Summary
Hier presenteren we een protocol om tissue engineered vaartuig enten die functioneel zijn voor het enten in muizen door dubbel zaaien gedeeltelijk geïnduceerde pluripotente stamcellen genereren (PiPSC) - afgeleide gladde spiercellen en PiPSC - afgeleide endotheelcellen op een gedecellulariseerde schip steiger bioreactor.
Introduction
De bouw van vasculaire leidingen is een fundamentele strategie voor chirurgische reparatie van beschadigde en gewonden schepen als gevolg van hart- en vaatziekten. Tot op heden, graft materialen die worden gebruikt in de chirurgie omvatten biocompatibele synthetische polymeren (polytetrafluoretheen [Teflon], geëxpandeerd polytetrafluorethyleen [ePTFE; Gore-Tex] of polyethyleentereftalaat [Dacron]), allogene, autoloog weefsel (pericardium of vene) en xenograften 1. Terwijl kunstmatige transplantaten (bv Gore-Tex en Dacron) worden het meest gebruikt, deze materialen waarschijnlijk leiden tot tal van korte en lange termijn complicaties die stenose, calcium afzetting, trombo-embolisatie en infecties omvatten. Hoewel patiënten met biologische enten aanwezig met verminderde trombo-embolische gebeurtenissen, ze nog steeds beperkingen tegenkomen zoals secundaire transplantaat falen en een kortere levensduur als gevolg van verkalking degradatie 2. Daarom, ondanks aanzienlijke verbeteringen in chirurgische techniques de jaren, onderzoekers en clinici nog belast met het nodig zijn de ideale geleider voor vaatziekten. Meer recent heeft het onderzoeksveld van de vasculaire tissue engineering een concept waarbij cellen worden opgenomen in biologisch afbreekbare steigers, met als doel het creëren van een biomimetische omgeving die een functioneel schip voor succesvolle enting 1 belichaamt gegenereerd. Fundamenteel, het succes van de vasculaire constructen afhankelijk drie essentiële componenten; cellen die de steiger, dwz een endotheliale binnenlaag en een gladde spiercel laag, een scaffold dat het geschikte extracellulaire matrix mechanische eigenschappen vergelijkbaar met de natieve vasculatuur verschaffen, en de moleculaire / cellulaire signalering die nodig is voor het initiëren / regulerend omvatten reparatie.
Lange termijn patency en duurzame ontwikkeling van de neo-weefsels sterk afhankelijk effectieve zaaien van cellen van steigers, thereby waardoor de beslissing van celtype van cruciaal belang. Verscheidene rapporten tonen het gebruik van volwassen endotheliale en gladde spiercellen uit diverse bronnen kleine diameter leidingen 3-6 ontwikkelen. Hoewel veelbelovend, het ontbreken van voldoende autologe schepen te verkrijgen mature endotheelcellen en gladde spiercellen blijven een aanzienlijke last. Recenter zijn stamcellen uit diverse bronnen zijn gebruikt voor vaatweefsel technische toepassingen. Inderdaad, verschillende types stamcellen waaronder embryonale stamcellen 7, geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) 8,9, PiPSC 10,11, beenmerg afgeleide mononucleaire cellen 12, mesenchymale stamcellen 13, endotheliale progenitor cellen en wand volwassen vat -afgeleide stamcel antigeen-1 (Sca-1) + stam / progenitorcellen 14,15 zijn allemaal aangetoond kan differentiatie worden in ofwel functioneel endotheel of gladde spiercellen in reactie op gedefinieerde media enkweekomstandigheden. Bovendien is de onbeperkte zelfvernieuwing capaciteit van de stamcellen ze betere kandidaten tegenstelling volwassen endotheliale en gladde spiercellen die slechts delen een eindig aantal malen ondergaan groeistop en afsterven.
De keuze van dragermateriaal succesvol tissue engineered verblijf genereren voor enten afhankelijk van verschillende factoren zoals biocompatibiliteit, biomechanische eigenschappen en biologische afbraaksnelheden. Fundamenteel, materialen voor scaffolds voor het enten creëren biologisch afbreekbaar zijn en mogen geen onnodige ontvanger immuunreacties monteren. Bovendien moet een geschikte porositeit en microstructuur voor celhechting en daaropvolgende overleving omvatten. Tot op heden de meest voorkomende materialen voor steigers vaatweefsel techniek omvatten polymeren van polyglycolzuur, polymelkzuur, en poly ε-caprolacton 16. Recenter cellen ontdaan biologische materialenook toegepast met enig succes. Verschillende laboratoria hebben aangetoond dat het zaaien gedecellulariseerde mens, honden of varkens schepen met autologe cellen voorzien van een biologische graft die verzette stolling en intima hyperplasie 17-19. Andere strategieën in vasculaire tissue engineering omvatten extracellulaire matrix eiwitten gebaseerde vaattransplantaten bv, zaaien cellen in fibrine gel 13 en het genereren cel vellen zonder steiger steun 20, 21.
Het huidige protocol toont de differentiatie van humane PiPSC in functionele endotheel- en gladde spiercellen, het genereren van een bioreactor die bestaat uit een gedecellulariseerde vaartuig scaffold functionele PiPSC afgeleide vasculaire cellen haven en enten van de tissue engineered vaartuigen in ernstige gecombineerde immunodeficiëntie (SCID ) muizen. PiPSC zijn een optimale celtype te gebruiken voor tissue engineering van het schip enten omdat deze cellen niet tumoren bij muizen te vormen of te verhogen ethische enallo- immuunresponsen. Verder hebben we aangetoond dat de strategie voor het genereren PiPS-endotheelcellen en PiPS gladde spiercellen efficiënt en reproduceerbaar 10,11. Daarna hebben we een gedecellulariseerde vaartuig voor het zaaien van PiPSC-afgeleide vasculaire cellen naar de matrix eiwitten die binnen een native vat bestaat na te bootsen, waardoor het verbeteren van enten en overleving werkzaamheid. Bovendien, de cellen ontdoen van de bloedvaten vóór PiPSC enten voorkomt het optreden van ontstekingsreacties gemonteerd immuunceltypen zoals macrofagen. Bovendien houdt dit protocol vormen niet alleen een methode voor het genereren veelbelovende vasculaire leidingen voor translatie in mensen, maar ook waardevol middel van het bestuderen en begrijpen van de moleculaire mechanismen die vasculair weefselregeneratie regeren door muismodellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Voer alle dierproeven volgens de protocollen door de Institutional Comité voor gebruik en onderhoud van proefdieren goedgekeurd.
1. Voorbereiding van Cultuur Media
- Maak kweekmedia voor humane fibroblast cellijn CCL-153: F-12K Medium, 10% foetaal runderserum (FBS) en 100 U / ml penicilline en streptomycine.
- Maak herprogrammeren Media voor PiPSC generatie Knockout Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) dat 20% Knockout Serum vervanging, 0,1 mM β-mercaptoethanol, 0,1 mM Minimum Essential Medium (MEM) Niet-essentiële aminozuren, 10 ng / ml basische fibroblastgroeifactor 2 (bFGF-2) en 100 U / ml penicilline en streptomycine. Voeg bFGF-2 vers elke keer voordat het gebruik van de media.
- Voeg Differentiatie Media (DM) gladde spiercellen induceren (SMC) differentiatie: α-MEM medium dat 10% FBS, 0,1 mM β-mercaptoethanol, 100 U / ml penicilline en streptomycine en 25 ng / ml van bloedplaatjes afgeleide groeifactor(PDGF-ββ).
- Voeg Endotheliale Differentiatie Media (EC-DM) endotheelcellen (EC) differentiatie induceren: Endotheliale groeimedia-2 (EGM-2) medium dat 50 ng / ml Vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) en 100 U / ml penicilline en streptomycine.
2. herprogrammeren humane fibroblasten in Gedeeltelijk-geïnduceerde pluripotente stamcellen (PiPSC)
- Cultuur menselijk fibroblastcellijn CCL-153 op 0,04% gelatine-oplossing gecoat flesjes in kweekmedium.
- Passage cellen elke 3 dagen bij een verhouding van 1: 6. Gebruik cellen vóór doorgang 9 voor een optimale efficiëntie van PiPSC generatie. Cellen zijn klaar voor transfectie bij het bereiken van 80-90% samenvloeiing.
- Lineariseren polycistronische plasmide pCAG2LMKOSimO met 4 herprogrammering factoren octameer-bindende transcriptiefactor 4 (OCT4), SOX2, Krüppel-achtige factor 4 (KLF4) en C-MYC (pCAG-OSKM). Digest 5 ug plasmide met 5 eenheden restrictie-enzym PvuI gedurende 3 uur bij 37 ° C. Zuiverenhet plasmide met een commerciële kit volgens protocol van de fabrikant.
- Transfecteren 2 x 10 6 humane fibroblasten met 4 ug gelineariseerde pCAG-OSKM plasmide door elektroporatie met menselijke dermale fibroblasten (NHDF) nucleofectie kit volgens protocol van de fabrikant. Voorzichtig zaad getransfecteerde cellen op pre- 0,04% gelatine beklede T25 kolf die 5 ml voorverwarmde herprogrammeren Media.
- Na 24 uur, verandert medium met supplementen van 25 ug / ml neomycine om een zuivere populatie getransfecteerde cellen te selecteren.
- Wijzig medium om de andere dag tot dag 4.
Opmerking: menselijke fibroblasten geworden PiPSC na 4 dagen van de herprogrammering.
3. Differentiatie van PiPSC in endotheelcellen en gladde spiercellen
- Zaad PiPSC op collageen IV pre-coated gerechten met DM voor 4 dagen om differentiatie te induceren in SMC's. Wijzig medium om de andere dag tot dag 4.
- Zaad PiPSC op collageen IV-pre gecoat gerechten containing endotheel-DM 6 dagen differentiatie induceren in endotheelcellen. Wijzig medium om de andere dag tot dag 6.
4. gedecellulariseerde Aorta Graft Voorbereiding
Opmerking: Alle oplossingen en apparatuur moet steriel zijn.
- Offer de muis door cervicale dislocatie en bevestig de muis in een liggende positie onder dissectie microscoop.
- Knip het borstbeen en rond de ribbenkast tot de borstholte geopend. Verwijder het hart, de longen en de slokdarm naar de aorta bloot te leggen. Verwijder voorzichtig de peri-aorta vet met een pincet.
- Snijd de aorta van het voorste einde met een schaar en voorzichtig houd het uiteinde met stompe pincet. Maak de aorta uit de kolom wervelkolom achter door stompe dissectie. Sluit zorgvuldig de vertakking slagaders van de aorta door ligatie met een bipolaire electrocoagulator en snijden van het uiteinde van de ligatie met een schaar.
- Gebruik een spuit 5 ml aan de aorta lumen spoelen met 3 ml zoutoplossing bevattende 100 U heparine om de vorming van bloedstolsels.
- Knip het achterste uiteinde van de aorta voordat het vertakt in de nier. Houd de integriteit van de aorta is bijzonder belangrijk tijdens de gehele procedure.
- Spoel de aorta lumen met 5 ml 0,075% natriumdodecylsulfaat (SDS) verdund in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
- Week de thoracale aorta 0,075% SDS oplossing in een 10 cm Petrischaal. Plaats de petrischaal op een orbitale schudder gedurende 2 uur bij 150 rpm bij kamertemperatuur.
- Spoel de aorta lumen met 5 ml PBS.
- Week de aorta in PBS in een 10 cm Petrischaal. Plaats de petrischaal op de orbitale schudder gedurende 2 uur bij 150 rpm bij kamertemperatuur. Vernieuwen PBS om de 20 min.
- Spoel de aorta lumen met 5 ml PBS.
- Laat cellen ontdane aorta graft in PBS bij 4 ° C gedurende maximaal een week.
5. Dual Zaaien van PiPSC en Bioreactor Conditioning
Opmerking: Alle oplossings en apparatuur moeten steriel zijn. Voer alle activiteiten in een weefselkweek kap.
- Monteer de bioreactor stroomcircuit zie figuur 1. Sluit incubatiekamer, media reservoir, peristaltische pomp en naleving kamer met slangen. Minimaal volume medium nodig voor circulatie 40 ml.
- Voorwaarde het ontcelde vat kweekmedium door het weken van de aorta in DM medium in een 10 cm Petrischaal. Plaats de petrischaal op de orbitale schudder gedurende 1 uur bij 50 rpm bij kamertemperatuur.
- Plaats 1 cm lengte nylon buizen (OD 0.9 mm, 0.75 mm ID) in beide uiteinden van de ontcelde vat onder de microscoop. Bind het schip en de buizen met 8-0 zijde hechtingen.
- Monteer de ontcelde aorta graft in de incubatiekamer op door de nylon buizen met de inlaat- en uitlaatpoorten (1/32 "slang) van de kamerwand. Onderhouden incubatiekamer met 5mls van medium elke keer.
- Trypsinize PiPSC door toevoeging voorverwarmdetrypsine om de cultuur schotel te dekken en schud de schotel 10 keer. Gooi de trypsine en laat de schotel in incubator gedurende 2-3 min. Voeg voorverwarmd kweekmedium in de schaal en meng het medium met de cellen.
- Tellen van het aantal cellen met behulp van een hemocytometer. Centrifuge twee aliquots van celsuspensies met 5 x 10 5 cellen per 5 minuten bij 300 x g. Volledig Zuig de supernatant.
- Na volledig opzuigen het supernatant, resuspendeer pellet 1 van de PiPS celpellets in 50 pl DM. Injecteren deze celsuspensie in de gedecellulariseerde vaatlumen.
- Vervolgens resuspendeer de andere PiPS celpellet in 100 ui Matrigel. Zorgvuldig pipet het mengsel op de gedecellulariseerde aorta graft.
- Wacht 10-15 minuten totdat er een gelachtige toestand gelijkmatig wikkelt rond het vat buitenoppervlak. Vul het incubatiekamer met DM.
- Plaats het geheel bioreactor instelling in een 5% CO2 incubator bij 37 ° C. Handmatig draaien de ontcelde transplantaat 90 ° om de langsas elk half uur in de eerste 2 uur.
- Houd statische cultuur gedurende 12 uur naar cel adhesie te schakelen.
- Lever DM door het lumen van de peristaltische pomp gladde spiercellen differentiatie induceren. Start initiële debiet bij 5 ml / min en de stapsgewijze verhoging tot 20 ml / min gedurende 24 uur.
- Houd het circulerende medium debiet 20 ml / min gedurende 24 uur.
- Stop met het medium flow en verplaats de bioreactor waarin van de incubator.
- Opnieuw zaad het lumen van het implantaat met PiPSC. Trypsinize, tellen en centrifuge 1 x 10 6 PiPSC als in de stappen 5,5-5,6. Resuspendeer de cellen in 50 ul EGM-2 medium dat 50 ng / ml VEGF. Injecteer de cel mengsel in het lumen van het implantaat.
- Verander het medium in de incubatiekamer en hele omloop EGM-2 medium dat 50 ng / ml VEGF in endotheliale differentiatie induceren.
- Beweeg de bioreactor instelling terug naar the incubator. Handmatig draaien de graft 90 ° 30 min in de eerste 2 uur en vervolgens houdt een statische kweek gedurende 12 uur.
- Begin circulatiestroom van 5 ml / min en stapsgewijze verhoging tot 35 ml / min. Houd het debiet 35 ml / min gedurende 5 dagen. Veranderen circulerende en kamermuziek medium om de andere dag.
- Oogst de engineered graft voor verdere enten op de muis.
6. Het enten van Double-geplaatste PiPSC Graft in Muizen
- Gebruik NOD.CB17-Prkdc scid / NcrCrl mannelijke muizen als vaartuig transplantaat ontvangers. Zorg er altijd voor dat de muizen zijn ongeveer 10 weken oud, weegt ongeveer 25 - 35 g, en zijn in goede hygiënische omstandigheden.
- Verdoven ontvanger muizen door toediening van een combinatie van Hypnorm (25 mg / kg) en Hypnovel (25 mg / kg) intraperitoneaal. Breng petrolatum oogzalf op ogen droog voorkomen terwijl onder verdoving. Bevestig efficiënte verdoving door ervoor te zorgen dat de muizen hebben ontspannen spieren en gestaag ademen.
- Bevestig de muis in een liggende positie met zijn nek geschoren en uitgebreid. Dien atropinesulfaat (1,7 mg / kg) in combinatie met de anesthetica zodat de muis luchtwegen vrij blijft.
- Bereid een middellijn incisie van de onderkaak tot borstbeen van de muis. Onder een dissectiemicroscoop met 5- tot 10-voudige amplificatie, til de juiste speekselklieren lateraal en verwijder het cleidomastoid spier rechts halsslagader bloot.
- Verwijder voorzichtig gehecht weefsel rechts halsslagader mobiliseren van het distale uiteinde naar het proximale uiteinde. Afbinden het middelste gedeelte van de gemeenschappelijke halsslagader tweemaal met een 8-0 zijden hechtdraad en ontleden tussen de twee banden.
- Door een manchet gemaakt van autoclaveerbaar nylon buis in elk uiteinde vat en zet elk uiteinde met microhemostat klemmen.
- Verwijder hechting band aan het ene uiteinde en een daling van heparine (100 U / ml) toegepast. Onmiddellijk na Draai het distale eind van The slagader om de hele manchet lichaam te bedekken fix de omgekeerde schip met een 8-0 zijden hechtdraad om de manchet en.
- Herhaal dezelfde procedure voor het andere deel van de slagader. Flush slagader met een zoutoplossing om bloedstolsels te verwijderen.
- Implanteren een gedecellulariseerde vaartuig transplantaat tussen twee uiteinden van de halsslagader door het schuiven van de gedecellulariseerde uiteinden vaartuig van de meer dan de slagader manchetten en de vaststelling van het met 8-0 zijde hechtingen. Verwijder vasculaire klemmen aan beide uiteinden voor het evalueren van de pulsatie van de graft.
- Plaats de rechter speekselklier terug naar zijn oorspronkelijke positie. Sluit de huid op de chirurgische locatie met een onderbroken hechtdraad met een 6-0 polyglactine hechtdraad.
- Consequent acht vitale functies van muis nadat de procedure is voltooid, totdat hervat bewustzijn. Offer ontvangende muizen door cervicale dislocatie en oogst verblijf enten ofwel 24 uur of 3 weken later voor verdere analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De succesvolle generatie PiPSC werd 4 dagen bevestigd na nucleofecting humane fibroblasten met een gelineariseerde pCAG2LMKOSimO plasmide dat 4 transcriptiefactoren, OCT4, SOX2, KLF4 en c-MYC (OSKM). PiPSC vertoonde een duidelijk onderscheiden fenotype in vergelijking met fibroblasten (Figuur 2A) en uitgedrukt 4 herprogrammering factoren mRNA (Figuur 2B) en eiwit (Figuur 2C) niveau 10. De werkzaamheid van een PiPSC gebaseerde vasculaire transplantaat is sterk afhankelijk van het vermogen van de PiPSC te differentiëren in zowel endotheel en gladde spieren lijnen. Het is daarom essentieel om de eigenschappen van PiPSC in vitro bevestigen differentiatie van de cellen in gedefinieerde media alvorens te benutten om verblijf grafts genereren. Figuur 3 toont het vermogen van PiPSC differentiëren tot functionele endotheelcellen zowel gen (Figuur 3A) en eiwit ( Figuur 3B-D) levels, gebaseerd op endotheliale merkers 10. Evenzo PiPSC ook kunnen differentiëren in de gladde spier lijn in reactie op specifieke media (figuur 3E-H) 11.
Hele aorta decellularisatie werd bereikt door behandeling met SDS, een anionisch detergens dat cellen lyseert en oplosbaar maakt cytoplasmatische componenten. Na 2 uur behandeling, de ontcelde aorta verscheen als een doorschijnende acellulaire scaffold vergeleken met een vers geoogste aorta (Figuur 4A-B) 22. Histologische evaluatie in figuur 4C-F illustreert de afwezigheid van kernen en cytoplasmatische kleuring in cellen ontdane vaten, maar niet in normale muizen aorta. Na dubbele zaaien van PiPSC afgeleide endotheliale en gladde spiercellen in cellen ontdane aorta, de gemanipuleerde vasculaire implantaten tonen endotheel- en gladde spiercellen eigenschappen resp. Hematoxyline en eosine (HE) kleuring van de dubbel-seeded enten bleek een architectuur vergelijkbaar met die van natuurlijk vaartuigen (Figuur 4G) met meerdere lagen van gladde spiercellen en een monolaag van endotheelcellen bevestigd door positieve kleuring van gladde spier-22α (SM22), gladde spier α-actine (SMA) respectievelijk (figuur 4H-M) 11 CD31 en CD144 markers.
Om de openheid van de tissue engineered vaartuigen in vivo te bevestigen, werd een dubbele geënte PiPSC afkomstige vaartuigen geënt muizen - zowel normale muizen en cellen ontdane slagaders werden gebruikt als controles. Daaropvolgende analyse toonde aan dat de muizen geënt met cellen ontdane schepen gepresenteerd met duidelijk hogere sterftecijfers al op dag 1, PiPSC vat enten verleende een overlevingspercentage van 60% 3 weken na transplantatie (figuur 5A) 11. Bovendien werden 3 weken oude PiPSC afgeleide transplantaten volledig gekarakteriseerd op de aanwezigheid van humane PiPSC afgeleide endotheliale en gladde spiercellen en gastheer macrofaag infiltratie (Figuur 5B en Tabel 1) 11. Tezamen resultaten aan dat PiPSC het vermogen om te differentiëren in zowel vasculaire lijnen en krachtige voor het genereren van functionele weefselengineering vaartuigen die natief vaartuigen in vivo kan vervangen.
Figuur 1. Schematische weergave van het gedecellulariseerde transplantaat bioreactor stroomkring. De cellen ontdane vat transplantaat wordt geassembleerd in de incubatiekamer. Een peristaltische pomp aan de stroomopwaarts van de incubatiekamer stabiel medium perfusie flow. De media reservoir aan de stroomafwaarts van de incubatiekamer. De naleving van de kamer is om het regime doorstroming te verbeteren. De stromingsrichting is met pijlen.large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Genereren van PiPSC uit humane fibroblasten. Menselijke fibroblasten nucleofected met ofwel vier herprogrammering genen (OCT4, SOX2, KLF4 en C-MYC) of lege vector (control). (A) Fase contrast foto's tonen de morfologie van PiPS na 4 dagen. PiPSC uitgedrukt vier transcriptiefactoren, zowel mRNA (B) en eiwit (C) niveaus. Schaalbalk voor afbeeldingen voorbeeld 50 urn en gegevens zijn gemiddelden ± SEM (n = 3); * P <0,05, *** p <0.001. Dit cijfer is gewijzigd van Margariti, A. et al. 10 Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. </ A>
Figuur 3. PiPSC kunnen differentiëren naar zowel endotheel en gladde spiercellen. PiPSC of controle cellen werden gedifferentieerd in endotheelcellen. (A) in vergelijking met controle cellen, PiPSC afgeleide endotheelcellen tot expressie endotheel-specifieke merkers zoals CD31, CD144, kinase insert domain receptor (KDR), endotheel stikstofoxide synthase (eNOS) en von Willebrand factor (vWF) op mRNA niveau. (B) Dit werd bevestigd op eiwitniveau met Western blot analyse. (C) Immunofluorescentiekleuring aangegeven positieve kleuring van CD144 (VE-cadherine) in PiPSC-endotheliale cellen maar geen controle. (D) Flowcytometrische analyse bevestigde PiPSC-endotheelcellen expressie van CD31 en CD144. Collageen IV-geplaatste PiPSC (of controle cellen) werden ook gedifferentieerd ingladde spiercellen. (E, F) In tegenstelling tot cellen te controleren, PiPSC afgeleide gladde spiercellen uitgedrukt gladde spier-specifieke markers op het gen-niveau, waaronder SMA, calponin, SM22, glad spierweefsel myosine zware keten II (SMMHC), serum response factor (SRF) , myocardin, smootheline, elastine en collageen 1A1. (G) De expressieniveaus van SMA, calponin en SM22 in PiPSC afgeleide cellen werden bevestigd met Western blot analyse. (H) Immunofluorescentiekleuring middels confocale microscopie toonde een typische gladde spier marker kleuring voor calponin en SM22. Gegevens stellen gemiddelden ± SEM (n = 3); * P <0,05, ** P <0,01, *** p <0.001. Schaal bar voor getoonde afbeeldingen zijn van 25 urn of 50 urn. Deze cijfers zijn gewijzigd ten opzichte van Margariti, A. et al. 10 en Karamariti, E. et al. 11 aubklik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4. Generatie van dubbel geplaatste PiPSC afgeleide tissue engineered vaattransplantaten. (A, B) Decellularisatie van muis thoracale aorta bewaard zijn structuur en nog leek op die van een normaal schip, originele vergroting 2X. (CF) HE kleuring van cellen ontdane aorta bevestigd succesvol ontcelling en volledige verwijdering van de cellen vergeleken met controles, originele vergroting: 50X en 200X. (G) HE kleuring van PiPSC afgeleide endotheliale en gladde spiercellen dubbel geplaatste vaartuigen onthulde een architectuur die lijkt op een natief vaartuig. (J, M) Double-geplaatste PiPSC tissue engineered schepen gekleurd positief voor endotheel (CD31 en CD144) en gladde spiercellen (SM22 en SMA) markers in tegenstelling tot decellularized schip enten. (H, K) De gelijktijdige expressie van vasculaire merkers en de karakteristieke morfologie en lokalisering van PiPSC afgeleide endotheliale en gladde spiercellen in mediale en intimale gebieden was vergelijkbaar met natieve vaten. Schaal bar voor getoonde afbeeldingen zijn van 50 micrometer. Deze cijfers zijn gewijzigd ten opzichte van Tsai, T. et al. 22 en Karamariti, E. et al. 11 Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5. Dubbelklik geplaatste PiPSC afgeleide tissue engineered vaattransplantaten zijn patent voor inheemse schepen te vervangen in vivo. PiPSC afgeleide schepen werden geënt in de halsslagader van ernstige gecombineerde immuundeficiëntie (SCID) muizen, normale mouse en cellen ontdane slagaders werden gebruikt als controles. (A) Analyse van muizen geënt met PiPSC-afgeleide schepen toonde 60% overlevingskans 3 weken na de operatie, terwijl muizen geënt met gedecellulariseerde schepen gepresenteerd met duidelijk hogere sterftecijfers en lagere overleving (20%). De gegevens geven gemiddelden (n = 10). (B) De weefselengineering vaten werden geoogst 3 weken na transplantatie en aan HE (linker panelen) of immunofluorescentie kleuring (rechter panelen) op de aanwezigheid van humane CD144 en calponin of muis CD11b / CD18 (Mac-1); kwantificering van kleuring wordt samengevat in tabel 1. Oorspronkelijke vergroting voor beelden vinden 400x tenzij vermeld. Dit cijfer is gewijzigd van Karamariti, E. et al. 11 Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| Positieve cellen Field (40X) | Engineered-schip vóór enting | Engineered-vaartuig graft (3 weken) |
| calponin | 72 ± 9 | 22 ± 11 * |
| CD144 | 20 ± 8 | 5 ± 6 * |
| Mac-1 | 0 | 71 ± 11 * |
Tabel 1. Karakterisering van weefselengineering vaartuigen 3 weken na transplantatie. Het aantal PiPSC afgeleide endotheliale en gladde spiercellen en macrofagen gastheer gekwantificeerd na immunofluorescentie kleuring met humaan calponin, humane CD144 en muis Mac-1 respectievelijk. Gegevens vertegenwoordigt gemiddelde ± SEM (n = 6); * P <0,05, significant verschil van tissue-engineered schepen vóór het enten. Deze tabel is gewijzigd van Karamariti, E. et al. 11
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het huidige protocol geeft een goed, snel, eenvoudig, efficiënt en reproduceerbaar strategie waarbij functionele tissue engineered schepen kunnen worden gegenereerd met behulp PiPSC uit humane fibroblasten. Deze techniek is een waardevol instrument voor de regeneratieve geneeskunde, tissue engineering en potentieel patiënt-specifieke celtherapie in de nabije toekomst. Kritische stappen om de effectiviteit van het protocol omvatten de bereiding van PiPSC, bereiding van steriele en volledig ontcelde aortische transplantaten succesvolle zaaien en differentiatie van PiPSC in de steigers en handhaving van steriliteit aorta-enten in het vasculaire bioreactor.
De succesvolle productie van tissue engineered grafts leiden, is het van groot belang dat de bereiding van PiPSC daadwerkelijk uitgevoerd. Het protocol heeft met succes 'geherprogrammeerd' een mens fibroblastcellijn in PiPSC via nucleofectie met een pCAG2LMKOSimO OSKM plasmide. De Survival fibroblasten na nucleofection voert een aantal belangrijke punten zoals het gebruik van hoogwaardig OSKM plasmiden, plasmiden concentraties variërend van 500 - 1000 ng / ul, geen vertragingen in het zaaien van fibroblasten onmiddellijk na nucleofection als cellen zijn bijzonder gevoelig na invoering van relatief grote plasmiden en tenslotte de toevoeging van FGF-2 die cruciaal en in vers bereide medium worden toegevoegd vlak voor gebruik. Daarnaast vonden we dat het van cruciaal belang cellen tot doorgang 9 te replicatieve senescentie vermijden, om efficiënte 'herprogrammering' in PiPSC en daaropvolgende differentiatie in endotheel- en gladde spiercellen waarborgen. De zuiverheid van PiPSC kan worden verbeterd door selectie van de nucleofected cellen met neomycine. De pCAG2LMKOSimO plasmide heeft een neomycine resistentie gen en aldus de toevoeging van neomycine in een bereik van 25 ug / ml een dag na de nucleofection gedurende 3 dagen zal resulteren in de selectie van een zuivere populatie vanPiPSC. Om een efficiënte PiPSC vat ingenieur voor het enten in muizen, we beschouwd als de integriteit en de steriliteit van de gedecellulariseerde aorta naar de hoogste prioriteit. Alvorens integriteit van de aorta te behouden na ontcelling, moest voortdurend toepassen handvaardigheid de werkplaats vaten, aangezien ze relatief kwetsbaar en aanzienlijk klein in grootte. De efficiënte verwijdering van perivasculaire weefsel en afdichten van vertakking slagaders met een bipolair elektro-coagulator was kritisch voor latere competente cel zaaien waarborgen en om lekkage van media te voorkomen. Op elk punt, we ervoor gezorgd dat alle materialen en apparatuur gebruikt om de bioreactor (dat wil zeggen, een tang, buizen, flessen, kamers, schaar, adapters en connectoren) waren autoclaveerbaar, waardoor de risico's van bacteriële besmetting en het falen van vaattransplantaten voorafgaand aan de operatie verminderen genereren .
Terwijl het huidige protocol houdt veelbelovende klinische toepassingen in de cardiovasculaire diseasen, zijn er enige beperkingen zouden moeten worden verbeterd in de nabije toekomst een nog betere methode. Tot dusver werden de OSKM transcriptiefactoren ingebracht in humane fibroblasten via nucleofection. Hoewel deze techniek relatief eenvoudig en ongecompliceerd, maar ook tot variabele transfectie efficiënties op verschillende experimentele momenten. Met name kan deze inconsistentie worden opgelost door de invoering van een additionele stap van bovengenoemde neomycine selectie. Ook kan men overwegen om de vier factoren in humane fibroblasten met lentivirus integratie, die mogelijk de efficiëntie van 'herprogrammering' en verbeteren van de overleving van cellen na infectie. In termen van de bioreactor, vonden we dat volledige cellen ontdoen van de aorta kan worden bereikt met 0,075% SDS. Hoewel deze techniek als optimaal beschouwd voor cellulaire verwijdering worden vergeleken met andere detergentia (bijvoorbeeld Triton X-100), kan echter p veroorzakenotential veranderingen in de ultra-structuur van het extracellulaire matrixeiwitten 23. Dit verschijnsel rechtvaardigt dus efficiënter ontcelling strategieën om verstoring van de bijbehorende extracellulaire matrixeiwitten minimaliseren. Daarnaast hebben we ook dat de dikte van cellen ontdane aorta diameter en wand variëren muizen, afhankelijk van hun leeftijd, soort en achtergrond en veroorzaken daarom mogelijke verschillen in de stroomsnelheid en schuifspanning in bioreactoren en de verdeling van PiPSC volgende PiPSC zaaien . Dit alles moet nog worden opgehelderd.
Dit protocol hierin beschreven de productie van functionele tissue engineered enten met behulp PiPSC dat een veelbelovend potentieel voor toekomstige klinische toepassingen in stamceltherapie voor hart-en vaatziekten te houden. Dit proces dat de directe herprogrammering ene somatische lijn (fibroblasten) naar een andere (of endotheliale of gladde spiercellen) gebruikt sla pluripohang kan een manier zijn om een veilige en geschikte cellen van belang te verkrijgen zijn. Inderdaad zijn verschillende protocollen gepubliceerd het genereren van stamcellijnen uit menselijke embryo, iPS cellen en volwassen stamcellen 24-26, die echter toch voor kunnen hebben met betrekking tot hun gebruik in de kliniek beschrijven. Het is nu bekend dat PiPSC niet ontwikkelen teratomas in SCID-muizen, zodat het niet langer de zorg van tumorvorming. Bovendien, de cellen neemt aanzienlijk kortere tijd tot genereren cultuur en differentiëren 10,11 en is aangetoond dat succesvolle en functionele tissue engineered vaartuigen grafts die vergelijkbaar natieve aorta te genereren. Daarom PiPSC aanwezig als een veelbelovende bron van cellen voor de behandeling van patiënten die gepersonaliseerde celtherapie omdat fibroblasten (bijvoorbeeld van huid) kunnen worden afgeleid van een specifiek individu. De decellularised schip systeem in dit protocol zorgt voor een meer biomimetic model dat gezaaide cellen voorziet van een extracellular matrix eiwit dat meer representatief voor die van een natief aorta 11. Deze belangrijke punten zijn essentieel voor het waarborgen van de overleving, differentiatie en functie van de gezaaide cellen en weefsels engineered vaten daarna. Recente studie van Sumitran-Holgersson en collega's toonden een succesvol herstel van de populatie van een eerder ontceld ILLIAC veneuze graft van een overleden persoon voorafgaand aan de innesteling 27, dus een translationeel waarde van het huidige protocol postuleren in mensen in de nabije toekomst. Bovendien kan de ontcelde transplantaten vat goed model waarbij de rol en het gedrag van andere vasculaire celtypen die bijdragen aan weefselengineering grafts kunnen worden beoordeeld vertegenwoordigen. Dit modelsysteem in muizen kan een krachtig instrument voor toekomstige screenen van geneesmiddelen en in het ophelderen van de cellulaire en moleculaire mechanismen van vasculaire stamcelbiologie verschaffen. Samen genomen, het huidige protocol houdt veelbelovende waarde voor de toepassing ervan in Vascular tissue engineering en een doorbraak in de gepersonaliseerde geneeskunde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen tegenstrijdige financiële belangen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Fibroblasts CCL-153 | ATCC | CCL-153 | Prenatal human embryonic fibroblasts |
| ATCC F-12K Medium (Kaighn's Modification of Ham's F-12 Medium) | ATCC | 30-2004 | |
| Fetal Bovine Serum | ATCC | 30-2020 | |
| Knockout DMEM medium optimized for embryonic stem cells | Life technologies (Gibco) | 12660-012 | |
| Knockout Serum Replacement | Life technologies (Invitrogen) | 10828-028 | |
| Human Basic FGF-2 | Miltenyi Biotech | 130-093-837 | |
| alpha-MEM medium | Life technologies (Invitrogen) | 32571093 | |
| Human PDGF | R&D System | 120-HD-001 | |
| Gelatin Solution 2% | Sigma | G1393 | |
| Plasmid 20866: pCAG2LMKOSimO (SOX2, OCT4, KLF4, C-MYC) | Addgene | 20866 | |
| PvuI Restriction Enzyme | New England Biolabs | RO150S | |
| SureClean Plus | Bioline | BIO-37047 | |
| Nucelofection Kit (NHDF Kit) | LONZA | VPD-1001 | |
| Neomycin | SIGMA | G418 | |
| KL 1500 LCD, Illumination for Stereo Microscopy | SCHOTT | KL 1500 LCD | Cold light illumination for stereo microscopy |
| Nikon Zoom Steromicroscope SMZ800 | Nikon | SMZ800 | |
| Heparin sodium salt | Sigma | H3393 | |
| 10% SDS Stock Solution Molecular Biology Reagent | Severn Biotech | CAS 151-21-3 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8537 | |
| Matrigel (10mg/ml) | BD | A6661 | |
| Shaker IKA Vibrax with Shaking platform VX 7 | Jepson Bolton's, Janke&Kunkel | S32-102 | |
| Masterflex L/S Digital Pump Drive | Cole-Parmer | WZ-07523-80 | |
| Masterflex L/S 6-channel, 6-roller cartridge pump head | Cole-Parmer | EW-07519-15 | |
| Masterflex L/S large cartridges for pump head | Cole-Parmer | EW-07519-75 | |
| Masterflex platinum-cured silicone pump tubing, L/S 14, 25 ft | Cole-Parmer | WZ-96410-14 | Tubing goes through the peristaltic pump |
| 0.5mm ID, 0.8 mm OD Silicone Tubing | SILEX | N/A | Tubings connect incubation chamber, media reservoir and compliance chamber |
| Fitting Reducer 0.5 to 1.6, natural Polypropyline | Ibidi | 10829 | Adapter connect above two types of tubings |
| 1/32" Tubing, ID 0.01" (250µm) Material: PEEK | LabSmith | T-132-010P | Tubing through the incubation chamber wall which connects the graft with outside tubing |
| One-Piece Fittings | LabSmith | T-132-100 | Fix the above tubings through the incubation chamber wall |
| Nylon tubes (OD 0.9mm, ID 0.75mm) | Smiths Medical | N/A | Tubings insert into two ends of the aorta graft |
| NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl mouse | Charles River | ||
| Surgical sutures, 8-0 silk | ETHICON | W819 | |
| Hypnorm | Vetapharm | Vm21757/4000 | Neuroleptanalgesic for use in mice |
| Hypnovel (Midazolam) | Roche | 59467-70-8 | Induction of anaesthesia |
| Dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 | |
| Nylon Tubing | Portex LTD | 800/200/100/200 | 0.65 mm in diameter and 1 mm in length; to make artery cuff |
| Electrocoagulator | Martin | SN 54.131 | Ligation of artery branches on aorta |
| Bipolar micro hemostat forceps | Martin | 80-91-12-04 | Fixation of vessel ends |
| Vessel Dilator | S&T | JFX-7 | |
| Vessel Dilator | S&T | JFL-3dZ | |
| Vessel Dilator | S&T | D-5aZ | |
| Mini applier | AESCULAP | FE572K | |
| Micro hemostats clips | AESCULAP | FE720K | |
| Surgical sutures, 6-0 VICRYL | ETHICON | V489 |
References
- Kurobe, H., Maxfield, M. W., Breuer, C. K., Shinoka, T. Concise Review: Tissue-Engineered Vascular Grafts for Cardiac Surgery: Past, Present, and Future. Stem Cells Transl Med. 1 (7), 566-571 (2012).
- Jonas, R. A., Freed, M. D., Mayer, J. E. Jr Long-term follow-up of patients with synthetic right heart conduits. Circulation. 72, II77-II83 (1985).
- Heureux, N., et al. Technology insight: the evolution of tissue-engineered vascular grafts-from research to clinical practice. Nat Clin Pract Cardiovasc Med. 4, 389-395 (2007).
- Zhang, W. J., Liu, W., Cui, L., Cao, Y. Tissue engineering of blood vessel. J Cell Mol Med. 11, 945-957 (2007).
- Cearbhaill, E. D., et al. Response of mesenchymal stem cells to the biomechanical environment of the endothelium on a flexible tubular silicone substrate. Biomaterials. 29, 1610-1619 (2008).
- Gong, Z., Niklason, L. E. Small-diameter human vessel wall engineered from bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSCs). FASEB J. 22, 1635-1648 (2008).
- Wong, M. M., et al. Over-expression of HSP47 augments mouse embryonic stem cell smooth muscle differentiation and chemotaxis. PLoS One. 9 (1), e86118 (2014).
- Park, S. W., et al. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells into functional CD34+ progenitor cells by combined modulation of the MEK/ERK and BMP4 signaling pathways. Blood. 116, 5762-5772 (2010).
- Samuel, R., et al. Generation of functionally competent and durable engineered blood vessels from human induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 12774-12779 (2013).
- Margariti, A., et al. Reprogramming of fibroblasts into endothelial cells capacble of angiogenesis and reendothelialization in tissue-engineered vessels. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 13793-13798 (2012).
- Karamariti, E., et al. Smooth muscle cells differentiated from reprogrammed embryonic lung fibroblasts through DKK3 signaling are potent for tissue engineering of vascular grafts. Circ Res. 112, 1433-1443 (2013).
- Udelsman, B., et al. Development of an operator-independent method for seeding tissue-engineered vascular grafts. Tissue Eng Part C Methods. 17 (7), 731-736 (2011).
- Cearbhaill, E. D., Murphy, M., Barry, F., McHugh, P. E., Barron, V. Behavior of human mesenchymal stem cells in fibrin-based vascular tissue engineering constructs. Ann Biomed Eng. 38 (3), 649-657 (2010).
- Wong, M. M., et al. Macrophages control vascular stem/progenitor cell plasticity through tumor necrosis factor-α-mediated nuclear factor-κB activation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (3), 635-643 (2014).
- Wong, M. M., et al. Sirolimus stimulates vascular stem/progenitor cell migration and differentiation into smooth muscle cells via epidermal growth factor receptor/extracellular signal-regulated kinase/β-catenin signaling pathway. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (10), 2397-2406 (2013).
- Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Three-dimensional cell culture matrices: State of the art. Tissue Eng Part B Rev. 14, 61-86 (2008).
- Hung, H. S., Hsu, S. H. Current Advances of stem cell-based approaches to tissue-engineering vascular grafts. OA Tissue Engineering. 1 (1), 2 (2013).
- Quint, C., et al. Decellularized tissue-engineered blood vessel as an arterial conduit. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (22), 9214-9219 (2011).
- Zhang, X., Xu, Y., Thomas, V., Bellis, S. L., Vohra, Y. K. Engineering an antiplatelet adhesion layer on an electrospun scaffold using porcine endothelial progenitor cells. J Biomed Mater Res A. 97 (2), 145-151 (2011).
- Hibino, N., et al. Evaluation of the use of an induced puripotent stem cell sheet for the construction of tissue-engineered vascular grafts. J Thorac Cardiovasc Surg. 143 (3), 696-703 (2012).
- Zhao, J., et al. A novel strategy to engineer small-diameter vascular grafts from marrow-derived mesenchymal stem cells. Artif Organs. 36 (1), 93-101 (2012).
- Tsai, T., et al. Contribution of stem cells to neointimal formation of decellularized vessel grafts in a novel mouse model. Am J Pathol. 181 (1), 362-373 (2012).
- Kasimir, M. T., et al. Comparison of different decellularization procedures of porcine heart valves. Int J Artif Organs. 26 (5), 421-427 (2003).
- Stephenson, E., et al. Derivation and propagation of human embryonic stem cell lines from frozen embryos in an animal product-free environment. Nature Protocols. 7, 1366-1381 (2012).
- Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nature Protocols. 2, 3081-3089 (2007).
- McCall, F. C., et al. Myocardial infarction and intramyocardial injection models in swine. Nature Protocols. 7, 1479-1496 (2012).
- Olausson, M., et al. Transplantation of an allogeneic vein bioengineered with autologous stem cells: a proof-of-concept study. Lancet. 380 (9838), 230-237 (2012).
