Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצר שתלי כלי רקמה מהונדסת, כי הם פונקציונליים להשתלה לעכברים על ידי זריעה כפולה תאי גזע pluripotent מושרה באופן חלקי (PiPSC) - נגזר תאי שריר חלק וPiPSC - תאי האנדותל נגזרו על bioreactor פיגום כלי decellularized.
Introduction
הבנייה של צינורות כלי דם היא אסטרטגיה בסיסית לתיקון כירורגי של כלי נפגעו ונפצעו כתוצאה ממחל לב וכלי דם. עד כה, חומרי שתל המשמשים בניתוחים כוללים ביולוגית פולימרים סינטטיים (polytetrafluoroethylene [טפלון], polytetrafluoroethylene המורחב [ePTFE; גור-Tex] או terephthalate פוליאתילן [דקרון]), allografts, רקמת אוטולוגי (קרום הלב או וריד saphenous) וxenografts 1. בעוד שתלי מלאכותיים (למשל, גורטקס ודקרון) הם נפוצים ביותר, חומרים אלה עלולים לגרום לסיבוכים לטווח קצר וארוך רבים הכוללים היצרות, בתצהיר סידן, thrombo-אמבוליזציה וזיהומים. למרות שמטופלים עם שתלים ביולוגיים נוכחי עם ירידה באירועי thrombo-תסחיפים, הם עדיין נתקלים במגבלות כגון אי ספיקה משנית שתל ועמידות מקוצרת בשל הסתיידות השפלה 2. לכן, למרות שיפור המשמעותי בt כירורגיתechniques במשך השנים, החוקרים וקלינאים עדיין עמוס עם הצורך בזיהוי הצינור האידיאלי למחלות לב וכלי דם. לאחרונה, תחום המחקר של הנדסת רקמות כלי דם יצר מושג שבו תאים משולבים פיגומים מתכלים, במטרה ליצור סביבת biomimetic שמגלמת כלי פונקציונלי להשתלה מוצלחת 1. ביסודו, הצלחתו של בונה כלי הדם תלויה בשלושה מרכיבים חיוניים; תאים המרכיבים את הפיגום, כלומר, שכבה פנימית של תאי האנדותל ושכבת תאי שריר חלק, פיגום המכיל המטריצה תאית המתאימה כדי לספק תכונות מכאניות דומות לכלי הדם המקומיים, ואיתות המולקולרית / סלולרית שנדרש לייזום / ויסות תיקון.
patency שתל לטווח ארוך ופיתוח מתמשך של הניאו-רקמות תלויים מאוד בזריעת תאים יעילה של פיגומים, הereby טיוח ההחלטה של סוג תא חשיבות קריטית. מספר דיווחים להדגים את השימוש באנדותל הבוגר ותאי שריר חלק ממקורות שונים לפתח צינורות בקוטר קטן 3-6. למרות מבטיח, חוסר כלי אוטולוגי מספיק כדי להשיג אנדותל הבוגר ותאי שריר חלק יישארו נטל ניכר. לאחרונה, תאי גזע ממקורות שונים שנוצלו עבור יישומי הנדסת רקמות וכלי דם. תאים אכן, תאי גזע pluripotent מגוון של סוגי תאי גזע כוללים תאי גזע עובריים 7, מושרה (iPSCs) 8,9, PiPSC 10,11, נגזר מח עצם mononuclear 12, בתאי גזע mesenchymal 13, ותאי האנדותל וקיר כלי למבוגרים -derived תאי גזע אנטיגן-1 (SCA-1) + תאי גזע / אב 14,15 כולם הודגמו להיות מסוגל בידול לתאי האנדותל או פונקציונלי או שריר חלק בתגובה לתקשורת מוגדרת ותנאי תרבות. יתר על כן, יכולת התחדשות עצמית בלתי מוגבלת של תאי הגזע להפוך אותם מועמדים טובים יותר בניגוד לאנדותל הבוגר ותאי שריר חלק שיכול רק לחלק למספר מוגבל של פעמים לפני שעברו למעצר צמיחה והזדקנות.
הבחירה של חומר פיגום כדי ליצור כלי רקמות מהונדס מוצלחות להשתלה תלויה במספר גורמים כגון biocompatibility, תכונות ביו-מכאניות, ושיעור ההתכלות. ביסודו, חומרים המשמשים ליצור פיגומים לשתלים צריכים להיות מתכלה ולא הר תגובות חיסוני נמען מיותר. בנוסף, הוא חייב להקיף נקבוביות מתאים ומייקרו עבור קובץ מצורף תא והישרדות שלאחר מכן. עד כה, החומרים הנפוצים ביותר בשימוש לפיגומים בהנדסת רקמות וכלי דם כוללים פולימרים של חומצות polyglycolic, חומצת polylactic, וε-caprolactone פולי 16. לאחרונה, יש לי חומרים ביולוגיים decellularizedגם יושם בהצלחה מסוימת. מספר מעבדות הראו כי זריעה אנושית decellularized, כלבים או כלי החזיריים עם תאי אוטולוגי סיפקה שתל ביולוגי שהתנגד קרישה והיפרפלזיה intimal 17-19. אסטרטגיות אחרות בהנדסת רקמות וכלי דם כוללות שתלים תאיים כלי דם המבוססים על חלבוני מטריצה למשל, זריעת תאים בג'ל הפיברין 13 וגיליונות תא יצירה ללא תמיכת פיגום 20, 21.
הפרוטוקול הנוכחי מדגים את הבידול של PiPSC האנושי לאנדותל הפונקציונלי ותאי שריר חלק, הדור של bioreactor המורכב מפיגום כלי decellularized נמל תאי כלי דם נגזר PiPSC פונקציונליים, והשתלה של כלי הרקמה מהונדסות לכשל חיסוני משולב חמור (SCID עכברים). PiPSC הוא סוג תא אופטימלי לשימוש עבור הנדסת רקמות של שתלי כלי משום שתאים אלה לא יוצרים גידולים בעכברים או להעלות אתי ותגובות allo-חיסונית. יתר על כן, יש לנו הראינו כי האסטרטגיה ליצירת פיפס-אנדותל תאים ופיפס חלק תאי שריר היא יעילה והשחזור 10,11. לאחר מכן, מתכננים כלי decellularized לזריעה של תאי כלי דם נגזר PiPSC לחקות באופן הדוק חלבוני מטריצה שקיים בתוך כלי ילידים, וכך לשפר את יעילות השתלה והישרדות. יתר על כן, decellularization של כלי לפני זריעת PiPSC מונע ההתרחשות של תגובות דלקתיות רכובים על ידי סוגי תאים חיסוניים כגון מקרופאגים. יותר מכך, פרוטוקול זה לא רק מייצג מתודולוגיה כדי ליצור מבטיח צינורות כלי דם לתרגום לבני אדם, אלא גם מספק אמצעי רב ערך של לימוד והבנת המנגנונים המולקולריים השולטים בהתחדשות רקמת כלי דם באמצעות מודלים עכבר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
לבצע את כל הניסויים בבעלי החיים על פי פרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לשימוש וטיפול בחי מעבדה.
1. הכנת תרבות מדיה
- הפוך תקשורת ותרבות לשורת תאי פיברובלסטים אנושית CCL-153: F-12K בינוני, 10% בסרום שור עוברי (FBS) ו -100 U / ml פניצילין וסטרפטומיצין.
- הפוך תכנות מחדש מדיה עבור דור PiPSC: בינוני הנשר שונה של Knockout Dulbecco (DMEM) המכיל 20% החלפת סרום Knockout, 0.1 מ"מ β-mercaptoethanol, 0.1 מ"מ המינימלי בינוני (MEM) שאינו חיוני חומצות אמינו, 10 ng Essential / בסיסי פיברובלסטים Growth Factor מיליליטר 2 / פניצילין (bFGF-2) ו- 100 מיליליטר U וסטרפטומיצין. להוסיף bFGF-2 טרי בכל פעם לפני השימוש באמצעי התקשורת.
- בידול לעשות בידול מדיה (DM) כדי לעורר תאי שריר חלק (SMC): α-ממ מדיה המכילה 10% FBS, גורם גדילה 0.1 מ"מ β-mercaptoethanol, 100 U / ng פניצילין וסטרפטומיצין ו -25 מיליליטר / מיליליטר נגזר טסיות הדם(PDGF-ββ).
- הפוך האנדותל בידול מדיה (EC-DM) כדי לעורר תאי אנדותל בידול (EC): צמיחת האנדותל תקשורת-2 (EGM-2) מדיה המכילה 50 ng / ml כלי דם האנדותל Growth Factor (VEGF) ו- 100 U / ml פניצילין וסטרפטומיצין.
2. Fibroblasts תכנות מחדש האנושי לתאי גזע pluripotent חלקית מושרים (PiPSC)
- שורת תאי פיברובלסטים אנושית תרבות CCL-153 בצלוחיות מצופים פתרון ג'לטין 0.04% במדיום התרבות.
- תאי מעבר כל 3 ימים ביחס של 1: 6. השתמש בתאים לפני המעבר 9 ליעילות אופטימלית של דור PiPSC. תאים מוכנים transfection עם הגיע 80 - confluency 90%.
- Linearize pCAG2LMKOSimO פלסמיד polycistronic המכיל 4 גורמי תכנות מחדש גורם שעתוק 4 (Oct4) מחייב octamer, Sox2, גורם כמו-Kruppel 4 (KLF4) ו- C-MYC (pCAG-OSKM). לעכל 5 מיקרוגרם של פלסמיד עם 5 יחידות של אנזים הגבלת PvuI במשך 3 שעות על 37 מעלות צלזיוס. לטהרפלסמיד עם ערכה מסחרית על פי הפרוטוקול של היצרן.
- Transfect 2 x 10 6 fibroblasts אדם עם 4 מיקרוגרם של פלסמיד pCAG-OSKM לינארית על ידי electroporation עם ערכת פיברובלסטים עור האנושיים nucleofection (NHDF) על פי הפרוטוקול של היצרן. בעדינות תאי זרע transfected על 0.04% בקבוק T25 מראש ג'לטין מצופה המכיל 5 מיליליטר של תכנות מחדש Media מראש חימם.
- לאחר 24 שעות, לשנות בינוני עם תוספים של 25 מיקרוגרם / מיליליטר נאומיצין כדי לבחור אוכלוסייה טהורה של תאי transfected.
- שנה בינונית בכל יום אחר, עד שיום 4.
הערה: fibroblasts אדם הפך PiPSC לאחר 4 ימים של תכנות מחדש.
3. בידול של PiPSC להאנדותל ותאי שריר חלק
- PiPSC זרע על מנות מצופים מראש IV קולגן המכילות DM במשך 4 ימים כדי לגרום להתמיינות לSMCs. שנה בינונית בכל יום אחר, עד שיום 4.
- PiPSC זרע על קולגן IV ג מנות מצופים מראשontaining אנדותל-DM במשך 6 ימים כדי לגרום להתמיינות לתאי אנדותל. שנה בינונית בכל יום אחר, עד שיום 6.
4. decellularized אב העורקים שתל הכנה
הערה: כל הפתרונות והציוד צריכים להיות סטרילי.
- להקריב את העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם ולתקן את העכבר במצב שכיבה תחת מיקרוסקופ לנתיחה.
- לחתוך את עצם החזה וסביב כלוב הצלעות כדי לפתוח את חלל בית החזה. הסר את הלב, ריאות והוושט כדי לחשוף את אב העורקים. הוצא בעדינות את שומן פרי אב העורקים עם מלקחיים.
- חותך את אב העורקים מהקצה הקדמי עם מספריים ובעדינות להחזיק את הקצה עם מלקחיים בוטים. לנתק את אב העורקים מעמודת עמוד השדרה מאחור על ידי נתיחה בוטה. לסגור היטב את כל העורקים מסתעפים מאב העורקים על ידי קשירה עם electrocoagulator דו קוטבי וחיתוך מהקצה הרחוק של קשירה עם מספריים.
- השתמש במזרק 5 מיליליטר לשטוף את לומן אב העורקים עם 3 מ 'l של תמיסת מלח המכילה של הפרין 100 U כדי למנוע היווצרות קרישי דם.
- חותך את הקצה האחורי של אב העורקים לפני שהסניפים לכליות. שמירה על השלמות של אב העורקים היא מאוד חשובה במהלך ההליך כולו.
- לשטוף את לומן אב העורקים עם 5 מיליליטר של תמיסת 0.075% סולפט dodecyl נתרן (SDS) בדילול מלא בופר פוספט (PBS).
- משרים את אב העורקים החזי ב0.075% SDS פתרון בצלחת פטרי 10 סנטימטרים. מניחים את צלחת פטרי על שייקר מסלולית לשעה 2 ב 150 סל"ד ב RT.
- לשטוף את לומן אב העורקים עם 5 מיליליטר של PBS.
- משרים את אב העורקים בPBS בצלחת פטרי 10 סנטימטרים. מניחים את צלחת פטרי בייקר מסלולית לשעה 2 ב 150 סל"ד ב RT. רענן PBS כל 20 דקות.
- לשטוף את לומן אב העורקים עם 5 מיליליטר של PBS.
- שמור שתל אב העורקים decellularized PBS ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע.
5. Dual זריעה של PiPSC וBioreactor אוויר
הערה: כל הפתרוןים וציוד צריך להיות סטרילי. לבצע את כל הפעולות בברדס בתרבית רקמה.
- להרכיב את זרימת bioreactor המעגל כפי שמודגם באיור 1. חבר תא דגירה, מאגר המדיה, משאבת peristaltic וקאמרית עמידה בצינורות. נפח מינימאלי של המדיום הדרוש למחזור הוא 40 מיליליטר.
- תנאי מוקדם כלי decellularized עם מדיום תרבות על ידי שריה באב העורקים הבינוני DM בצלחת פטרי 10 סנטימטרים. מניחים את צלחת פטרי בייקר מסלולית עבור שעה 1 ב 50 סל"ד ב RT.
- הכנס צינורות ניילון אורך 1 סנטימטר (0.9 מ"מ OD, מ"מ ID 0.75) לשני הקצוות של כלי השיט decellularized תחת מיקרוסקופ. לקשור את הכלי וצינורות עם 8-0 תפרי משי.
- להרכיב שתל אב העורקים decellularized בתא הדגירה על ידי חיבור צינורות ניילון עם יציאות כניסה ויציאה (1/32 "צינורות) מקיר התא. לשמור על תא דגירה עם 5mls של מדיום בכל פעם.
- Trypsinize PiPSC על ידי הוספה מראש התחממתיטריפסין כדי לכסות את המנה התרבות ונער בעדינות את הצלחת 10 פעמים. מחק את טריפסין ולהשאיר את הצלחת בחממה במשך 2-3 דקות. הוסף בינוני תרבות המחוממת מראש בצלחת ומערבבים בינוניים עם התאים.
- ספירת מספר תאים באמצעות hemocytometer. צנטריפוגה שני aliquots של השעיות תא המכילות 5 x 10 5 תאים כל אחד במשך 5 דקות ב 300 x גרם. לשאוב supernatant לחלוטין.
- לאחר aspirating supernatant לחלוטין, resuspend גלולה 1 של כדורי תא פיפס ב -50 μl של DM. להזריק השעיה תא זה ללומן כלי decellularized.
- לאחר מכן, resuspend תא גלולה פיפס האחר בMatrigel של 100 μl. בזהירות פיפטה את התערובת על שתל אב העורקים decellularized.
- חכה במשך 10 - 15 דקות עד שהתערובת הופכת למדינה כמו ג'ל ובאופן שווה עוטף את פני השטח החיצוניים הכלי. למלא את תא הדגירה עם DM.
- מניחים את כל bioreactor הגדרה ב5% CO 2 באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס. באופן ידני לסובב את שתל decellularized 90 ° סביב ציר האורך כל חצי שעה בשעה 2 הראשונה.
- שמור תרבות סטטית עבור 12 שעות כדי לאפשר הידבקות תא.
- לספק DM באמצעות לומן על ידי משאבת peristaltic לגרום להתמיינות תאי שריר חלק. התחל קצב זרימה ראשוני בשעה 5 מיליליטר / דקה ועלייה בשלבים עד 20 מיליליטר / דקה מעל 24 שעות.
- שמור את קצב זרימה הבינוני במחזור של 20 מיליליטר / דקה למשך 24 שעות.
- עצור את הזרימה בינונית ולהעביר את bioreactor יציאה של החממה.
- Re-זרע לומן של השתל עם PiPSC. Trypsinize, לספור ו צנטריפוגות 1 x 10 6 PiPSC כמו בשלבים 5.5-5.6. Resuspend התאים 50 μl של EGM-2 בינוניים מכיל 50 ng / ml VEGF. להזריק את תערובת התאים לתוך לומן של השתל.
- לשנות את המדיום בתא הדגירה וכל מחזור לEGM-2 בינוניות מכיל 50 מיליליטר VEGF / ng לגרום להתמיינות אנדותל.
- הזז את bioreactor שוב את הגדרת החממת דואר. באופן ידני לסובב את השתל 90 ° כל 30 דקות בשעה 2 הראשונה ולאחר מכן לשמור על תרבות סטטית עבור 12 שעות.
- התחל במחזור הזרימה בין 5 מיליליטר / דקה ועלייה בשלבים ל -35 מיליליטר / דקה. שמור את קצב הזרימה ב 35 מיליליטר / דקה במשך 5 ימים. שינוי במחזור והתא בינוני בכל יום אחר.
- לקצור את השתל המהונדס להשתלה נוספת לעכבר.
6. הארכת כפול זרע PiPSC השתל לתוך עכברים
- SCID השימוש NOD.CB17-Prkdc / עכברי זכרי NcrCrl כמקבלי שתל כלי. תמיד להבטיח שהעכברים כ -10 שבועות, שוקלים בערך 25 - 35 גרם, ונמצאים במצבים בריאותיים טובים.
- הרדימי עכבר נמען על ידי מתן שילוב של Hypnorm (25 מ"ג / קילוגרם) וHypnovel (25 מ"ג / קילוגרם) intraperitoneally. החל משחת עיני וזלין על עיניים כדי למנוע יובש ואילו בהרדמה. לאשר הרדמה יעילה על ידי הבטחה שיש לי עכברים שרירים רגועים ונושמים בהתמדה.
- תקן את העכבר במצב שכיבה עם צווארה המגולח ומורחב. לנהל סולפט אטרופין (1.7 מ"ג / קילוגרם) בשילוב עם חומרי ההרדמה על מנת להבטיח כי בדרכי הנשימה העכבר נשארה ברורות.
- הכן חתך קו האמצע מהלסת התחתונה לעצם החזה של העכבר. תחת מיקרוסקופ לנתח עם 5 להגברה של פי 10, להרים את בלוטות רוק תקין רוחבית ולהסיר את השרירים cleidomastoid זכות לחשוף את עורק התרדמה המשותף תקין.
- בעדינות להסיר רקמות המצורפות לגייס את עורק התרדמה המשותף הימני מהקצה הדיסטלי לקראת הסוף הפרוקסימלי. ולקשור את החלק האמצעי של עורק התרדמה המשותף פעמיים עם תפר משי 8-0 ולנתח בין שני הקשרים.
- עובר דרך שרוול עשוי מצינור ניילון autoclavable בכל קצה ספינה ולתקן כל קצה עם מהדק microhemostat.
- הסר עניבת תפר בקצה אחד ולהחיל ירידה של הפרין (100 U / ml). מייד לאחר מכן, להפוך את הקצה הדיסטלי של העורק דואר כדי לכסות את כל גוף השרוול ולתקן את הספינה ההפוכה עם תפר 8-0 משי לשרוול.
- חזור על אותו ההליך לחלק האחר של העורק. עורק סומק עם תמיסת מלח כדי להסיר קרישי דם.
- שתל שתל כלי decellularized בין שני קצוות של עורק התרדמה על-ידי החלקת קצות כלי decellularized של מעל אזיקי העורק ולתקן את זה עם 8-0 תפרי משי. הסר מלחציים כלי דם משני מסתיים לפני הערכת הפעימה של השתל.
- הנח את בלוטת רוק הזכות חזרה למקומו המקורי. סגור את העור על המיקום כירורגית עם תפר שהופסק באמצעות תפר 6-0 polyglactin.
- באופן עקבי לשמור סימנים חיוניים של עכבר לאחר ההליך הושלם, עד שיתחדש תודעה. להקריב את עכברי נמען באמצעות שתלי נקע וכלי קציר צוואר רחם או hr 24 או 3 שבועות מאוחר יותר לניתוח נוסף.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הדור המוצלח של PiPSC אושר 4 ימים לאחר nucleofecting fibroblasts אדם עם פלסמיד pCAG2LMKOSimO ינארית ביצוע 4 גורמי שעתוק, Oct4, Sox2, KLF4 וc-MYC (OSKM). PiPSC מוצג פנוטיפ ניכר מובהק בהשוואה לfibroblasts (איור 2 א) והביע גורמי תכנות מחדש 4 בmRNA (איור 2) וחלבון רמות (איור 2 ג) 10. היעילות של שתל כלי דם המבוסס על PiPSC תלויה מאוד ביכולת של PiPSC להתמיין לשתי שושלות שריר אנדותל וחלקות. לכן זה קריטי כדי לאשר מאפיינים אלה של PiPSC במבחנה תוך הבחנת התאים בתקשורת מוגדרת לפני השימוש בהם כדי ליצור שתלי כלי. איור 3 מציג את היכולת של PiPSC להתמיין לתאי האנדותל פונקציונליים בשני גנים (איור 3 א) וחלבון ( lev איור 3-D)אלס, המבוסס על סמנים האנדותל ספציפי 10. באופן דומה, PiPSC גם מסוגל להתמיין לשושלת שריר החלק בתגובה לתקשורת הספציפית (איור 3E-H) 11.
decellularization אב העורקים כל הושג על ידי טיפול עם SDS, חומרי ניקוי anionic שlyses תאים וsolubilizes רכיבי cytoplasmic. לאחר 2 שעות של טיפול, אב העורקים decellularized הופיעו כפיגום acellular שקוף בהשוואה לאב עורקים טרי שנקטפו (איור 4 א-B) 22. ערכה היסטולוגית באיור 4C-F ממחישה את היעדר גרעינים או הכתמת cytoplasmic בכלי decellularized, אבל לא באב עורקי עכבר הרגיל. בעקבות זריעה כפולה של אנדותל נגזר PiPSC ותאי שריר חלק בתוך aortas decellularized, שתלי כלי הדם המהונדסים להציג מאפייני תא שריר אנדותל וחלק בהתאמה. צביעת Hematoxylin ו eosin (HE) של דו-יםשתלי eeded חשפו ארכיטקטורה דומה לזה של כלי ילידים (איור 4G) עם מספר שכבות של תאי שריר חלק וmonolayer של תאי האנדותל כפי שאושר על ידי צביעה חיובית לשריר-22α חלקים (SM22), אקטין שריר-α החלק (SMA) , CD31 וסמני CD144 בהתאמה (איור 4H-M) 11.
כדי לאשר את patency של כלי הרקמות המהונדסים in vivo, כלי נגזרים PiPSC זרע הכפול היו מורכבים לעכברים - שניהם עכבר נורמלי ועורקי decellularized שמשו כקבוצת ביקורת. ניתוח נוסף הראה כי בעוד שעכברים מורכבים עם כלי decellularized מוצגים עם שיעורי תמותה גבוהים יותר במידה ניכרת כבר ביום 1, שתלי כלי PiPSC העניקו שיעור הישרדות של 60% 3 שבועות לאחר ההשתלה (איור 5 א) 11. בנוסף, שתלים נגזרים PiPSC בן 3 שבוע התאפיינו באופן מלא את קיומו של האנדותל נגזר PiPSC אדם ו תאי שריר חלק וחדירת מקרופאג המארח (איור 5 ולוח 1) 11. יחדיו, תוצאות מצביעות על כך שPiPSC יש את היכולת להתמיין לשתי שושלות של כלי הדם, והם חזקים ליצירת כלי רקמות מהונדסות פונקציונליים שיכול להחליף כלי יליד in vivo.
איור 1. ייצוג סכמטי של זרימת bioreactor שתל מעגל decellularized. שתל כלי decellularized מורכב בתא הדגירה. משאבת peristaltic היא במעלה הזרם של תא הדגירה כדי לספק זרימת זלוף בינונית יציבה. מאגר המדיה הוא במורד הזרם של תא הדגירה. תא הציות הוא לשפר את זרימת המשטר. כיוון הזרימה הוא מסומן על ידי חצים."Target =" large.jpg _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. דור של PiPSC מfibroblasts האנושי. Fibroblasts אדם היה nucleofected עם או ארבעה גני תכנות מחדש (Oct4, Sox2, KLF4 ו- C-MYC) או וקטור ריק (שליטה). תמונות בניגוד שלב () מראות את המורפולוגיה של פיפס לאחר 4 ימים. PiPSC הביע כל ארבעת גורמי השעתוק, הן בmRNA (B) ורמות חלבון (C). בר סולם לתמונות המוצגים הוא 50 מיקרומטר והנתונים הם ממוצעי ± SEM (n = 3); * P <0.05, *** P <0.001. נתון זה שונה מMargariti, א אל et. 10 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. </>
איור 3. PiPSC יכול להתמיין לשני תאי שריר אנדותל וחלק. תאי PiPSC או שליטה הובדלו לתאי אנדותל. (א) בהשוואה לתאים לשלוט, PiPSC המופק בתאי האנדותל הביע סמנים האנדותל ספציפית כגון CD31, CD144, קולט תחום הוספת קינאז (KDR), synthase אנדותל תחמוצת חנקן (eNOS) וגורם פון Willebrand (vWF) בmRNA רמה. (ב) זו אושרה ברמת החלבון באמצעות ניתוח כתם מערבי. (C) מכתים Immunofluorescence הצביע צביעה חיובית של CD144 (VE-cadherin) בPiPSC-אנדותל, אך לא הושג שליטת תאים. (ד) זרימת ניתוח cytometric אישר ביטוי תא PiPSC-האנדותל של CD31 וCD144. (תאים או שליטה) קולגן IV-זרע PiPSC גם הובדלו לשריר תאים חלקים. (E, F) בניגוד לשליטה תאים, תאי שריר חלק נגזרים PiPSC הביעו סמני שרירים ספציפיים חלקים ברמת הגן, הכוללים SMA, calponin, SM22, שרשרת שרירן שריר חלק כבדה II (SMMHC), גורם תגובת סרום (SRF) , Myocardin, smoothelin, אלסטין וקולגן 1A1. (G) רמות הביטוי של SMA, calponin וSM22 בנגזרים תאי PiPSC אושרו באמצעות ניתוח כתם מערבי. צביעת Immunofluorescence (H) באמצעות מיקרוסקופ confocal הראתה צביעת סמן שריר חלק אופיינית לcalponin וSM22. הנתונים מייצגים אמצעי ± SEM (n = 3); * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001. בר סולם לתמונות המוצגות הם 25 מיקרומטר או 50 מיקרומטר. נתונים אלה שונה מMargariti, א 'ואח'. 10 וKaramariti, E. et al. 11 שימולחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
דור איור 4. של שתלי כלי דם ברקמה נגזרת PiPSC כפול זרע מהונדס. (A, B) Decellularization של אב העורקים החזי עכבר השתמר המבנה שלה ועדיין דמה לזה של ספינה רגילה, ההגדלה המקורית 2X. הכתמה (CF) HE של אב העורקים decellularized אישרה decellularization מוצלח וההסרה של תאים מלאים בהשוואה לקבוצת ביקורת, ההגדלה מקורית: 50X או 200X. הכתמה (G) HE של אנדותל נגזר PiPSC ותאי שריר חלק כלי דו-זרע חשפו ארכיטקטורה שהייתה דומה לספינה האם של. (J, M) כלי פעמיים זרע PiPSC רקמה מהונדסות המוכתמים חיובי לאנדותל (CD31 וCD144) ותאי שריר חלק (SM22 וSMA) סמנים בניגוד deceשתלי כלי llularized. (H, K) הביטוי של סמנים הנלווה של כלי דם, כמו גם את המורפולוגיה ולוקליזציה האופייניות לאנדותל נגזר PiPSC ותאי שריר חלק בתוך האזורים המדיאלי וintimal היה דומה לכלי ילידים. בר סולם לתמונות המוצגות הוא 50 מיקרומטר. נתונים אלה שונה מצאי, ט 'et al. 22 וKaramariti, E. et al. 11 אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5. שתלי כלי דם פעמיים זרע נגזר PiPSC רקמה מהונדסת הם פטנט להחלפת כלי יליד in vivo. כלי נגזרים PiPSC היו מורכבים לעורק הראשי של כשל חיסוני משולב חמור (SCID) עכברים, mou הרגילse ועורקי decellularized שמשו כקבוצת ביקורת. (א) ניתוח של עכברים מורכבים עם כלי נגזרים PiPSC הראה 60% שיעור הישרדות לאחר 3 שבועות ניתוח, ואילו עכברים מורכבים עם כלי decellularized מוצגים עם שיעורי תמותה גבוהים יותר במידה ניכרת והישרדות נמוכה יותר (20%). הנתונים מייצגים אמצעים (n = 10). (ב) כלי הרקמות מהונדסות גם נקצרו 3 שבועות לאחר השתלה ונתונים לHE (פנלים משמאל) או מכתים immunofluorescence (לוחות מימין) לנוכחות של CD144 האדם וcalponin או עכבר CD11b / CD18 (Mac-1); כימות של מכתים מסוכמת בטבלה 1. הגדלת מקורים לתמונות המוצגות היא 400X אלא אם צוין. נתון זה שונה מKaramariti, E. et al. 11 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| תאים חיוביים שדה (40X) | מהונדס-כלי לפני ההשתלה | שתל מהונדס-כלי (3 שבועות) |
| calponin | 72 ± 9 | 22 ± 11 * |
| CD144 | 20 ± 8 | 5 ± 6 * |
| Mac-1 | 0 | 71 ± 11 * |
אפיון טבלה 1. כלי רקמות מהונדסות 3 שבועות לאחר השתלה. מספר תאי אנדותל נגזר PiPSC ושריר החלק ומקרופאגים מארח היה לכמת הבא מכתים immunofluorescence עם calponin האנושי, CD144 האדם ועכבר Mac-1 בהתאמה. הנתונים מייצגים ממוצע ± SEM (n = 6); * P <0.05, הבדל משמעותי מכלי רקמות מהונדסות לפני ההשתלה. טבלה זו שונה מKaramariti, E. et al. 11
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול הנוכחי מצביע על צליל אסטרטגיה, מהירה, פשוטה, יעילה ושחזור שבו יכולים להיות שנוצרו כלי רקמה מהונדסות תפקודיים באמצעות PiPSC מfibroblasts האנושי. טכניקה זו מהווה כלי רב ערך לרפואת רגנרטיבית, הנדסת רקמות וטיפול בתאים שעלולים להיות מטופל ספציפי בעתיד הקרוב. שלבים קריטיים כדי להבטיח את היעילות של הפרוטוקול כוללים הכנת PiPSC, הכנת שתלי אב העורקים סטרילי וdecellularized באופן מלא, זריעה מוצלחת ובידול של PiPSC בפיגומים ועקרות שמירה של שתלי אב העורקים בbioreactor כלי הדם.
ליזום הדור המוצלח של שתלי רקמות מהונדסות, זה הוא בעל חשיבות עליונה כדי להבטיח כי הכנת PiPSC מתבצעת ביעילות. הפרוטוקול בהצלחה 'תכנות מחדש' שורת תאי פיברובלסטים אנושית לPiPSC באמצעות nucleofection עם פלסמיד pCAG2LMKOSimO OSKM. Survivאל של fibroblasts לאחר nucleofection מסתמך על כמה נקודות מפתח כגון שימוש בפלסמידים OSKM באיכות גבוהה, פלסמידים של ריכוזים הנעים בין 500 - 1,000 ng / μl, למנוע עיכובים בזריעה של fibroblasts מייד לאחר nucleofection כתאים רגישים במיוחד בעקבות כניסתה של פלסמידים גדולים יחסית ובסופו התוספת של FGF-2 שהוא חיוני ויש להוסיף לתקשורת מוכנה טרי רק לפני השימוש. בנוסף, מצאנו שזה היה חיוני כדי להשתמש בתאים של עד מעבר 9 כדי למנוע הזדקנות replicative, כדי להבטיח "תכנות מחדש" יעיל לPiPSC ובידול שלאחר מכן לתאי אנדותל ושריר חלק. טוהר PiPSC ניתן לשפר על ידי בחירה של תאי nucleofected עם נאומיצין. יש פלסמיד pCAG2LMKOSimO גן נאומיצין עמיד ולכן התוספת של נאומיצין בטווח של 25 מיקרוגרם / מיליליטר יום אחד לאחר nucleofection במשך 3 ימים יגרום לבחירה של אוכלוסייה טהורה שלPiPSC. להנדס כלי PiPSC יעילים להשתלה לעכברים, אנחנו נחשבים היושרה והעקרות של aortas decellularized להיות בראש סדר עדיפויות. כדי לשמור על השלמות של aortas לפני ואחרי decellularization, היה צורך להחיל כל הזמן מיומנות ידנית תוך טיפול בכלי, כפי שהיו שברירי יחסית ומשמעותי זעירים בגודל. ההסרה היעילה של רקמות ואיטום של עורקים מסתעפים באמצעות אלקטרו-coagulator דו קוטבי perivascular הייתה קריטית כדי להבטיח זריעת תאים מוסמכת שלאחר מכן, וכדי למנוע זליגה של אמצעי תקשורת. בכל נקודה, אנחנו הבטיחו כי כל החומרים ומכשירים המשמשים לייצור bioreactor (כלומר, מלקחיים, צינורות, בקבוקים, תאים, מספריים, מתאמים ומחברים) היו autoclavable, ובכך להקטין סיכונים של זיהום וכישלון של שתלי כלי דם לפני ניתוח חיידקים .
בעוד הפרוטוקול הנוכחי מחזיק יישומים קליניים מבטיחים בdise לב וכלי דםases, יש כמה מגבלות שיש לשפר בעתיד הקרוב על מנת לשפר את המתודולוגיה נוספת. עד כה, גורמי שעתוק OSKM הוכנסו fibroblasts אדם באמצעות nucleofection. בעוד טכניקה זו היא יחסית פשוטה וברורה, זה גם הביא ליעילות transfection משתנה בזמנים שונים ניסיוניים. יש לציין, חוסר העקביות הזה ניתן להתגבר על ידי החדרת צעד נוסף של בחירת נאומיצין האמורה. באופן דומה, אפשר לשקול את ההקדמה של ארבעה הגורמים לfibroblasts אדם באמצעות שילוב lentivirus, המהווה פוטנציאל להגביר את היעילות של "תכנות מחדש" ולשפר את ההישרדות של תאים בעקבות זיהום. במונחים של bioreactor, מצאנו כי decellularization של aortas המלא יכול להיות מושגים באמצעות 0.075% SDS. למרות שטכניקה זו נחשבת לאופטימלי להסרת תאים בהשוואה לחומרי ניקוי אחר (למשל, Triton X-100), זה יכול לגרום לאולם pשינויי otential בתוך אולטרה המבנים של חלבוני המטריצה תאיים 23. תופעה זו לכן מצדיקת אסטרטגיות decellularization יעילה יותר כדי למזער את ההפרעה של חלבוני מטריצת חוץ תאיים הקשורים. בנוסף, אנחנו גם נחשבו כי עובי הקוטר והקיר של aortas decellularized להשתנות בין עכברים, בהתאם לגיל, המתח והרקע שלהם, ובכך לגרום להבדלים אפשריים במהירות של זרימה ולחץ גזירה בתוך bioreactors וההפצה של PiPSC הבא זריעת PiPSC . כל זה עדיין לא הובהר.
פרוטוקול זה במסמך מתואר הדור של שתלי רקמות מהונדסות תפקודיים באמצעות PiPSC המחזיקים פוטנציאל מבטיח עבור יישומים קליניים עתידיים בטיפול בתאי גזע למחלת לב וכלי דם. תהליך זה אשר מנצל תכנות מחדש הישיר משושלת אחת סומטי (fibroblasts) למשנהו (בין אם תאי שריר אנדותל או חלקה) על ידי דילוג pluripotency עשוי להיות דרך להשיג תאים בטוחים ומתאימים לעניין. ואכן, כמה פרוטוקולים שפורסמו כדי לתאר את הדור של קווי תאי גזע מעוברי אדם, תאי iPS ותאי גזע בוגרים 24-26, אשר כולם אך עדיין להעלות סוגיות בנוגע לשימוש בם במרפאת. כיום ידוע כי PiPSC לא לפתח teratomas בעכברי SCID, ובכך מבטל את החשש של היווצרות גידול. יתר על כן, התאים לקחת זמן קצר יותר באופן משמעותי ליצירה, תרבות ולהבדיל 10,11, והוכחו לייצר שתלי כלי רקמה מהונדסות מוצלחים ופונקציונליים שדומים לaortas ילידים. לכן, PiPSC הווה כמקור תא מבטיח לטיפול בחולים באמצעות טיפול בתאים אישית כי fibroblasts (למשל, מעור) ניתן להפיק מאדם ספציפי. מערכת כלי decellularised בפרוטוקול זה מספקת מודל biomimetic יותר שמספק תאי זרע עם extracellulחלבון מטריקס ar שמייצג יותר לזה של אב העורקים יליד 11. נקודות מפתח אלה חיוניות להבטחת ההישרדות, הבידול ופונקציונליות של תאי זרע וכלי רקמה מהונדסת לאחר מכן. מחקר שנערך לאחרונה על ידי Sumitran-Holgersson ועמיתים הראה אכלוס מוצלח של שתל וריד illiac decellularized בעבר מאדם שנפטר לפני engraftment 27, ובכך לייחס להן ערך translational של הפרוטוקול הנוכחי לבני אדם בעתיד הקרוב. יתר על כן, שתלי כלי decellularized עשויים לייצג מודל טוב שבו ניתן להעריך את התפקיד וההתנהגות של סוגי תאי כלי דם אחרים שגם תורמים לשתלי רקמות מהונדסות. מערכת מודל זה בעכברים יכולה לספק כלי רב עוצמה להקרנת סמים עתיד וגם בהבהרת המנגנונים התאיים ומולקולריים מעורבים בביולוגיה של תאי גזע של כלי דם. יחדיו, הפרוטוקול הנוכחי מחזיק ערך מבטיח ליישומה בvascהנדסת רקמות ular ופריצת דרך ברפואה מותאמת אישית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אי לנו אינטרסים כלכליים סותרים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Fibroblasts CCL-153 | ATCC | CCL-153 | Prenatal human embryonic fibroblasts |
| ATCC F-12K Medium (Kaighn's Modification of Ham's F-12 Medium) | ATCC | 30-2004 | |
| Fetal Bovine Serum | ATCC | 30-2020 | |
| Knockout DMEM medium optimized for embryonic stem cells | Life technologies (Gibco) | 12660-012 | |
| Knockout Serum Replacement | Life technologies (Invitrogen) | 10828-028 | |
| Human Basic FGF-2 | Miltenyi Biotech | 130-093-837 | |
| alpha-MEM medium | Life technologies (Invitrogen) | 32571093 | |
| Human PDGF | R&D System | 120-HD-001 | |
| Gelatin Solution 2% | Sigma | G1393 | |
| Plasmid 20866: pCAG2LMKOSimO (SOX2, OCT4, KLF4, C-MYC) | Addgene | 20866 | |
| PvuI Restriction Enzyme | New England Biolabs | RO150S | |
| SureClean Plus | Bioline | BIO-37047 | |
| Nucelofection Kit (NHDF Kit) | LONZA | VPD-1001 | |
| Neomycin | SIGMA | G418 | |
| KL 1500 LCD, Illumination for Stereo Microscopy | SCHOTT | KL 1500 LCD | Cold light illumination for stereo microscopy |
| Nikon Zoom Steromicroscope SMZ800 | Nikon | SMZ800 | |
| Heparin sodium salt | Sigma | H3393 | |
| 10% SDS Stock Solution Molecular Biology Reagent | Severn Biotech | CAS 151-21-3 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8537 | |
| Matrigel (10mg/ml) | BD | A6661 | |
| Shaker IKA Vibrax with Shaking platform VX 7 | Jepson Bolton's, Janke&Kunkel | S32-102 | |
| Masterflex L/S Digital Pump Drive | Cole-Parmer | WZ-07523-80 | |
| Masterflex L/S 6-channel, 6-roller cartridge pump head | Cole-Parmer | EW-07519-15 | |
| Masterflex L/S large cartridges for pump head | Cole-Parmer | EW-07519-75 | |
| Masterflex platinum-cured silicone pump tubing, L/S 14, 25 ft | Cole-Parmer | WZ-96410-14 | Tubing goes through the peristaltic pump |
| 0.5mm ID, 0.8 mm OD Silicone Tubing | SILEX | N/A | Tubings connect incubation chamber, media reservoir and compliance chamber |
| Fitting Reducer 0.5 to 1.6, natural Polypropyline | Ibidi | 10829 | Adapter connect above two types of tubings |
| 1/32" Tubing, ID 0.01" (250µm) Material: PEEK | LabSmith | T-132-010P | Tubing through the incubation chamber wall which connects the graft with outside tubing |
| One-Piece Fittings | LabSmith | T-132-100 | Fix the above tubings through the incubation chamber wall |
| Nylon tubes (OD 0.9mm, ID 0.75mm) | Smiths Medical | N/A | Tubings insert into two ends of the aorta graft |
| NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl mouse | Charles River | ||
| Surgical sutures, 8-0 silk | ETHICON | W819 | |
| Hypnorm | Vetapharm | Vm21757/4000 | Neuroleptanalgesic for use in mice |
| Hypnovel (Midazolam) | Roche | 59467-70-8 | Induction of anaesthesia |
| Dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 | |
| Nylon Tubing | Portex LTD | 800/200/100/200 | 0.65 mm in diameter and 1 mm in length; to make artery cuff |
| Electrocoagulator | Martin | SN 54.131 | Ligation of artery branches on aorta |
| Bipolar micro hemostat forceps | Martin | 80-91-12-04 | Fixation of vessel ends |
| Vessel Dilator | S&T | JFX-7 | |
| Vessel Dilator | S&T | JFL-3dZ | |
| Vessel Dilator | S&T | D-5aZ | |
| Mini applier | AESCULAP | FE572K | |
| Micro hemostats clips | AESCULAP | FE720K | |
| Surgical sutures, 6-0 VICRYL | ETHICON | V489 |
References
- Kurobe, H., Maxfield, M. W., Breuer, C. K., Shinoka, T. Concise Review: Tissue-Engineered Vascular Grafts for Cardiac Surgery: Past, Present, and Future. Stem Cells Transl Med. 1 (7), 566-571 (2012).
- Jonas, R. A., Freed, M. D., Mayer, J. E. Jr Long-term follow-up of patients with synthetic right heart conduits. Circulation. 72, II77-II83 (1985).
- Heureux, N., et al. Technology insight: the evolution of tissue-engineered vascular grafts-from research to clinical practice. Nat Clin Pract Cardiovasc Med. 4, 389-395 (2007).
- Zhang, W. J., Liu, W., Cui, L., Cao, Y.
- Cearbhaill, E. D., et al. Response of mesenchymal stem cells to the biomechanical environment of the endothelium on a flexible tubular silicone substrate. Biomaterials. 29, 1610-1619 (2008).
- Gong, Z., Niklason, L. E. Small-diameter human vessel wall engineered from bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSCs). FASEB J. 22, 1635-1648 (2008).
- Wong, M. M., et al. Over-expression of HSP47 augments mouse embryonic stem cell smooth muscle differentiation and chemotaxis. PLoS One. 9 (1), e86118 (2014).
- Park, S. W., et al. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells into functional CD34+ progenitor cells by combined modulation of the MEK/ERK and BMP4 signaling pathways. Blood. 116, 5762-5772 (2010).
- Samuel, R., et al. Generation of functionally competent and durable engineered blood vessels from human induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 12774-12779 (2013).
- Margariti, A., et al. Reprogramming of fibroblasts into endothelial cells capacble of angiogenesis and reendothelialization in tissue-engineered vessels. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 13793-13798 (2012).
- Karamariti, E., et al. Smooth muscle cells differentiated from reprogrammed embryonic lung fibroblasts through DKK3 signaling are potent for tissue engineering of vascular grafts. Circ Res. 112, 1433-1443 (2013).
- Udelsman, B., et al. Development of an operator-independent method for seeding tissue-engineered vascular grafts. Tissue Eng Part C Methods. 17 (7), 731-736 (2011).
- Cearbhaill, E. D., Murphy, M., Barry, F., McHugh, P. E., Barron, V. Behavior of human mesenchymal stem cells in fibrin-based vascular tissue engineering constructs. Ann Biomed Eng. 38 (3), 649-657 (2010).
- Wong, M. M., et al. Macrophages control vascular stem/progenitor cell plasticity through tumor necrosis factor-α-mediated nuclear factor-κB activation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (3), 635-643 (2014).
- Wong, M. M., et al. Sirolimus stimulates vascular stem/progenitor cell migration and differentiation into smooth muscle cells via epidermal growth factor receptor/extracellular signal-regulated kinase/β-catenin signaling pathway. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (10), 2397-2406 (2013).
- Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Three-dimensional cell culture matrices: State of the art. Tissue Eng Part B Rev. 14, 61-86 (2008).
- Hung, H. S., Hsu, S. H. Current Advances of stem cell-based approaches to tissue-engineering vascular grafts. OA Tissue Engineering. 1 (1), 2 (2013).
- Quint, C., et al. Decellularized tissue-engineered blood vessel as an arterial conduit. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (22), 9214-9219 (2011).
- Zhang, X., Xu, Y., Thomas, V., Bellis, S. L., Vohra, Y. K. Engineering an antiplatelet adhesion layer on an electrospun scaffold using porcine endothelial progenitor cells. J Biomed Mater Res A. 97 (2), 145-151 (2011).
- Hibino, N., et al. Evaluation of the use of an induced puripotent stem cell sheet for the construction of tissue-engineered vascular grafts. J Thorac Cardiovasc Surg. 143 (3), 696-703 (2012).
- Zhao, J., et al. A novel strategy to engineer small-diameter vascular grafts from marrow-derived mesenchymal stem cells. Artif Organs. 36 (1), 93-101 (2012).
- Tsai, T., et al. Contribution of stem cells to neointimal formation of decellularized vessel grafts in a novel mouse model. Am J Pathol. 181 (1), 362-373 (2012).
- Kasimir, M. T., et al. Comparison of different decellularization procedures of porcine heart valves. Int J Artif Organs. 26 (5), 421-427 (2003).
- Stephenson, E., et al. Derivation and propagation of human embryonic stem cell lines from frozen embryos in an animal product-free environment. Nature Protocols. 7, 1366-1381 (2012).
- Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nature Protocols. 2, 3081-3089 (2007).
- McCall, F. C., et al. Myocardial infarction and intramyocardial injection models in swine. Nature Protocols. 7, 1479-1496 (2012).
- Olausson, M., et al. Transplantation of an allogeneic vein bioengineered with autologous stem cells: a proof-of-concept study. Lancet. 380 (9838), 230-237 (2012).
