Abstract
分子和电信号的复杂的集成是需要变换静止子宫成收缩的器官在怀孕的末端。尽管子宫收缩的关键调节剂的发现，这个过程还没有完全理解。转基因小鼠提供在学习分娩的理想模型。以前，以研究子宫收缩在小鼠的唯一方法是离体等长张力的录音，这是不理想的有几个原因。子宫必须从它的生理环境被除去，调查在有限的时间当然是可能的，并且小鼠必须牺牲。辐射遥测的最新发展已经允许纵向，实时体内小鼠宫腔压力的测量。在这里，宫内遥测植入到分娩的描述来测量从妊娠中期的小鼠子宫压力变化。在记者的差异比较野生型和转基因小鼠之间URES，感兴趣的基因的生理影响可以阐明。该技术应加快用于妊娠期间治疗子宫肌层病症的治疗剂，包括早产的发展。
Introduction
早产是围产儿发病率和死亡率在发达国家的主要原因;它负责50％围产期发病率及围产儿死亡率1,2 75％。早产是多方面的，可能是特发性。虽然许多研究已经出现在分子和电通路将来自一个静止组织肌层成收缩1，早产的确切病理生理学仍然难以捉摸。内分泌，炎性和基因调控都被链接到早产3,4。然而，伦理问题限制于早产在人体中的机制进行研究的能力。
鉴于这些限制，许多研究人员已经转向小鼠作为模型系统来研究分娩的生理学。小鼠具有短怀孕持续约3个星期，并且可以很容易地遗传操作。此外，多个基因小鼠模型被开发，以确定信号通路，这对于劳动5是必不可少的。尽管小鼠和人类分娩之间的关键差异，小鼠和人类有许多是必不可少的劳动相同的机制，包括宫内炎症和感染6。因此，老鼠作为一个宝贵的工具用于检查子宫活动。迄今为止，金标准测定小鼠子宫收缩已经离体等长张力的录音;然而，这被限制在每个实验1妊娠时间点，并且需要切除子宫从它的生理环境。另一个重要因素是需要大量的对这些研究的动物。最后，这种方法不允许进行纵向研究审查引产和早产病理生理学。
在用于研究动脉压辐射遥测设备取得的最新进展在老鼠和INT改变7大鼠8 rauterine压力乞求问题相同的技术是否可以用于怀孕期间，研究改变小鼠子宫内的压力。最初的故障排除后，已成功开发出一种方法来衡量引产和进展的鼠标。这种体内方法可以测量从静态子宫指示有力宫缩的高压状态的低压力状态的过渡。这种方法也已经能够检测到与受损分娩和野生型小鼠的转基因小鼠之间显著压力差，表明基因表达的9的生理影响。这个协议提供了一个实时的， 在体内方法来研究怀孕期间小鼠子宫的压力。
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Protocol
注：符合动物提出了美国国立卫生研究院的维护和使用指南所有动物的程序。所有协议批准了动物研究委员会在圣路易斯华盛顿大学。
注：特殊材料和设备来获得本协议所列材料和设备表。
雌性大鼠1.定时育种
- 品种两岁六个月的成年女性与男性有2小时的时间窗口。特定育种小时是不需要的，只要它们保持在实验的全部相一致。
- 通过交配插头的存在证实怀孕。指定的日期和人力资源上的插头第一看作是一天后性交0（dpc0）。启动压力录制时，记得具体的时间。
- 在dpc8-13进行手术。确切的DPC将取决于小鼠品系。
- 如果要判断一只老鼠怀孕手术前，PE与连接到成像系统管理麻醉前一个40 MHz的线阵探头腹部rform超声成像。这将允许妊娠囊的可视化。如果一个超声系统不可用，使用鼠标的重量。
注：dpc0和dpc8和腹胀之间至少有2克体重增加是怀孕的良好指标。
2.遥测手术准备
- 使用高压锅术前24小时内消毒器械，纱布，棉签，手术单，和枪头。
- 清洁手术表面用70％的乙醇。
- 打开加热垫（专门为啮齿动物）和珠灭菌。
3.遥测手术
- 麻醉，用4-5％异氟烷以1-2升/分钟的氧流量。
- 等到鼠标显示麻醉的迹象，然后注入皮下丁丙诺啡（镇痛：每20克0.1毫升）。
- 剃鼠标从肋的底部的腹部向下至膀胱。
- 把鼠标上的预温加热垫的手术台，并覆盖鼠标的眼睛眼药膏，以防止干燥。
- 开始无菌技术。戴上无菌手套，并保持包装的无菌表面上要放置碘和酒精擦洗。
- 从包中取出或盐水的遥测并用无菌镊子将其放置在无菌纱布。
- 使用注射器（由遥测供应商提供的）来填充导管尖端与凝胶。轻轻挤压导管创造足够的负压吸引凝胶进入导管。
- 广场上的吸管无菌尖端。吸管2微升的手术胶水，并设置吸管上的无菌表面。
- 清洁外科手术部位，用碘，然后用70％乙醇擦拭的面积。
- 切手术悬垂足够大的一个洞对于所需的切口和地点在鼠标区域。
- 执行脚捏（踏板响应），以确保该鼠标正在一个切口之前完全麻醉。
- 做一个小的垂直正中切口。接下来，通过底层体壁的肌肉类似的切口。
- 轻轻一拉出来子宫体腔，找到包含最幼崽是可行子宫角。
- 可选 - 对于另外的miRNA，插入遥测前注入病毒载体进入子宫肌层。
- 做一个小切口，在子宫角尖为3 mm的尖端弹簧剪刀。
- 螺纹导管，而不挤压，子宫壁和胎儿囊之间。插入导管过去几囊，以减少其意外脱落。确保胎囊不会被插入的干扰。
- 吸取所述手术胶水以遥测插入部位附着的导管与uterine喇叭和防止导管滑出子宫角。等待几秒钟，胶水变得僵硬，然后小心地将子宫后面的体腔内。
- 放置在体腔内的遥测在导管插入部位的相反侧。
- 缝合体腔与6.0可吸收缝合线封闭。首先，做一个荷包缝合，然后三到四个单独的针。
- 缝合皮肤通过使用相同的技术，但是用6-0非可吸收的缝线。
- 棉签丁卡因（外用止痛药）软膏在切口部位。
- 注射0.3-0.4毫升无菌生理盐水皮下，以帮助补充水分的动物。
- 监测手术后的动物，直到它完全清醒。不要将鼠标背部在笼子里，直到它能够自由地保持其头部上面的表格为某些类型的床上用品可以窒息重度麻醉鼠标。对于鼠标已经麻醉30-45分钟，不要指望日Ë鼠标是由1小时和15分钟完全清醒。
- 如果进行额外的手术，请用70％的乙醇和珠再次使用前消毒器械。
4，手术后恢复
- 监控日志的日常手术后的进展。目录体重增加和损失，并注意有无嗜睡，出血，或手术切口闭合不全。
- 喂老鼠软化小鼠食物（〜苹果酱的一致性）或专门回收的减肥食品。
- 检查缝线，并确保他们不拉出，但尽量不要处理鼠标过分。
5.遥测记录
- 感兴趣的日子（两到三天后，至少在鼠标已经从手术恢复），放置一个磁铁靠近鼠标打开遥测。把鼠标笼上的接收器。接收器上的光应打开，如果遥测被激活。
- 校准全新teleme TER值与制造商特定的校准提供。重复使用遥测校准规范将被保存在软件。
- 在软件，开始记录右击“动物”，然后点击“开始采样，持续，”这使得采样在高达500 Hz的速率。确保软件设置保存和跟踪。
注：当采样鼠标图标变成绿色，压力被记录。在分娩过程中干扰鼠标可以中断或改变劳动，所以观察谨慎。 - 经过利益输送或时间段，停止录制右击“动物”，然后选择“停止录音，所有”。用磁铁关闭遥测，以节省电池寿命，因为遥测电池通常只持续1.5个月的连续记录。
- 安乐死鼠标的CO 2过量和恢复的遥测。幼崽被斩首处死。
- 将遥测中的1％的酶洗涤剂在去离子水中过夜，在室温下的溶液中。
- 用去离子水冲洗的遥测，并删除所有组织和胶水，小心不要挤导管。
- 孵育在2％戊二醛的遥测为24小时，在室温下进行消毒。
- 冲洗用无菌生理盐水的遥测，并存储在无菌盐水中，直到下一次注入或将被发送回给制造商进行翻新。如果组织位于导管内灭菌后遥测应该翻新。通常情况下遥测可以无需翻新之前使用4-5次。
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Representative Results
实时体内宫内压力可通过使用遥测采集系统进行记录。搭配鼠标同步录像压取样来捕捉每个小狗的传递的准确时间和相关交货时间，母亲的子宫内的压力。所有的数据点就可以在整个记录作图以产生压力-时间曲线图（ 图1A）。在妊娠期间这个图显示的各点时，宫内压力变化以及暗光周期之间的压力差。此外，宫内压力的移动平均可以绘制（ 图1B）。这（分娩过程中获得的录音此前已公布的9）是有用的更容易显现持续增长与劳动过程有关的收缩宫腔压力的特点。
数据可以通过导出的数据点，以分析软件和平均在感兴趣的时间段的数据进行进一步的分析。当比较不同的实验条件下，如野生型对转基因小鼠，每日或来自不同的小鼠每小时压力可被平均以检查依赖性感兴趣的基因上的收缩型态。另外，对任何差异的统计显着性可被确定。宫内压力能够输送期间进行检查，或一个纵向研究可以进行，以检查不同的条件下，在整个妊娠期。
宫内遥测可用于在怀孕期间，以测试在体内反应的药理学试剂。具体地，该方法允许早期药物测试之前的临床试验。响应于特定试剂的差异可以在转基因小鼠，以及在非妊娠或妊娠小鼠进行测试。已知增加子宫一个具体的药理剂NE收缩，催产素，可以皮下递送如先前在大鼠模型10进行说明。的遥测可以在同一时间作为一个微型渗透泵提供催产素的稳定速率被植入。在非妊娠（ 图2A）和孕（ 图2B）的小鼠与催产素的施用之间的差异的记录，也可检测。
宫内遥测的另一个潜在应用是看蛋白质的miRNA / shRNA的沉默后，子宫收缩。小鼠模型不适用于那些对分娩必不可少的所有基因。因此，与宫内压力测量相结合的基因沉默，可用于研究目的蛋白质。通过注入的miRNA表达慢病毒载体进入肌层的遥测的植入期间，所关注的基因的子宫特异性击倒可以检查，如在图3A中看到的。最近的一项研究表明一个具体的例子证明了Kir7.1通道在子宫平静了重要的作用同时使用的miRNA及遥测研究改变宫腔内压力在整个妊娠11后。加扰的miRNA（ 图3A）或Kir7.1的miRNA（ 图3B）的代表性的轨迹表明，撞倒该钾通道Kir7.1的表达引起宫腔内压力增加。这些代表的描记是类似于如前所述9什么被认为是在转基因小鼠模型。
图1：代表连续宫内压力录音（A）实时记录在体内持续四天（15-19 DPC）宫腔内压力数据。 （B）移动数据每小时平均（A）。瓦在录音前ITE和黑条指示12小时明暗周期，分别为。 （C）一个放大在小鼠体内各个收缩痕迹。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：在应对催产素宫内压力宫腔压力来自非孕妇（NP）子宫肌层（A）和晚期妊娠（18 DPC）子宫肌层（B）暴露于5单位/催产素天24小时节目的增加代表的描记。在妊娠与NP鼠后期的压力。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：用沉默的miRNA / shRNA的钾通道后，宫腔内压力测量的位置的遥测和注射的miRNA表达慢病毒的网站的（A）示意图。最近的研究表明，从子宫肌层转导（B）宫腔内压力代表描记炒的miRNA或（C）Kir7.1的miRNA。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
子宫肌层收缩的研究一直依靠肌肉紧张体外测量。这种方法可用于新开发的子宫收缩药物不能被施用给活的动物的早期检测是有用的。然而， 在体内的方法是必要的，以纵向理解劳动的进 展。 体内测量一举数得。首先，它们使过怀孕期间变化子宫收缩图案的完整画面的捕获。其次，他们消除体外录音要求子宫组织的偏压被垂直或水平地安装，限制了我们的子宫的圆形和纵向肌肉层的完整作用的理解。第三，它们允许记录在该内源激素环境子宫的压力，从而使得有可能更准确地研究分娩在小鼠模型。最后，他们让更多的TR小鼠模型和人类之间anslational调查子宫遥测更像孕妇宫腔内压力导管进行测量。
该方法小鼠子宫内膜遥测是简单易学，但很难掌握。研究者与以往鼠标的手术经验，可以实现更快的成功，但是这不应该使用这种有价值的技术震慑实验室。使用鼠标子宫遥测原研究是由一个新手试了几次后，大获成功完成，因此实验室应该准备的第一对夫妇的手术造成大坝失去所有的胎儿。这里有几点要牢记。如同任何手术，最短持续时间是最好的动物。一个快速的手术会限制脱水和需要额外剂量的麻醉。如果研究者是有困难的时候，在完成过程之前鼠标醒来，异氟醚，可用于保持鼠标anesthetiz编更长。我们还发现，使用异氟醚的增加存活的幼崽的数目和优于氯胺酮。最小的切口可能的，只是比遥测的身体稍微大一点，会减少伤口后张开的机会，减少需要缝合时间，提高鼠标的恢复。用一个小的腹部切口，提拉子宫体腔外将允许导管插入期间更好的可视性。当在导管的前曲线重用遥测，因子穿线它当走在子宫角。使手术胶水以将子宫角回体腔内将有助于保持导管就位并防止胶水粘在肠之前完全硬化。如果放在太高的遥测体可损害肝，并且鼠标的腹部，能够广泛地扩大，所以不要犹豫，把遥测降低体内。这些方法将必须被定制吨Ø适应不同的实验室和不同的小鼠模型的需求，但子宫遥测的优点远大于障碍。
有实施这种方法时，应考虑的一些限制。之一是要克服的主要挑战是胎儿损失下列发射机植入的程度。在宫内遥测初步报告9，所有的转基因SK3 T / T和野生型小鼠在一个或两个子宫角某种程度的胎儿流产，无论如果喇叭被选定为遥测安置。一天的选择在怀孕期间优化时遥测被插入手术改善了我们的成功率足月妊娠，但从来没有得到幼仔的全补。值得注意的是，手术SK3 T / T小鼠的最佳日子从不同的野生型，具有更好的生殖结果指出，在dpc12-13的SK3 T / T小鼠与dpc8-9的野生型小鼠，sugge以被修改为每个感兴趣的小鼠模型螫该手术协议可能需要。我们的数据表明，幼仔生产经历的数目不与整体宫内压力相关。胎儿结局并改善与提高手术技巧的实验者，和其他人谁也实现了这个方法，在他们的实验室已经指出，胎儿的结果与使用异氟醚，而不是氯胺酮改善。可以预料，随着越来越多的实验室使用这种方法，发射器技术和宫内分析软件将变得更精致。这无疑将推动这一技术的有效性在促进劳动力的机制研究。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Glue | 3M Vetbond | 1469SB | Tissue Adhesive--stored in Drierite |
| Absorbable 6-0 Sutures | Ethicon | J212H | Vicryl |
| Non-absorbable 6-0 Sutures | Ethicon | 8706H | Prolene |
| Water Jacket Blanket + Heating Pad | Gaymer | T/Pump PN 11184-000 Blanket-66N111CC | Specialized for rodents |
| Bead sterilizer | Keller | Z378577 | Steri 250 Sterilizer |
| Disecting Microscope | Nikon | SMZ754 | Fibre optic gooseneck external light source |
| Sterile Surgical Gloves--Latex | Cardinal Health Triflex | 2D7253 | |
| PhysioTel PA-C10 Pressure Transmitter | Data Sciences International | 270-0135-001 | TA11PA-C10 |
| Telemeter Reciever | Data Sciences International | 272-6001-001 | RPC-1 |
| Dataquest ART 4.3.2 Analysis Platinum | Data Sciences International | 271-0147-141 | Analysis software |
| Diet Recovery Gel | Clear H2O | 72-01-5022 | Purified Soft Diet for Rodents |
| Tergazyme | Sigma-Aldrich | Z273287 | Enzyme detergent |
References
- Slattery, M. M., Morrison, J. J. Preterm delivery. Lancet. 360, 1489-1497 (2002).
- Goldenberg, R. L., Culhane, J. F., Iams, J. D., Romero, R. Epidemiology and causes of preterm birth. Lancet. 371, 75-84 (2008).
- Keelan, J. A. Pharmacological inhibition of inflammatory pathways for the prevention of preterm birth. Journal Of Reproductive Immunology. 88, 176-184 (2011).
- Voltolini, C., et al. Understanding spontaneous preterm birth: from underlying mechanisms to predictive and preventive interventions. Reproductive Sciences. 20, 1274-1292 (2013).
- Ratajczak, C. K., Muglia, L. J. Insights into parturition biology from genetically altered mice. Pediatric research. 64, 581-589 (2008).
- Rajakumar, A., et al. Placental HIF-1 alpha, HIF-2 alpha, membrane and soluble VEGF receptor-1 proteins are not increased in normotensive pregnancies complicated by late-onset intrauterine growth restriction. American Journal Of Physiology. Regulatory, Integrative And Comparative Physiology. 293, (2007).
- Whitesall, S. E., Hoff, J. B., Vollmer, A. P., D'Alecy, L. G. Comparison of simultaneous measurement of mouse systolic arterial blood pressure by radiotelemetry and tail-cuff methods. American journal of physiology. Heart And Circulatory Physiology. 286, H2408-H2415 (2004).
- Mackay, L. B., Shi, L. B., Maul, H. ., Maner, W. L., Garfield, R. E. The effect of bilateral pelvic neurectomy on cervical ripening in pregnant rats. Journal Of Perinatal Medicine. 37, 263-269 (2009).
- Pierce, S. L., Kutschke, W., Cabeza, R., England, S. K. In vivo measurement of intrauterine pressure by telemetry: a new approach for studying parturition in mouse models. Physiol Genomics. 42, 310-316 (2010).
- Imamura, T., Luedke, C. E., Vogt, S. K., Muglia, L. J. Oxytocin modulates the onset of murine parturition by competing ovarian and uterine effects. American Journal Of Physiology. Regulatory, Integrative And Comparative Physiology. 279, R1061-R1067 (2000).
- McCloskey, C., et al. The inwardly rectifying K+ channel KIR7.1 controls uterine excitability throughout pregnancy. EMBO Mol Med. 6 (9), 1161-1174 (2014).
