלוט באופן יסודי ברוב המקרים. איברים רבים ברשות הדרגתיים ריכוז רלוונטי מבחינה פיזיולוגית של חומרים וחמצן מומס. עם זאת, תנאי פיקוח הדוקים והמותאמים אלה נמצאים באופוזיציה ברורה להדרגתיות דיפוזיה בלתי נשלטת סביב רקמות בתנאים במבחנה, שמוביל לסביבה מאוד לא יציבה והגבלת פיתוח סלולארי 3. לפיכך, יציב יותר ויותר במיוחד לכימות בתנאי מבחנה נדרשות לשמור תאי קיימא ומובחן על פני תקופות זמן ארוכות. מערכות perfused, שבו רכיבים בינוניים יוסרו באופן קבוע והוחלפו, הן לעתים קרובות טוב יותר מאופיינות לשליטה מאשר תרבויות סטטי הנוגעות ישיר המקיף את רקמות. בתנאים סטטיים, מילויים דיפוזיה של הפרשות תא וחומרים מזינים מדיום התרבותאולי מקיף את התאים בתרבית 3. מאופיינות היטב ספיקות בינוניות היכרות סביב הרקמות מאפשרות להפרשות התא לערבב עם המדיום העשיר דרך זלוף. זה מאפשר את הדור של microenvironments הסלולרית המוגדרת, הבטחת פנוטיפ סלולארי יציב וחילוף חומרי ביטוי אנזים לאורך כל משך assay 4.
ההתפתחויות האחרונות ברב-איבר שבב (MOC) מבוסס מערכות לשלב את היתרונות של זרימה בינונית מבוקרת סביב מהונדסים רקמות עם הדרישות בינוניות ומסת תאים הקטנות של bioreactors microscale, שהובילו לכמות מופחתת של חומר הנדרש במהלך בדיקה. מספר מערכות microfluidic לתרבית רקמה תוארו עד כה 5,6. יחסי רקמה לנוזל בתוך מערכות אלה לשחק תפקיד מכריע במיוחד בהדמיית crosstalk הסלולרי רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. עם זאת, בשל מגבלות טכניות, כגון השימוש במשאבות חיצוניות ומאגרי מדיה, הדואר הכוללים במחזור מדיה נפח ברוב המערכות גדול מדי בהשוואה להיקפי הרקמות. קבוצת שולר ואח '. היתה הראשונה לפתח מערכת הבטחה פעמים מגורים נאותות של חומרים בתוך תאי תרבית תאים וברקמות 7,8 רלוונטי vivo לנוזל יחסים. זו הושגה על ידי מדרוג המאגר החיצוני עד לצלחת 96-היטב, מייצג גם את התא "רקמות אחרות". על מנת למזער את במחזור מדיה הנפח בתוך פלטפורמת MOC שלנו, אנו משולבים micropump על שבב peristaltic, ומבטל את הצורך במעגלי תקשורת חיצוניים. micropump זה מסוגל להפעיל את המערכת במספר לבחירה של מהירויות זרימת מדיה ושיעורי מאמץ גזירה 9. מערכת ערוץ microfluidic של 500 מיקרומטר ורוחב 100 מיקרומטר גובה חיבורי שני חללי תרבית רקמה סטנדרטיים, כל אחד מהם בגודל של באר אחד של צלחת 96-היטב. דבקות בגדלים של צלחת גם תקן התעשייהs מאפשרת האינטגרציה של מודלים רקמה קיימים כבר מיוצרים בפורמט transwell. יתר על כן, המיקום האנכי של transwell מוסיף תרבית תאים הוא מתכוונן, המאפשר הטיפוח של דגמי רקמה שאינם רק נחשפו ישירות לזרימת הנוזל, אבל יכול להיות גם הרים ומוגן מפני נוכחי הבסיסית. באופן דומה, תרבויות ממשק אוויר נוזלי הן אפשריים באמצעות מערכת זו.
פלטפורמת MOC היא מפוברקת משכבה polydimethylsiloxane (PDMS) 2 מ"מ גבוהה ושקופיות מיקרוסקופ זכוכית עם טביעת רגל של 75 x 25 מ"מ 2, שמודבקים באופן קבוע על ידי חמצון פלזמה בלחץ נמוך כדי ליצור מעגל microfluidic הנוזל חזק. שכבת PDMS המכילה את הערוצים המתאימים ותאי תרבית תאים מופקת על ידי יתוגרפיה הרכה סטנדרטית והעתק דפוס 9. עיצוב microfluidic של MOC שימוש במהלך מחקר זה מורכב משני מעגלים נפרדים לכל שבב microfluidic, כל אחד מחזיק שני התא גתאי ulture מחוברים על ידי מערכת ערוץ 100 מיקרומטר גבוהה. זה אפשר את הביצועים של שני cocultures שתי רקמות בודדות באמצעות שבב רב-איבר אחד. תדרי שאיבה הותאמו ללהניב שיעורי זרימה בינוניים של 40 μl / min.
עיצוב MOC שתי רקמה זו סיפק את יכולת coculture אליפטית כבד וביופסית עור במקומות תרבות נפרדות, אם כי במעגל תקשורת משולבת תחת תנאי זרימה פיסיולוגיים. תאים המובחנים HepaRG קובצו יחד עם תאים אנושיים כבד stellate (HHSteC) ביחס של 24: 1 ליצירת spheroids הומוגנית. יחס זה נמצא כאופטימלי, כפי שנצפה בניסויים קודמים 10, למרות ש, כמעט פי שתיים את מספר hepatocytes שימש בהשוואה למצב בvivo. העור היה מעובד בממשק אוויר נוזלי בתוך להכניס את תרבות תא transwell, ובכך לאפשר חשיפת חומר אקטואלית. דגמי רקמה אלה cocultivated לד 28ays בMOC כדי להדגים את שלמותה של מערכת זו. יתר על כן, במעגל ערוץ microfluidic של השבבים היה מכוסה באופן מלא עם תאי כלי דם עורי אנושיים האנדותל (HDMEC) כדי לדמות את מערכת כלי הדם באופן הדוק יותר.
Protocol
הערה: עורלה לנוער אדם הושגה באישור הסכמה ואתיקה הודיע (אתיקת ועדת Charité אוניברסיטה לרפואה, ברלין, גרמניה), בציות לחוקים הרלוונטיים, מניתוחי ילדים לאחר ברית מילה שגרתית.
1. הפקה שווה רקמות לטיפוח בMOC
- לצבור HepaRG וHHSteC בתליית צלחות ירידה ליצור spheroids כבד.
- על מנת להשיג trypsinization של תאי HepaRG גדלו בצלוחיות תרבית תאים (75 סנטימטר 2), להסיר את המדיום וממחוברות, תרבויות monolayer מובחנות, לשטוף עם PBS פעמיים, ולהוסיף 3 מיליליטר של 0.05% טריפסין / EDTA. דגירה של 3 עד 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ולעצור את התגובה על ידי הוספת 6 מיליליטר של מעכבי טריפסין.
- תאי צנטריפוגה HepaRG ב XG 150 במשך 5 דקות, להסיר supernatant, resuspend התא גלולה ב 1 מיליליטר של מדיום תרבית תאי HepaRG, ולספור תאים. כדאיות תא צריכים להיות> 90%.
- בעל מנת להשיג את trypsinization של תאי HHSteC, להסיר את המדיום מתרבויות monolayer, לשטוף עם PBS פעמיים, ולהוסיף 3 מיליליטר של 0.05% טריפסין / EDTA. דגירה של 5 דקות על 37 מעלות צלזיוס ולעצור את התגובה על ידי הוספת 6 מיליליטר של מעכבי טריפסין.
- צנטריפוגה תאי HHSteC ב XG 150 במשך 5 דקות, להסיר supernatant, resuspend התא גלולה ב 1 מיליליטר של מדיום תרבית תאי HepaRG, ולספור תאים.
- לשלב HepaRG וHHSteC ביחס של 24: 1 במדיום תרבית תאי HepaRG. לשם כך, להתאים את מספרי תא על ידי דילול השעיות תא בתרבית תאים בינוני HepaRG ולהוסיף 1 x 10 5 תאים / מיליליטר HHSteC ל -4.8 x 10 6 תאים / מיליליטר HepaRG תאים. מערבבים בזהירות.
- הכן צלחת טיפת תלייה על ידי הוספת 2 מיליליטר של PBS לירידה התלויה וצלחת מקלט.
- פיפטה 20 μl של ההשעיה התא לבאר כל צלחת טיפת תלייה. תמיד להכין כ -10% יותר ממה שאתה תליית טיפות צריך לשלוף אגרגטים, כחלק מצרפים הם איבדו during ההליך. בזהירות להניח את הצלחת בחממה 37 ° C. חכה 48 שעות לspheroids כדי ליצור.
- כדי לאחזר את spheroids, הקפד להשתמש בטיפי פיפטה עם סיומות קצה רחבות או לחתוך את קצות הטיפים פיפטה 1 מיליליטר עם סכין סטרילי כדי להרחיב את הפתח לכ 2 עד 3 מ"מ. השתמש בעצות פיפטה אלה להתמודד spheroids מבלי לשבש אותם.
- לשטוף את spheroids בזהירות מצלחת טיפת תלייה על ידי הוספה שוב ושוב 1 מיליליטר של תקשורת לחלק העליון של הבארות של צלחת טיפת תלייה בעזרת פיפטה. לשטוף את הצלחת עד שכל spheroids נפל מ. Spheroids מעט בקוטר בינוני של 300 עד 400 מיקרומטר וגובה של 200 עד 300 מיקרומטר בשלב זה בצורת דיסק.
- לאסוף את spheroids בצלחת המקלט ולהעביר אותם לצלחות מצורפים נמוכות במיוחד 24 גם עם מקסימום של 20 spheroids לכל גם באמצעות הטיפים פיפטה מוכנים. התאם את כרכי תקשורת בכל טוב לרמה של 0.5 מיליליטר. השתמש 20 אגרגטים לINOculate אחד מעגל MOC להשיג שיעור מזעור של 1 / 100,000 לגבי במספרי תא vivo.
- דגירה spheroids על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עד לשימוש נוסף בMOC. אין לאחסן את spheroids יותר משלושה ימים לפני השימוש כדי להבטיח השוואה. לטפח המצרפים לפחות יום אחד בצלחות מצורפים נמוכות במיוחד כדי לאחזר את spheroids הומוגנית.
- להמשיך באחת משתי גישות ליצירה שווה רקמת עור: השימוש בביופסיות אגרוף (1.2.1) או השימוש במוכן במודלים חוץ גופית רקמה (1.3.1).
- חותך transwells עם סכין ליבון מתחת לסוגר להכין תרבות מוסיף תא 96-היטב ולאחסן בתנאים סטריליים עד לשימוש נוסף.
- לעקר דגימות עורלה באתנול 80% למשך 30 שניות ולחתוך את הטבעת פתוחה. דגימות צריכה להיות גובה ממוצע של 2 מ"מ.
- השתמש בביופסיה לחתוך ביופסיות של 4.5 מ"מ בקוטר להשיג miniaturiza שווהיחס tion עבור שניהם כבד ועור. טען את הביופסיות ל96-גם מוכן transwell מחדיר עם מלקחיים. דואג למצב את הביופסיות עם צד אפידרמיס יפנה כלפי מעלה.
- תרבית תאי מקום מחדירה עם ביופסיות בצלחת מקלט המכילות בינוני HepaRG תרבית תאים ולאחסן ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עד לשימוש נוסף בMOC. האם לא דגימות חנות יותר מ2-3 שעות.
- לשלב מוכן בדגמי עור מבחנה, נרכש מיצרנים שונים, למשרד התקשורת, ולוודא כי הם נמצאים ב96-היטב transwell פורמט. השתמש במדיום תרבית תאים המסופק על ידי הספק או, אם coculture עם רקמה אחרת שחזה בצעד נוסף, להשתמש במדיום מינימאלי תמיכה בשתי הרקמות. בדוק את המדיום המינימלי המתאים בניסויים סטטיים מוקדמים ליכולתה לתמוך ברקמות.
- אחזר דגמי עור מצלחת בעל ולחתוך מוסיף 96-היטב מתחת למנוף עם סכין ליבון. מניחים את מוסיף לצלחת המקלט והחנות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עד לשימוש נוסף בMOC. האם לא דגימות חנות יותר מיום אחד.
2. ייצור MOC
- מערבבים את PDMS וסוכן ריפוי ביחס של 10: 1 (V / V) ומניחה את התערובת תחת ואקום במשך 15 דקות כדי להסיר בועות אוויר.
- בינתיים, טיפול בכיסוי צלחת פוליקרבונט עם תוסף גומי סיליקון על 80 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
- הכנס ברגי טפלון לתוך חורי התאמה של כיסוי הצלחת כדי ליצור את ארבעה PDMS ללא תאי תרבית תאים ושש ממברנות PDMS, 500 מיקרומטר עבים, של micropump.
- חבר את כיסוי הצלחת מוכן עובש אביהם של שני מעגלי כלי הדם ולהזריק PDMS degassed. שים לב שלא לשלב את בועות אוויר במערכת. אם בועות לצאת, תנסה להסיר אותם על ידי הטיית המכשיר.
- דגירה המערכת על 80 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות כדי לרפא את שכבת PDMS.
- הסר את עובש האב וברגי הטפלון מהמכשיר ולהתחבר שכבת PDMS לשקופיות זכוכית עם טביעת רגל 75 x 25 מ"מ 2 באמצעות חמצון פלזמה בלחץ נמוך.
- בורג מתאמי MOC חוט מיוחדים לכל ארבעת תאי תרבית תאים של כיסוי הצלחת.
- חבר מזרקים המכילים מדיום תרבות Luer נקבת x ¼-28 מתאמי זכר ולדפוק להם מתאמי MOC של כיסוי הצלחת.
- הזרק הבינוני למעגל microfluidic על ידי לחיצה שוב ושוב למטה ומושכים את בוכנות מזרקים.
- בדוק את המילוי הנכון של הערוצים עם מדיום תחת מיקרוסקופ.
3. Endothelialization של MOC
- לפני endothelializing MOC, סומק כל מעגל MOC עם מדיום גידול תא האנדותל ודגירה אותו באופן סטטי במשך שלושה ימים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- לעקר את MOCs באמצעות אתנול לנגב ומניח אותם מתחת לספסל זרימה למינרית. אניבנוסף n, לעקר שני זוגות מלקחיים ושני מפתחות משושה לשימוש נוסף.
- שחרר את הכובעים של תא תרבית רקמה של MOC באמצעות מקשי המשושה ולהסיר את המכסים באמצעות המלקחיים. לאחר ההכנסה בינונית, כיפות מתברגים בחזרה על MOCs באותה הדרך.
- על מנת להשיג trypsinization של תאי כלי דם עורי אנושיים האנדותל (HDMEC), להסיר את המדיום מתרבויות monolayer, לשטוף עם PBS פעמיים, ולהוסיף 3 מיליליטר של 0.05% טריפסין / EDTA. דגירה של 5 דקות על 37 מעלות צלזיוס ולעצור את התגובה על ידי הוספת 6 מיליליטר של מעכבי טריפסין.
- צנטריפוגה HDMEC ב 220 XG במשך 5 דקות, להסיר supernatant, resuspend התא גלולה ב 1 מיליליטר של מדיום גידול תא אנדותל, ולספור תאים. כדאיות תא צריכים להיות> 90%.
- התאם את ספירת התאים בהשעית התא לריכוז סופי של 2 x 10 7 תאים / מיליליטר ידי דילולו במדיום גידול תא האנדותל ולהעביר 250 μl שלו למזרק 1 מיליליטר. החל ריכוז זה של תאים למשרד התקשורת כדי לשמור על קצב המזעור של 1 / 100,000 לכל האיברים.
- חבר את המזרק לנקבת x ¼-28 מתאם זכר Luer, לגרש את האוויר מזה הולם, ולדפוק אותו למתאם MOC חוט מיוחד. חבר את המתאם לאחד משני התאים של כל מעגל MOC.
- חבר מזרק ריק באותה הדרך לתא השני של מעגל MOC.
- להזריק את התאים באופן שווה על ידי דחיפה כלפי מטה ומושכים את שתי בוכנות מזרק מספר פעמים באופן רצוף. לשלוט בעירוי של תאים תחת מיקרוסקופ.
- דגירה MOC על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 בתנאי סטטי במשך 3 שעות על מנת לאפשר לתאים לדבוק בקירות הערוץ.
- הסר את השבב מהחממה, למקם אותו מתחת לספסל זרימה למינרית, ולהחליף את המזרקים ומתאמי MOC עם תאי תרבית תאי MOC חוט מיוחדים.
- להוסיף 400 μl של מדיום החדש לcom אחדpartment של כל מעגל MOC ולתת לו לשטוף בצינורות בלחץ ההידרוסטטי. לאחר מכן, להחליף את המדיום בשני התאים עם 300 μl של מדיום חדש.
- סגור את התאים באמצעות כובעים, כפי שמתואר ב3.1.2.
- חבר את השבב ליחידת בקרת משאבה. התאם את מהירות השאיבה לתדר של .475 הרץ ולטפח את השבב על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- החלף את המדיום של כל תא MOC כל יום או יומיים ולפקח על המורפולוגיה של תאים על ידי מיקרוסקופ אור.
4. Loading של צ'יפ
- הנח את MOC תחת הזרימה למינרית הספסל ולפתוח אותו, כמתואר בשלב 3.1.2.
- הסר את המדיה מהתאים בתרבית הרקמה ולהחליף אותו עם 300 μl של מדיום תרבית תאים הטרי HepaRG.
- העבר את 20 spheroids הופיע לתא תרבית רקמה אחת של כל מעגל MOC באמצעות הטיפים פיפטה עם פתח רחב (ראה צעדים 1.1.8 / 9). סגור את גap באמצעות מלקחיים ומפתחות משושה.
- מוסיף העברת 96-גם תרבית תאים המכילים שווה עור לתא תרבית רקמה הנותר של כל מעגל MOC באמצעות מלקחיים. תשמור על עצמך כדי למנוע היווצרות בועה מתחת הקרום של העור שווה הערך. כדי לעשות זאת, הכנס transwells בזווית מעט מוטה ולדחוף בעדינות. הסר בינוני עודף סביב transwell נדחף מלמטה עם טפטפת.
- סגור את המכסה באמצעות מלקחיים ומפתחות משושה.
5. חיבור צ'יפ ליחידת משאבת הבקרה
- פרמטרים תפעוליים שנקבעו ביחידות הבקרה לערכים רצויים. שינוי לחץ אוויר בין 0 ל -8,000 mbar, ואקום שבין 0 ל -800 mbar, ושאיבת תדירות 0.24-2.4 הרץ. הגדר את כיוון השאיבה בכיוון השעון או נגד.
- הסר את הרקמה שווה MOC מכיל מתחת לספסל הזרימה למינרית ולחבר אותו ליחידות בקרת משאבה.
- בעקבות numeratיון בצינורות, להכניס צינור לחץ אוויר לאביזרים המתאימים במשרד התקשורת.
- לטפח MOC על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור או, במקרה של הדמיה רקמת חיה, השתמש בתמיכת משרד התקשורת כדי לחמם את השבב עד 37 מעלות צלזיוס ולטפח את השבב מחוץ לחממה. השתמש בתמיכה המחוממת לטפח תאים בMOC תחת מיקרוסקופ רגיל.
6. ביצוע החלפות מדיה, דגימת מדיה וחשיפה לחומרים
- לבצע חילופי תקשורת שיגרתי בכל יום או בכל יום אחר, בהתחשב בסוג של רקמה תרבותית והפעילות המטבולית של התאים.
- אחזר את MOC מן החממה ולבחון אותה תחת מיקרוסקופ כדי לשלוט ספיקות תקשורת ולבדוק לזיהום.
- נתק את MOC מיחידת בקרת משאבה ידי ניתוק צינור לחץ האוויר. לעקר את MOC באמצעות מגבוני אתנול ולשים אותו מתחת לספסל הזרימה למינרית.
- פתח את comp תרבית הרקמהartment מכיל spheroids הכבד, כמתואר בשלב 3.1.2.
- הסר עד 200 μl מהתא באמצעות פיפטה מבלי לשבש את spheroids ולאחסן הבינוני ובריק של צלחת עמוקה היטב. לנתח את מדגם מדיה ישירות או לסגור את הצלחת העמוקה היטב ולאחסן דגימות התקשורת ב -80 ° C לניתוח נוסף.
- החלף את המדיום של MOC עם תרבית תאים בינוני עד 250 μl טרי ולסגור את המכסה. ההבדל בכמות בינונית הוסר והוחלף חשבונות להפסד כתוצאה מכמויות קטנות דולפים החוצה של השבב בעת סגירת המערכת.
- פתח את מכסה תא תרבית הרקמה מחזיק שווה עור בשלב זה כדי לבדוק תקינות רקמות. יש להיזהר שלא להכניס בועות אוויר לתוך המערכת. סגור את המכסה.
- חבר את צינורות של יחידת בקרת המשאבה לMOC, לפי צעד 5.3, ולמקם את MOC באינקובטור.
7. ניתוח דגימות יומית מדיה ולבצע אונליין ניתוח
- לנתח את ביצועי תרבית רקמה על השורה באמצעות הדמיה תא חי או לא מקוון, על ידי ניתוח דגימות תקשורת מדי יום. בצע האחרון על ידי מבחני סטנדרטיים שגרה האנזימטית (למשל לקטט דהידרוגנז (LDH) פעילות) או ELISA (למשל ריכוז אלבומין). ניתוח מקוון מתואר בבא.
- הסר את המדיה של MOC endothelialized, כפי שמתואר בשלבים 6.1.1 ל6.1.4, ולהחליף אותו בשני תאים בתרבית הרקמה עם 200 μl של 10 מיקרוגרם ליפופרוטאין פתרון / fluorophore מיליליטר מצומדות acetylated בצפיפות נמוכה (LDL) (בדילול מלא תקשורת תרבית תאים).
- סגור את המכסים. חבר את MOC ליחידת בקרת משאבה, לפי צעד 5.3, ולשאוב אותו למשך 30 דקות ב .475 הרץ להפיץ את הפתרון באופן שווה בתוך מעגל microfluidic.
- לעצור את השאיבה ודגירת MOC סטטי תמורת 3.5 שעות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- t דומהo צעד 7.2, להסיר את פתרון LDL acetylated משני התאים ולהחליף אותו עם 400 μl של מדיום טרי באחת משני התאים.
- חכה במשך 3 עד 5 דקות כדי לאפשר ללחץ ההידרוסטטי לנהוג הבינוני דרך מעגל ערוץ microfluidic.
- החלף את המדיום שזרם דרך עם 300 μl של מדיום חדש וגם למלא את תא תרבית הרקמה השני עם 300 μl של מדיום חדש.
- סגור את MOC, על פי שלב 3.1.2. שים את זה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי ולהתבונן צמיחת תאים ואת כדאיות.
- הנח את MOC המוכתם בחזרה בחממה להמשיך טיפוח. להסיר את הכתם דולף החוצה מהתאים עם כל החלפת מדיה הבאה.
8. אחזר שווי רקמות מMOC ובצע ניתוח נקודת סיום
- אחזר שווה רקמה מMOC בסוף הניסוי לנקודת סיום הניתוח.
- כדי לאחזר את דואר הכבד ועורquivalents מMOC, להסיר את המדיה מכל תא בתרבית רקמה, כמתואר בצעדים 6.1.1 ל6.1.4.
- הסר את התרבות מוסיף תא 96-המכיל גם את העור מMOC באמצעות מלקחיים. לקלף את הקרום בזהירות מלהכניס את הידות תופסים אותו בצד אחד עם מלקחיים ומושכים אותו כלפי מטה. יש להיזהר שלא לאבד את המקבילה העור בשלב זה.
- להקפיא את הקרום מחזיק את המקבילה העור במתחם ההטבעה-cryo ולאחסן אותו ב -80 ° C עד לניתוח נוסף.
- הסר את הכבד שווה באופן דומה מתא תרבית הרקמה על ידי pipetting אותם באמצעות טיפים פיפטה לחתוך (ראה שלב 1.1.8 / 9).
- להטביע את spheroids הכבד במתחם ההטבעה-cryo. יש להיזהר שלא להעביר יותר מדי נוזלים ולהסיר כל נוזלים עודפים עם טפטפת. לאחר שהניח את spheroids על מתחם ההטבעה והסרת הבינוני, מוסיף מתחם cryo נוסף על החלק העליון של spheroids לצרף אותם באופן מלא.
- להקפיא שווה הכבד ולאחסן אותו ב -80 ° C עד לניתוח נוסף.
- לבצע ניתוח של נקודות קצה על ידי חיתוך הרקמה שווה בcryo-microtome 8 מיקרומטר סעיפים וצביעה עבור סמני רקמות ספציפיות, כפי שתואר בפרוטוקולים קודמים 10.
Representative Results
סטנדרטי במבחנה תרביות רקמה מבוצעות בתנאים סטטיים, המגבילות את הדיפוזיה של החמצן וחומרים מזינים לרקמות האספקה. מערכות fluidic, מראים מאפייני היצע השתפרו, לעתים קרובות הקשו על ידי הדרישות בינוניות הגדולות שלהם, שיש שאינו מבחינה פיזיולוגית גבוהות בינוני ליחסי רקמה. לפיכך, המטבוליטים מדוללים ותאים אינם מסוגלים להתנות את סביבתם. MOC הוצג במחקר זה מחבר את שני תאים בתרבית רקמה נפרדים, כל אחת בגודל של באר אחד של צלחת 96-היטב סטנדרטית, על ידי מערכת ערוץ microfluidic. בקנה מידה הקטנה של המערכת והאינטגרציה של המשאבה על השבב מאפשר למערכת לפעול בהיקפי תקשורת של רק 200 ל -800 μl. זה מתאים למדיום מערכתי כולל ליחס רקמה של 8: 1 עד 31: 1, בהתאמה, לcocultures רקמת כבד ועור (יש בסך הכל נפח רקמה של כ 26 μl). חוץ-תאי הכוללת כמות הנוזלים באדם במשקל 73 קילוגרם הוא 14.6 L, על מה נפח נוזל intercapillary הוא 5.1 L, שמוביל לנוזל החוץ תאי פיסיולוגי ליחס רקמה של 1: 4. לפיכך, הסכום של תקשורת בכל מערכת הדם בMOC עדיין גדול יותר בהשוואה למצב הפיזיולוגי; ובכל זאת, הוא מייצג את התקשורת הקטנה ביותר ליחס רקמה דיווחה עד כה למערכות רב-איבר 5. כפורמטי תרבית רקמת תקן תעשייה נשמרים, חוקרים יכולים לשלב מודלים רקמת סטטי קיימים וכבר תוקף בתוך זרימת נוזל נפוצה. איור 1 מציג את סכמטי של ניסוי הגדרה של cocultures רקמה אחת MOC או רב-רקמה האפשרית. ביופסיות רקמות ראשוניות ובמבחנת -generated יכול להיות מתורבתות שווה רקמה משורות תאים או תאים ראשוניים או באמצעות תרבות מוסיף תא 96-היטב או על ידי הצבת אותם ישירות לתוך התאים בתרבית הרקמה. כמערכת הערוץ המקשרת תאי תרבית תאים היא רק 100 μמ ', שווה רקמה עולה על ממדים אלה יישמרו בתוך תאי התרבות. Endothelialization של מעגל MOC עם HDMECs העיקרי מאפשר צעד נוסף קדימה לכיוון תנאי תרבות פיסיולוגיים יותר על ידי מתן מבנה כלי דם ביולוגי.
איור 1:. ייצוג סכמטי של תרבויות MOC שווי רקמות מוכנות תחת במבחנה תנאים סטנדרטיים, מחוסן לתוך MOC וטיפח כתרבויות או cocultures יחידים בתנאים דינמיים. דגימות תקשורת יומית וניתוחי נקודת סיום מבוצעים. לחץ האוויר לנהוג המשאבה מיושם באמצעות שלושה הצינורות הכחולים מחוברים לMOC מלמעלה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
בעקבות פרוטוקול endothelialization, כיסוי HDMEC מחוברות של מעגל ערוץ microfluidic מתקבל בתוך ארבעה ימים של תרבות הדינמית, כפי שמוצג באיור 2. תאים בקלות לדבוק בקירות של ערוץ MOC, ליצור monolayer ומחוברות, ולהאריך לאורך הגזירה מתח (איור 2). יתר על כן, תאים לכסות את כל ההיקף של הערוצים, כפי שדווחו בעבר 9. לא חל שינוי נוסף במורפולוגיה אנדותל נצפה לאחר ארבעה ימים של טיפוח עד סוף התרבות.
איור 2:. ערוצי MOC Endothelialized תאי כלי דם עורי אדם אנדותל (HDMEC) יצרו monolayer ומחוברות במעגל microfluidic. תאים הוכתמו LDL acetylated לאחר 23 ימים של תרבות MOC. כל מ '()מעגל icrovascular היה מכוסה בתאים ותאים (B) מוארכים לאורך מאמץ הגזירה. ברים בקנה מידה: (א) 1,000 מיקרומטר ו( B) 100 מיקרומטר.
בניסוי נוסף, spheroids תא העקבי בצורת דיסק כבד נוצרים מHepaRG וHHSteC במהלך שני ימים של תרבות ירידה תלויה, כמערכת מודל זה דווחה בעבר כמתאים לחילוף חומרי סמים לומד 11-13. למטרות הדגמה, תא תרבית רקמה אחת של כל מעגל MOC נזרע עם 20 spheroids בתרבות מוסיף תא 96-היטב ורקמות עובדו מעל 14 ימים בתנאים דינמיים באמצעות MOCs-endothelialized שאינו. כל מספר של אגרגטים או כמות החומר עיקרי יכול להיות משולב באופן ישיר לתאים או באמצעות מוסיף תרבית תאים. מכתים Immunofluorescent של spheroids לאחר שליפה מMOC תערוכות ביטוי חזק, אחיד לlicytokeratin ver-הטיפוסי 8/18 ושלב אני חילוף חומרים אנזימי ציטוכרום P450 3A4 ו7A1 (איור 3 א ו3B). מכתים חלבון התנגדות רב-סמים טרנספורטר canalicular 2 של (MRP-2) חשף הפנוטיפ מקוטב ואת קיומה של רשתות כמו canaliculi-מרה בסיסית (איור 3 ג).
איור 3 :. טיפוח של מיקרו-רקמות כבד מלאכותי אנושיות במצרפי MOC. הכבד טיפחו במשך 14 ימים בMOC היו מוכתם עבור cytokeratin () 8/18 (אדום) ו- (B) 3A4 ציטוכרום P450 (אדום) ו7A1 (ירוק). ביטוי (C) של canalicular טרנספורטר MRP-2 (ירוק), מכתים גרעיני כחול. ברים בקנה מידה: 100 מיקרומטר.
כייצור של אלבומין הוא תנאי הכרחי אחד מתרביות רקמת כבד, יש לה דבורהn נבחר כדי לעקוב אחר פעילות כבד-טיפוסית במשרד התקשורת. ניתוח דגימות תקשורת יומיות לייצור אלבומין מצביע על עלייה משמעותית בקצב ייצור בתרבויות MOC בהשוואה לתרבויות סטטי (איור 4) ולערכים שדווחו בספרות 11. העלייה בשיעור סינתזת אלבומין אפשר אולי לייחס את אספקת החמצן וחומרים מזין גדלה בתרבויות MOC. לפיכך, MOC הוא מסוגל לקיים מצרפי כבד על פני תקופה של 14 יום תרבות במדינת מטבולית פעילה, שיפור כבד-טיפוסי התנהגות, כגון ייצור אלבומין.
איור 4: ביצועי אליפטית כבד ארבע עשרה יום בMOC ייצור אלבומין של תרביות רקמה יחידה בכבד ובמשרד התקשורת בתרבות סטטי.. הנתונים הם ממוצעי ± SEM (n = 4).
לבדיקת רעילות במינון חוזרת ונשנית של Subsystemic cheMICALS וקוסמטיקה בבעלי חיים דורש 21 עד 28 ימים מיום החשיפה, כהגדרתו בהנחית OECD לא. 410 "חוזרים ונשנים מנה Dermal רעילות: מחקר 21/28 יום." Cocultures עור הכבד לטווח הארוך הם שהודגם כאן לתקופה של עד 28 ימים להתמודדות עם דרישות רגולטוריות. ממשק אוויר נוזלי מסופק לחשיפת חומר עורי מאוחר יותר על ידי טיפוח ביופסיות עור בתרבות מוסיף תא 96-היטב. ניסוי coculture מתבצע exemplarily בMOCs endothelialized להוכיח אם coculture שלוש-רקמה במעגל תקשורת משולבת יכולה להיות כל הזמן קיימא ומטבולית פעיל מעל 28 ימים.
ניתוח של פעילות LDH בsupernatants תקשורת חשף רמה בהתמדה פוחתת והולכת במהלך שמונת הימים הראשונים של תרבות, שנשארו קבוע בכ -80 U / l לאחר מכן (איור 5). זה מצביע על תחלופת רקמה מלאכותית אך יציבה במערכת בנקודות זמן מאוחר יותר. השוואת coculture שלוש-הרקמה ליחיד כבדניסויי coculture -tissue וכבד-אנדותל, ניתן היו למצוא ברמת LDH באופן משמעותי ירד, בעיקר בימים הראשונים בתרבויות לא כוללים העור. מוות של תאים בתוך תקופה הראשונה זו של פעילות LDH הגבוהה התרחש בעיקר בתא תרבות עור, כמו תרבויות MOC רקמה אחת עור נחשפו (מידע לא מוצג). זה יכול להיות בגלל האזור הפצוע המקיף את הביופסיה כתוצאה מהחבטות של העור.
איור 5: ביצועי רקמה חמש עשרה יום בפעילות LDH MOC בsupernatants התקשורת של תרביות רקמת הכבד בודדת (MOC Li), תרבויות כבד בMOCs endothelialized (MOC Li-Va) וcocultures העור כבד בMOC endothelialized (MOC לי. -Va-Sk). הנתונים הם ממוצעי ± SEM (n = 4).
במהלך תקופת תרבות 28 היום, spheroids הכבד דבק בתחתית MOCתאי nd צמחו מתוך, ויצר קשר רב-שכבתי בין spheroids הסמוך. זה לא יפגע בתפקוד רקמות. Endpoint ניתוח על ידי immunofluorescence הראה כי spheroids הכבד היה עדיין מטבולית פעיל לאחר 28 ימים של coculture MOC, כפי שמוצגים על ידי ציטוכרום P450 3A4 צביעה (איור 6 א). HHSteC חולקו לאורך כל המקבילה הכבד, כפי שמוצג על ידי צביעת vimentin (איור 6). עלייה בעוצמת כתמי vimentin יכולה להיבחן באזורים שבם תאים שצמחו מתוך spheroids. מכתים לגורם פון Willebrand (vWF) הראה כי תאי האנדותל לא חדר עמוק לתוך הרקמה, אבל היו במגע תאי תאים ישיר עם hepatocytes החיצוני (איור 6 ג).
צביעת אימונוהיסטוכימיה של ביופסיות העור הראתה ביטוי של C tenascin וקולגן IV בקרום הבסיסי (איור 6 ד), תוך הכתמה של שליטת סטטי הראתה elevatרמות ed של C tenascin (איור 6-ה). Tenascin C הוכח להיות שהוגבר בריפוי פצעים, תהליכים דלקתיים וסיסטיק, המצביע על תהליכים הנגרם fibrotic בסטטי, אבל לא בתרבויות דינמיות 14,15.
כדאיות תא יציבים ופונקציונליות של רקמות לאחר coculture 28 יום בMOC להוכיח כי המערכת אינו מסוגלת לשמור על שילוב של עד שלוש רקמות במעגל תקשורת נפוצה. תאים ראשוניים, כמו גם מודלים וביופסיות רקמות, יכולים להיות מעובד בו זמנית במערכת MOC.
איור 6:. ביצועים של תרבויות רבת-רקמה מעל 28 ימים שווי כבד וביופסיות עור עובדו בפונקציונליות MOC ותא endothelialized הוצג על ידי immunostaining של שלב (א) אני אנזימי ציטוכרום P4503A4 (אדום), vimentin (אדום) (ב), cytokeratin (C) 8/18 (אדום) וvWF (ירוק) ברקמת כבד. ביופסיות עור cocultivated במשך 28 ימים (ד ') במשרד התקשורת או (E) בתנאים סטטיים היו מוכתמות עבור ג tenascin (אדום) וקולגן IV (ירוק), מכתים גרעיני כחול. מכתים (F) H & E של העור לאחר 28 ימים של תרבות MOC. ברים בקנה מידה: 100 מיקרומטר.
Discussion
פלטפורמת MOC המתוארת כאן מייצגת כלי יציב וחזק לטיפוח רקמות של מקורות שונים בתנאי זרימה בינוניים דינמיים על פני תקופות ממושכות תרבות 10,16. בדוגמא זו, הפלטפורמה שימשה לטפח תאים ראשוניים (HDMEC), שווה רקמה שנוצרו משורת תאים (מצרפי כבד), וcoculture של האמור עם ביופסית רקמה. MOC היה מסוגל לקיים את coculture שלוש-הרקמה עד 28 ימים במעגל בינוני משולב. למיטב ידיעתם של המחברים, זו הפעם הראשונה coculture רב-רקמה כולל ביופסיות, תאים ראשוניים ושורות תאים שבוצעה במשך ארבעה שבועות.
אחד החסרונות העיקריים של מערכות מייקרו-נוזליות הוא הזיקה של מולקולות קטנות לדבוק בחומר של המעגלים נוזליים על פני השטח. כמו פני השטח יחס נפח גבוה במיוחד במערכות microfluidic, אפקט זה הופך להיות אפילו יותר בולט 17 במבחנה של רקמות -generated הוא מבטיח ומנחה את הדרך למחקרים נוספים 18,19.
זה ידוע שhepatocytes נוטה לאבד תפקודים הכבד הספציפית שלהם לאורך זמן בתנאי תרבות דו-ממדי סטטי במבחנה 20. אנזימי חילוף חומרים, כגון משפחת ציטוכרום P450, הם בעלי חשיבות מיוחדת אם חילוף החומרים של תרופה מסוימת הוא להיחקר. ציטוכרום P450 3A4, אנזים הקשורים לbiotransformation של xenobiotics רב, ו7A ציטוכרום P450, which מעורב בסינתזה של חומצות מרה, באו לידי ביטוי בכבד אגרגטים בתרבית MOC מעל 14 ימים. זה מצביע על השימור של פנוטיפ מטבולית פעיל, המאפשר ללימודי חילוף חומרים סמים. העלייה בשיעור אלבומין הייצור של אגרגטים בMOC בהשוואה לתרבויות סטטי הוא אינדיקציה נוספת לתנאי תרבות נאותים. שיעורי ייצור אלבומין נצפו במהלך מחקר זה היו דומים או אף גבוהים יותר מערכים שדווחו בעבר שהושגו על ידי שבבי microfluidic כוללים תאי HepG2 21 - 23, לעומת זאת, ערכים לא הגיעו אלה של תרבויות hepatocyte אנושיות ראשוניות 24. יתר על כן, מערכת MOC, בפריסה הזמנית שלה, אינה מאפשרת הפרדה נפרדת של מרה. תאים במבנים כמו canaliculi מצטברים מקוטבים ויצרו מרה, כפי שמוצג על ידי MRP-2 מכתים. עם זאת, אפיקים, נקבות אלה לא היו מחוברים לערוץ טכני איסוף המרה. תערובת שאינה פיזיולוגית זהing של המרה עם תא הדם יש לטפל בתכנון מחדש עתידי של המערכת.
ההתאמה של מאפייני זרימה היא בעל חשיבות גבוהה 25, במיוחד בכל הנוגע לרקמות רגישות למאמץ גזירה, כגון הכבד. הסכום של מאמץ גזירה נתפס על ידי הרקמה יכול להיות שונה בשתי דרכים: ראשית, ניתן להוריד את לחץ האוויר בשימוש כדי לדחוף את הקרומים של המשאבה, ירידת ערכי לחץ גזירת שיא במערכת. שנית, יכולות להיות מוטבעות ברקמות שכבות מטריצה תאית או מתורבת בתרבות מוסיף transwell. האחרונים להגן על הרקמות מנוכחיות הבסיסי עם קרום נקבובי. התאמות אלו צריכים להתבצע על בסיס אישי לכל איבר מקביל לפני תחילת ניסוי MOC. במבצע pulsatile של 2.4 הרץ, למשל, אשר תואם את פעילות של 144 פעימות גבוהה, אבל עדיין פיזיולוגית, לב / min בבני אדם, מאמץ הגזירה נמדד בערוצים של מעגל כלי הדם מגיעים לכ 25 DYN / 2 סנטימטר. זה מתאים למאמץ גזירה פיסיולוגי בקצה הגבוה של הסקאלה בנימי דם, והוא, לכן, גם ישים עבור ניסויים כוללים endothelialization של הערוצים. עם זאת, כפי שפריסת microfluidic הנוכחית של מערכת MOC הציגה מורכבת רק אחד במעגל תקשורת מחבר בין שני תאי האיבר, שיעור לחץ מהירות שאיבה וגזירה אחד לא להיבחר למערכת כולה. לכן, התאמה של מאפייני זרימה לצרכיו של כל איבר יחיד מדויקת היא לא תמיד אפשרית.
יתר על כן, טיפול שיש לנקוט בהתאמת התאים למדיום הנפוץ. תאים מעובדים בMOC במעגל תקשורת משולב, ולכן, אין תקשורת ותרבות תא בודדת יכולה לשמש לכל דגם רקמה, כהיא סטנדרטי עבור תרבות תאים במבחנה. ניסוח מדיה משולב מינימאלי צריך להיות מוגדר מראש ולאהוא תאים צריכים להיות מותאמים בשלבים לתקשורת חדשה זה. תהליך ניכוי של 80% / 20% ישנים למדיה החדשים במשך יומיים, ולאחר מכן 50% / 50% ואחריו 20% / 80%, ותמורה מלאה תמיד הובילו לכדאיות סבירה תא ופונקציונליות של תרבויות בידיים שלנו.
פריסת microfluidic הנוכחית של מערכת MOC מאפשרת coculture של עד שלוש רקמות. יש צורך coculture של לפחות עשרה איברים החשובים ביותר בגוף האדם כדי להגיע להומאוסטזיס. לכן, המערכת שהוצגה היא מסוגלת לחזות אינטראקציות ספציפיות רקמות-רקמה, אך לא התגובה המערכתית האמיתית לחומר. פיתוח נוסף של משרד התקשורת לכוללים יותר חללי איבר שחזה. יתר על כן, את תוקפו של המערכת הוא להיות מוצג באמצעות סדרה של תרכובות התייחסות. רצוי, תרכובות שנכשלו בניסויים קליניים (כגון Troglitazone) הן להיבדק לביצועים שלהם במשרד התקשורת. ואילו, אימות נכונה של מערכות מורכבות כגון עדיין פגעה בy חוסר סטנדרטיזציה לגבי סמנים ביולוגיים ונקודתי קצה להערכה תפקודית, איסוף נתונים נוספים על הביצועים טוקסיקולוגית של מערכות זה ודומה ירחיב האמינות והאזור של יישום שלהם.
Disclosures
Uwe מרקס הוא מנכ"ל TissUse GmbH המייצר ומשווקת פלטפורמת השבבים Multi-איברים המשמשת במאמר. פרסום זה מומן על ידי הפרס הוענק על ידי קורנינג Inc.
Acknowledgments
העבודה כבר במימון המשרד הפדרלי הגרמני לחינוך ומחקר, GO-יו גרנט מס '0,315,569.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HepaRG cells | Biopredic International | undifferentiated cells | |
| HHSteC | ScienCell Research Laboratories | cells and all culture supplements | |
| HepaRG Medium | Sigma-Aldrich | William's Medium E 10% FCS 100 U/ml penicillin 100 µg/ml streptomycin 5 µg/ml human insulin 2 mM L-glutamine 5 x 10-5 M hydrocortisone hemisuccinate |
|
| HDMEC Medium | PromoCell | Endothelial Cell Growth Medium MV2 with Supplement-Pack MV2 and 1% penicillin-streptomycin | |
| Dimethyl sulfoxide | Carl Roth | add 2% to HepaRG media | |
| Trypsin/EDTA | Biowest | ||
| Trypsininhibitor | Carl Roth | ||
| MAXYMum Recovery Tips | Corning | 1,000 µl Pipet Tips Wide Bore | |
| 384-Well Hanging Drop Plate | 3D Biomatrix | Perfecta 3D 384-Well Hanging Drop Plate | |
| Tissue culture flasks | Corning | 75 cm2 | |
| Ultra-low attachment plate | Corning | 24-well | |
| Transwell cell culture inserts | Corning | 96-well unit, 0.4 µm pore size | |
| Deep well plates | Corning | 96-well, 1 ml | |
| Biopsy punch | Stusche | 4.5 mm | |
| Glass microscope slide | Menzel | footprint of 75 x 25 mm | |
| Polydimethylsiloxane | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Silicon rubber additive | Wacker Chemie | Wacker Primer G790 | |
| Tubes for air pressure | SMC Pneumatik GmbH | Polyurethan-Schlauch, metrisch | |
| Alumin ELISA | Bethyl Laboratories | Human Albumin ELISA Quantitation Set | |
| Lactate dehydrogenase assay | Stanbio Laboratory | LDH Liqui-UV kit | |
| Alexa Fluor 594 acetylated LDL | Invitrogen | 1 mg/ml |
References
- Kelm, J. M., Fussenegger, M. Microscale tissue engineering using gravity-enforced cell assembly. Trends in biotechnology. 22 (4), 195-202 (2004).
- Marx, U., Walles, H., et al. Human-on-a-chip Developments: A Translational Cutting-edge Alternative to Systemic Safety Assessment and Efficiency Evaluation of Substances in Laboratory Animals and Man. ATLA. 40 (5), 235-257 (2012).
- Baudoin, R., Griscom, L., Prot, J. M., Legallais, C., Leclerc, E. Behavior of HepG2/C3A cell cultures in a microfluidic bioreactor. Biochemical Engineering Journal. 53 (2), 172-181 (2011).
- Dash, A., Inman, W., et al. Liver tissue engineering in the evaluation of drug safety. Expert opinion on drug metabolism & toxicology. 5 (10), 1159-1174 (2009).
- Materne, E. -M., Tonevitsky, A. G., Marx, U. Chip-based liver equivalents for toxicity testing--organotypicalness versus cost-efficient high throughput. Lab on a chip. 13 (18), 3481-3495 (2013).
- Huh, D., Torisawa, Y., Hamilton, G. a, Kim, H. J., Ingber, D. E.
- Sin, A., Chin, K. C., Jamil, M. F., Kostov, Y., Rao, G., Shuler, M. L. The design and fabrication of three-chamber microscale cell culture analog devices with integrated dissolved oxygen sensors. Biotechnology progress. 20 (1), 338-345 (2004).
- Tatosian, D. a, Shuler, M. L. A novel system for evaluation of drug mixtures for potential efficacy in treating multidrug resistant cancers. Biotechnology and bioengineering. 103 (1), 187-198 (2009).
- Schimek, K., Busek, M., et al. Integrating biological vasculature into a multi-organ-chip microsystem. Lab on a chip. 13 (18), 3588-3598 (2013).
- Wagner, I., Materne, E. -M., et al. A dynamic multi-organ-chip for long-term cultivation and substance testing proven by 3D human liver and skin tissue co-culture. Lab on a chip. 13 (18), 3538-3547 (2013).
- Vieira, U., et al. HepaRG human hepatic cell line utility as a surrogate for primary human hepatocytes in drug metabolism assessment in vitro. Journal of pharmacological and toxicological methods. 63 (1), 59-68 (2010).
- Abu-Absi, S. F., Hansen, L. K., Hu, W. -S. Three-dimensional co-culture of hepatocytes and stellate cells. Cytotechnology. 45 (3), 125-140 (2004).
- Leite, S. B., Wilk-Zasadna, I., et al. Three-dimensional HepaRG model as an attractive tool for toxicity testing. Toxicological sciences. 130 (1), 106-116 (2012).
- Chiquet-Ehrismann, R.
- Sidgwick, G. P., Bayat, A. Extracellular matrix molecules implicated in hypertrophic and keloid scarring. Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology JEADV. 26 (2), 141-152 (2012).
- Ataç, B., Wagner, I., et al. Skin and hair on-a-chip: in vitro skin models versus ex vivo tissue maintenance with dynamic perfusion. Lab on a chip. 13 (18), 3555-3561 (2013).
- Wu, M. -H., Huang, S., Lee, G. -B. Microfluidic cell culture systems for drug research. Lab on a chip. 10 (8), 939-956 (2010).
- Schanz, J., Pusch, J., Hansmann, J., Walles, H. Vascularised human tissue models A new approach for the refinement of biomedical research. Journal of Biotechnology. 148 (1), 56-63 (2010).
- Holnthoner, W., Hohenegger, K., et al. Adipose-derived stem cells induce vascular tube formation of outgrowth endothelial cells in a fibrin matrix. J Tissue Eng Regen Med. , (2012).
- Dunn, J. C. Y., Yarmush, M. L., Koebe, H. G., Tompkins, R. G. Hepatocyte function and extracellular matrix geometry: long-term culture in a sandwich configuration. FASEB Journal. 3, 174-177 (1989).
- Leclerc, E., Sakai, Y., Fujii, T. Microfluidic PDMS (polydimethylsiloxane) bioreactor for large-scale culture of hepatocytes. Biotechnology progress. 20 (3), 750-755 (2004).
- Kim, M. S., Yeon, J. H., Park, J. -K. A microfluidic platform for 3-dimensional cell culture and cell-based assays. Biomedical microdevices. 9 (1), 25-34 (2007).
- Prot, J. -M., Aninat, C., et al. Improvement of HepG2/C3A Cell Functions in a Microfluidic Biochip. Biotechnology and bioengineering. 108 (7), 1704-1715 (2011).
- Riccalton-Banks, L., Liew, C., Bhandari, R., Fry, J., Shakesheff, K. Long-term culture of functional liver tissue: three-dimensional coculture of primary hepatocytes and stellate cells. Tissue engineering. 9 (3), 401-410 (2003).
- Powers, M. J., Domansky, K., et al. A Microfabricated Array Bioreactor for Perfused 3D Liver Culture. Biotechnology and Bioengineering. 78 (3), 257-269 (2002).
