Abstract
Um complexo de integração de sinais moleculares e eléctricos é necessário para transformar um útero quiescente para um órgão contráctil no final da gravidez. Apesar da descoberta de reguladores-chave da contractilidade uterina, este processo ainda não está completamente entendido. Os ratinhos transgénicos proporcionar um modelo ideal para estudar o parto. Anteriormente, o único método para estudar a contractilidade uterina no rato foi ex vivo gravações de tensão isométrica, que são sub-óptima por várias razões. O útero tem de ser removido do seu ambiente fisiológico, um campo de investigação tempo limitado é possível, e os ratinhos deve ser sacrificado. O desenvolvimento recente de telemetria radiométrica permitiu longitudinais, as medições em tempo real da pressão intra-uterina in vivo em ratinhos. Aqui, a implantação de um telêmetro intra-uterina para medir as mudanças de pressão no útero de camundongos a partir de meados de gravidez até o parto é descrito. Ao comparar as diferenças de imprensamentos entre o tipo selvagem e ratinhos transgénicos, o impacto fisiológico de um gene de interesse pode ser elucidado. Esta técnica deve acelerar o desenvolvimento de terapias usadas para tratar distúrbios do miométrio durante a gravidez, incluindo o trabalho de parto prematuro.
Introduction
O nascimento prematuro é a principal causa de morbidade e mortalidade nos países desenvolvidos perinatal; é responsável por 50% de morbidade perinatal e 75% de 1,2 a mortalidade perinatal. Trabalho de parto prematuro é multifacetada e pode ser idiopática. Apesar de muita pesquisa surgiu nas vias moleculares e elétricas transformando o miométrio, de um tecido de repouso em um contrátil um, a fisiopatologia exata do trabalho de parto prematuro permanece indefinida. Endocrine, inflamatório, e regulação de genes têm sido relacionados ao trabalho de parto prematuro 3,4. No entanto, as preocupações éticas limitar a capacidade de realizar pesquisas sobre os mecanismos de trabalho de parto prematuro em seres humanos.
Dadas estas limitações, muitos investigadores voltaram-se para os ratos como um sistema modelo com que no estudo da fisiologia de parto. Os ratos têm gestações curta duração de aproximadamente três semanas e pode ser facilmente manipulado geneticamente. Além disso, vários modelos genéticos do rato temfoi desenvolvido para determinar as vias de sinalização que são essenciais para o trabalho 5. Apesar das diferenças fundamentais entre o mouse eo parto humano, ratos e humanos compartilham muitos dos mesmos mecanismos que são essenciais para o trabalho, incluindo a inflamação intra-uterina e infecção 6. Assim, os ratos servir como uma ferramenta valiosa para examinar a atividade uterina. Até à data, o padrão-ouro para medir a contratilidade uterina em camundongos foi ex vivo gravações de tensão isométrica; no entanto, isto é limitado a um ponto de tempo gestacional por experiência e requer a remoção do útero do seu ambiente fisiológico. Outro factor importante é o elevado número de animais necessários para essas investigações. Por último, esta metodologia não permite estudos longitudinais que examinam a indução do trabalho de parto pré-termo e fisiopatologia.
Os recentes avanços feitos em dispositivos de telemetria radiométricos usados para estudar a pressão arterial muda 7 em ratos e intpressão rauterine em ratos 8 pediu a questão para saber se a mesma tecnologia pode ser utilizada para estudar alterações na pressão intra-uterina em ratinhos durante a gravidez. Depois de solução de problemas inicial, foi desenvolvido um método com sucesso para medir a indução do parto e progressão em um mouse. Esta abordagem in vivo pode medir a transição do estado de baixa pressão do útero quiescente para o estado de alta pressão indicativa de contrações fortes. Este método também foi capaz de detectar diferenças de pressão significativas entre ratinhos transgénicos com parto comprometida e ratinhos do tipo selvagem, demonstrando o impacto fisiológico da expressão dos genes 9. Este protocolo fornece em tempo real, no método in vivo para estudar a pressão rato uterino durante a gravidez.
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Protocol
NOTA: Todos os procedimentos com animais respeitadas as diretrizes para o cuidado e uso de animais estabelecidos pelo National Institutes of Health. Todos os protocolos foram aprovados pelo Comitê da Universidade de Washington em St. Louis a estudos com animais.
NOTA: materiais e equipamentos específicos para este protocolo estão listados Materiais e Equipamentos tabela.
1. Criação de temporizado Feminino Mice
- Raça fêmeas adultas entre dois e seis meses de idade, em uma janela de tempo de 2 horas com os machos. H reprodução específica não são necessários, desde que estes sejam mantidos consistentes para a totalidade da experiência.
- Confirmar gravidez pela presença de um tampão copulatória. Designar o dia e hora em que a ficha é visto pela primeira vez como o dia de pós-coito 0 (dpc0). Lembre-se da hora específica quando iniciar a gravação de pressão.
- Realizar cirurgias em dpc8-13. A exacta dpc dependerá da estirpe de ratinho.
- Para determinar se um rato está grávida antes da cirurgia, peultra-sonografia rform do abdômen com um transdutor linear de 40 MHz acoplado a um sistema de imagem antes de administrar anestesia. Isto irá permitir a visualização dos sacos gestacionais. Se um sistema de ultra-som não está disponível, utilizar o peso do rato.
NOTA: Um ganho de peso de pelo menos 2 g entre dpc0 e dpc8 e distensão do abdome é um bom indicador da gravidez.
2. Telemetry Cirurgia Prep
- Use um autoclave para esterilizar instrumentos, gazes, cotonetes, campos cirúrgicos, e pontas de pipeta dentro de 24 horas antes da cirurgia.
- Superfície cirurgia limpa com etanol 70%.
- Ligue almofada de aquecimento (especializado para roedores) e talão esterilizador.
3. Telemetry Cirurgia
- Para anestesia, utilizar 4-5% de isoflurano com uma taxa de fluxo de oxigénio de 1-2 l / min.
- Aguarde até que o rato mostra sinais de anestesia e depois injetar por via subcutânea com buprenorfina (analgésico: 0,1 ml por 20 g).
- Raspar o abdómen do rato a partir do fundo das nervuras para baixo para a bexiga.
- Traga o mouse para a mesa de cirurgia em almofada de aquecimento pré-aquecido, e cobrir os olhos do rato com pomada oftálmica para evitar a secagem.
- Comece a técnica estéril. Calçar luvas estéreis e manter o wrapper como uma superfície estéril em que para colocar os iodo e etanol scrubs.
- Retire o telêmetro a partir do pacote ou soro fisiológico e usar uma pinça estéril, para colocá-lo em gaze estéril.
- Usar a seringa (fornecido pelo fornecedor telémetro) para encher a ponta do cateter com gel. Suavemente apertar o cateter criando uma pressão negativa suficiente para extrair o gel no interior do cateter.
- Coloque uma ponta estéril sobre a pipeta. Pipetar 2 ul de cola cirúrgica e definir a pipeta sobre uma superfície estéril.
- Para limpar o local cirúrgico, limpar a área com iodo e, em seguida, com etanol a 70%.
- Corte um buraco na cobertura cirúrgica grande o suficientepara a área necessária para a incisão e coloque sobre o mouse.
- Realizar uma pitada pé (resposta pedal) para garantir o mouse é completamente anestesiados antes de fazer uma incisão.
- Faça uma pequena incisão na linha média vertical. Em seguida, faça uma incisão semelhante através do músculo parede do corpo subjacente.
- Puxe cuidadosamente o útero fora da cavidade do corpo e localizar o corno uterino contendo a maioria dos filhotes que são viáveis.
- Opcional - Para além de miRNA, injetar vetor viral na camada muscular do útero antes da inserção de telêmetro.
- Faça uma pequena incisão na ponta do corno uterino com três milímetros de corte tesoura primavera ponta.
- Passe o cateter, sem apertar, entre a parede uterina e sacos fetais. Insira o cateter passado vários sacos para reduzir a sua remoção acidental. Certifique-se que os sacos fetais não são perturbados pela inserção.
- Pipetar a cola cirúrgica para o sítio de inserção do telémetro para aderir o cateter para a uchifre terine e impedir o cateter de deslizar para fora da trompa uterina. Espere alguns segundos para a cola para tornar-se rígida, e em seguida, coloque cuidadosamente o útero de volta para dentro da cavidade do corpo.
- Inserir o telémetro na cavidade do corpo no lado oposto do sítio da inserção do cateter.
- Suturar a cavidade do corpo fechado com 6,0 suturas absorvíveis. Em primeiro lugar, fazer um ponto em bolsa e, em seguida, 3-4 pontos individuais.
- Suturar a pele, utilizando a mesma técnica, mas com 6-0 não absorvíveis.
- Dibucaína Swab (analgésico tópico) pomada sobre o local da incisão.
- Injectar subcutaneamente 0,3-0,4 ml de solução salina estéril para ajudar a hidratar o animal.
- Monitorar o animal após a cirurgia até que esteja completamente acordado. Não coloque o mouse de volta em sua gaiola até que ele é capaz de sustentar livremente sua cabeça acima da tabela como certos tipos de roupa de cama pode sufocar um rato pesadamente anestesiado. Para um rato que foi anestesiado para 30-45 min, deve-se esperar the mouse para ser totalmente acordado por 1 hora e 15 min.
- Se a realização de cirurgias adicionais, limpe instrumentos com etanol 70% e talão esterilizar antes da reutilização.
4. recuperação pós-operatória
- Monitorar diariamente o progresso pós-cirurgia em um log. Catálogo ganho de peso e perda e prestar atenção para letargia, sangramento, ou fechamento incompleto da incisão cirúrgica.
- Alimente o mouse ração rato amolecida (~ a consistência de purê de maçã) ou recuperação dieta especializada.
- Examine as suturas e se certificar que não são puxados para fora, mas não tente lidar com o mouse excessivamente.
5. Telemetry Recording
- No dia do interesse (pelo menos um de dois a três dias após o mouse se recuperou da cirurgia), coloque um ímã perto do mouse para ligar o telêmetro. Coloque a gaiola do mouse sobre o receptor. A luz no receptor deve ligar se o telêmetro é ativado.
- Calibrar novo Teleme ters com calibrações específicas fabricante fornecido. Especificações de calibração Telemeter reutilizados serão mantidos em software.
- Dentro do software, começar a gravar com o botão direito em "animal" e clique em "iniciar a amostragem, contínuo", que permite a amostragem em taxas de até 500 Hz. Verifique se o software está definido para salvar e rastrear.
NOTA: Quando o ícone do mouse amostragem fica verde, as pressões estão sendo gravadas. Perturbar o mouse durante o parto pode interromper ou alterar o trabalho, por isso observar com cautela. - Após o parto ou o período de interesse, parar a gravação com o botão direito em "animal" e selecionando "parar as gravações, tudo". Use um ímã para desligar telêmetro para salvar a vida da bateria, como a bateria telemeter normalmente duram apenas 1,5 meses de gravação contínua.
- Eutanásia o mouse por CO 2 overdose e recuperar o telêmetro. Os filhotes são sacrificados por decapitação.
- Inserir o telémetro numa solução de 1% de detergente enzimática durante a noite em água desionizada à temperatura ambiente.
- Lavar o telêmetro em água deionizada e remover todo o tecido e cola, tomando cuidado para não apertar o cateter.
- Incubar o telémetro em glutaraldeído a 2% durante 24 horas à temperatura ambiente para esterilizar.
- Lavar o telêmetro com solução salina estéril e armazená-lo em solução salina estéril até a próxima implantação ou a ser enviado de volta ao fabricante para ser reformado. Telémetros deve ser renovado se o tecido está localizado no interior do cateter, após a esterilização. Normalmente telémetros pode ser usado 4-5 vezes antes de precisar ser remodelado.
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Representative Results
Em tempo real das pressões intra-uterinos vivo pode ser gravado utilizando um sistema de aquisição de telemetria. Amostragem Pressão emparelhado com gravação simultânea de vídeo do mouse foi usado para capturar o momento exato da entrega de cada filhote e correlacionar o tempo de entrega para a pressão intra-uterina da mãe. Todos os pontos de dados podem ser representados graficamente, em seguida, durante toda a gravação para gerar uma pressão versus tempo trama (Figura 1A). Este gráfico mostra os pontos durante a gestação quando as alterações na pressão intra-uterina, bem como a diferença de pressão entre os ciclos de luz e escuro. Além disso, de uma média móvel da pressão intra-uterino pode ser representada graficamente (Figura 1B). Isso é útil para visualizar mais facilmente aumentos sustentados na característica pressão intra-uterina das contrações associadas com o processo de trabalho (registros obtidos durante o parto têm sido publicados anteriormente 9).
Os dados podem ser analisados através da exportação de pontos de dados para o software de análise de dados e calculando a média durante o período de tempo de interesse. Ao comparar diferentes condições experimentais, tais como tipo selvagem contra camundongos transgênicos, diárias ou pressões de hora em hora a partir de diferentes camundongos pode ser calculada a média para examinar padrões contráteis dependentes do gene de interesse. Além disso, a significância estatística de diferenças pode ser determinada. As pressões intra-uterino pode ser examinada durante o parto, ou um estudo longitudinal pode ser conduzido para examinar todo o período de gestação, sob diferentes condições.
Telemetria intra-uterino pode ser usado para testar a resposta in vivo a agentes farmacológicos durante a gravidez. Especificamente, este método permite o teste de drogas mais cedo antes de ensaios clínicos. Diferenças na resposta a agentes específicos podem ser testados em ratinhos transgénicos, bem como em ratinhos não grávidas ou grávidas. Um agente farmacológico específico conhecido para aumentar úteroscontração ne, oxitocina, pode ser entregue por via subcutânea como descrito anteriormente em um modelo de rato 10. O telémetro pode ser implantado, ao mesmo tempo, como uma bomba de micro-osmótica para fornecer uma taxa constante de oxitocina. As diferenças entre as gravações em não grávidas (Figura 2A) e grávida ratos com administração de oxitocina (Figura 2B) também podem ser examinadas.
Outra potencial aplicação de telemetria intra-uterina está olhando para as contrações uterinas após miRNA / shRNA silenciamento de proteínas. Modelos do rato não estão disponíveis para todos os genes que são essenciais para o parto. Assim, o silenciamento de genes em combinação com as medições de pressão intra-uterino pode ser utilizada para investigar as proteínas de interesse. Ao injectar-miARN vectores lentivirais expressando na miométrio durante a implantação do telémetro, knockdown-uterina específico de um gene de interesse pode ser analisado, como pode ser visto na Figura 3A. Um recente estudo mostraum exemplo específico demonstrando que o canal Kir7.1 tem um papel importante em quiescência uterina após uso dos dois miARN e telemetria para examinar as alterações a pressão intra-uterina ao longo da gestação 11. Traçados representativos de miARN mexidos (Figura 3A) ou Kir7.1 miARN (Figura 3B) mostram que derrubar a expressão do canal de potássio Kir7.1 causada pressão intra-uterina ao aumentar. Estes traçados representativos são semelhantes ao que é visto em modelos de ratinhos transgénicos, como descrito anteriormente 9.
Figura 1: gravação contínua pressão intra-uterina Representante (A) os dados de pressão intra-uterino em tempo real gravadas in vivo continuamente durante quatro dias (15-19 DPC).. (B) Movendo horária média de dados em (A). Whbares ite e pretas em cima de gravações indicam 12 ciclos de luz hr e escuras, respectivamente. (C) A ampliada traço de rato em contrações individuais vivo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: pressões intra-uterinos em resposta a oxitocina traçados representativos de pressão intra-uterina de não-grávida miométrio (NP) (A) e tarde grávida (18 DPC) miométrio (B) exposto a 5 unidades / dia de ocitocina durante 24 h revelam aumentos. da pressão no final dos anos grávida contra ratos NP. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Medição da pressão intra-uterina após o silenciamento de um canal de potássio por miARN / shRNA (A) Representação esquemática do posicionamento do telémetro e os locais de injecção de miARN-expressam os lentivírus.. Estudos recentes têm demonstrado os traçados representativos da pressão intra-uterina do miométrio transduzidas com (B) mexidos miRNA ou (C) Kir7.1 miRNA. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
As investigações sobre a contratilidade do miométrio têm contado com ex vivo medições da tensão muscular. Esta metodologia pode ser útil para testar em estágio inicial de drogas uterotônicas recentemente desenvolvidos que não podem ser administrados aos animais vivos. No entanto, abordagens in vivo são necessários para compreender longitudinalmente a progressão do trabalho de parto. As medições in vivo servir a vários propósitos. Primeiro, eles permitem a captura de uma imagem completa de mudanças no padrão contrátil uterina ao longo da duração da gravidez. Em segundo lugar, eles eliminam a tendência de ex vivo gravações que requerem tecido uterino para ser montado quer verticalmente quer horizontalmente, o que limita a nossa compreensão da função completa da camada muscular circular e longitudinal do útero. Em terceiro lugar, eles permitem a gravação da pressão uterina no ambiente hormonal endógeno, tornando assim possível estudar de forma mais precisa do parto em modelos de ratos. Por último, porque permitem que mais de trinvestigações anslational entre modelos de ratos e seres humanos como telemetria uterina mais se assemelha medições realizadas em mulheres grávidas com cateteres pressão intra-uterina.
Os métodos para a telemetria do mouse uterino são fáceis de aprender, mas difícil de dominar. Os investigadores com experiência cirurgia rato anterior pode alcançar o sucesso mais rápido, mas isso não deve impedir laboratórios de usar esta técnica valiosa. Os estudos originais usando telemetria rato uterino foram feitas por um novato com grande sucesso depois de algumas tentativas, então laboratórios devem estar preparados para o primeiro par de cirurgias para fazer com que a barragem de perder todos os fetos. Aqui estão algumas dicas para manter em mente. Como com qualquer cirurgia, a duração mais curto é o melhor para o animal. Uma rápida cirurgia irá limitar a desidratação e a necessidade de doses adicionais de anestesia. Se o pesquisador está tendo um momento difícil de terminar o procedimento antes de o rato acorda, o isoflurano pode ser usado para manter o anesthetiz ratoed mais. Descobrimos também que a utilização de isoflurano aumenta o número de cachorros viáveis e é preferido em relação a cetamina. O menor incisão possível, apenas um pouco maior do que o corpo do telêmetro, irá reduzir a chance de a ferida aberta depois, diminuir o tempo necessário para sutura, e melhorar a recuperação mouse. Com uma pequena incisão abdominal, puxando o útero fora da cavidade do corpo vai permitir uma melhor visibilidade durante a inserção do cateter. Ao reutilizar um telêmetro, fator na curva anterior do cateter quando enfiar-lo para baixo do corno uterino. Permitir que a cola cirúrgica para endurecer completamente antes de colocar o corno uterino de volta para dentro da cavidade do corpo vai ajudar a manter o cateter no lugar e impedir a cola de degola para o intestino. O corpo telêmetro pode danificar o fígado se colocado muito alto, e o abdômen do rato é capaz de se expandir a fundo, então não hesite em colocar o medidor de distâncias menores no corpo. Estes métodos deverão ser personalizado to atender às necessidades de diferentes laboratórios e diferentes modelos de ratos, mas as vantagens de telemetria uterino superam os obstáculos.
Existem algumas limitações que devem ser consideradas na aplicação da presente metodologia. Um dos principais desafios que devem ser superados é o grau de perda fetal após a implantação do transmissor. No relatório inicial telemetria intra-uterina 9, todos os SK3 T / T e camundongos selvagens transgênicas tiveram algum grau de perda fetal em um ou ambos os cornos uterinos, independentemente se isso chifre foi escolhido para a colocação telêmetro. Otimização da escolha do dia durante a gravidez quando o telêmetro foi inserido cirurgicamente melhorado a nossa taxa de gravidezes bem sucedidas prazo, mas um conjunto completo de filhotes nunca foi obtido. Notavelmente, o dia ideal de cirurgia para SK3 T / T camundongos diferente da que existe tipo selvagem, com melhores resultados reprodutivos observado no dpc12-13 para SK3 T / T camundongos contra dpc8-9 para WT ratos, suggeaguilhão que o protocolo de cirurgia podem precisar de ser modificados para cada modelo de rato de interesse. Nossos dados indicam que o número de filhotes birthed não se correlacionou com pressão intra-uterina em geral. Fetais melhora com melhoradas habilidades cirúrgicas pelo experimentador, e outros que implementaram essa metodologia em seu laboratório têm notado que os resultados fetais melhorada com o uso de isoflurano em vez de cetamina. Espera-se que quanto mais os laboratórios utilizam essa metodologia, a tecnologia transmissor e software de análise intra-uterino se tornará mais refinado. Este, sem dúvida, o avanço da utilidade desta tecnologia nos estudos dos mecanismos que contribuem para o trabalho.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Glue | 3M Vetbond | 1469SB | Tissue Adhesive--stored in Drierite |
| Absorbable 6-0 Sutures | Ethicon | J212H | Vicryl |
| Non-absorbable 6-0 Sutures | Ethicon | 8706H | Prolene |
| Water Jacket Blanket + Heating Pad | Gaymer | T/Pump PN 11184-000 Blanket-66N111CC | Specialized for rodents |
| Bead sterilizer | Keller | Z378577 | Steri 250 Sterilizer |
| Disecting Microscope | Nikon | SMZ754 | Fibre optic gooseneck external light source |
| Sterile Surgical Gloves--Latex | Cardinal Health Triflex | 2D7253 | |
| PhysioTel PA-C10 Pressure Transmitter | Data Sciences International | 270-0135-001 | TA11PA-C10 |
| Telemeter Reciever | Data Sciences International | 272-6001-001 | RPC-1 |
| Dataquest ART 4.3.2 Analysis Platinum | Data Sciences International | 271-0147-141 | Analysis software |
| Diet Recovery Gel | Clear H2O | 72-01-5022 | Purified Soft Diet for Rodents |
| Tergazyme | Sigma-Aldrich | Z273287 | Enzyme detergent |
References
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