Summary
Qui, vi presentiamo un protocollo per generare ingegneria dei tessuti dei vasi innesti che sono funzionali per l'innesto in topi con un doppio semina cellule staminali pluripotenti indotte in parte (PiPSC) - derivato cellule muscolari lisce e PiPSC - cellule endoteliali derivate su una nave decellularized ponteggio bioreattore.
Introduction
La costruzione di condotti vascolari è una strategia fondamentale per la riparazione chirurgica di vasi danneggiati e feriti derivanti da malattie cardiovascolari. Ad oggi, materiali protesici utilizzati in chirurgia includono polimeri sintetici biocompatibili (politetrafluoroetilene [Teflon], politetrafluoroetilene espanso [ePTFE, Gore-Tex] o polietilene tereftalato [Dacron]), trapianti, tessuto autologo (pericardio o vena safena) e xenotrapianti 1. Mentre innesti artificiali (ad esempio, Gore-Tex e Dacron) sono più comunemente utilizzati, questi materiali possono causare numerose complicazioni a breve e lungo termine, che includono la stenosi, deposizione di calcio, trombo-embolizzazione e infezioni. Anche se i pazienti con innesti biologici presentano diminuite eventi tromboembolici, che ancora incontrano limitazioni come ad esempio il fallimento del trapianto secondario e durata accorciata a causa di calcificazione degrado 2. Pertanto, nonostante i significativi miglioramenti in t chirurgicaechniques corso degli anni, ricercatori e clinici sono ancora gravati con la necessità di individuare il condotto ideale per le malattie vascolari. Più recentemente, il campo di ricerca di ingegneria del tessuto vascolare ha generato un concetto in cui le cellule sono incorporati in scaffold biodegradabili, con lo scopo di creare un ambiente biomimetico che esemplifica una nave funzionale per successo innesto 1. Fondamentalmente, il successo dei costrutti vascolari dipendono tre componenti essenziali; cellule che compongono il ponteggio, cioè, uno strato interno di cellule endoteliali e di uno strato di cellule muscolari lisce, un'impalcatura contenente la matrice extracellulare appropriata per fornire proprietà meccaniche paragonabili alla vascolarizzazione nativa, e la segnalazione molecolare / cellulare che è richiesto per avviare / regolazione riparazione.
Lungo pervietà dell'innesto termine e lo sviluppo sostenibile dei neo-tessuti sono altamente dipendenti semina cellulare efficace di ponteggi, thereby rendendo la decisione di tipo di cellula di importanza critica. Diverse relazioni dimostrano l'uso di cellule endoteliali mature e cellule muscolari lisce da varie fonti di sviluppare condotte di piccolo diametro 3-6. Sebbene promettenti, la mancanza di vasi autologhi sufficienti per ottenere endoteliali mature e cellule muscolari lisce rimangono un onere considerevole. Più di recente, le cellule staminali provenienti da diverse fonti sono state sfruttate per applicazioni di ingegneria dei tessuti vascolari. Cellule mononucleate Infatti, una varietà di tipi di cellule staminali comprese le cellule staminali embrionali 7, indotto cellule staminali pluripotenti (iPSCs) 8,9, PiPSC 10,11, derivate dal midollo osseo 12, cellule staminali mesenchimali 13, cellule progenitrici endoteliali della parete vasale e adulti -derived cellule staminali antigene-1 (Sca-1) + cellule staminali / progenitrici 14,15 sono stati tutti dimostrato di essere in grado di differenziarsi in cellule endoteliali sia funzionale o muscolari lisce in risposta ai media definiti econdizioni di coltura. Inoltre, la capacità di auto rinnovamento illimitata delle cellule staminali le rendono migliori candidati a differenza endoteliali mature e cellule della muscolatura liscia che può dividere solo per un numero finito di volte prima di subire l'arresto della crescita e senescenza.
La selezione del materiale per generare scaffold tessuto successo nave progettata per l'innesto dipende da diversi fattori quali la biocompatibilità, le proprietà biomeccaniche, e il tasso di biodegradazione. Fondamentalmente, i materiali usati per creare scaffold per gli innesti devono essere biodegradabili e non verranno montati destinatario inutili risposte immunitarie. Inoltre, esso deve comprendere una porosità e microstruttura adatto per il fissaggio e la sopravvivenza cellulare successiva. Ad oggi, i materiali più comuni utilizzati per ponteggi in ingegneria dei tessuti vascolari comprendono polimeri dell'acido poliglicolico, acido polilattico, e poli ε-caprolattone 16. Più recentemente, materiali biologici decellularized hannoanche state applicate con successo. Diversi laboratori hanno dimostrato che la semina umana decellularized, cane o vasi suina con cellule autologhe fornito un innesto biologico che ha resistito coagulazione e iperplasia intimale 17-19. Altre strategie di ingegneria del tessuto vascolare includono innesti vascolari extracellulari a base di proteine della matrice ad esempio, cellule semina in fibrina gel 13 e generando fogli cellulari senza supporto impalcatura 20, 21.
L'attuale protocollo dimostra la differenziazione di PiPSC umana in endoteliale funzionale e cellule muscolari lisce, la generazione di un bioreattore costituito da un ponteggio nave decellularized per porto cellule vascolari PiPSC-derivati funzionali, e l'innesto dei vasi ingegneria tessutale in grave immunodeficienza combinata (SCID ) topi. PiPSC sono un tipo di cellule ottimale da utilizzare per l'ingegneria dei tessuti di innesti per vasi, perché queste cellule non formano tumori in topi o sollevano eticorisposte allo-immunitarie. Inoltre, abbiamo dimostrato che la strategia per la generazione di cellule muscolari Pip-cellule endoteliali e semi-liscio è efficiente e riproducibile 10,11. Successivamente, abbiamo progettato una nave decellularized per la semina delle cellule vascolari PiPSC derivate per imitare da vicino le proteine della matrice che esiste all'interno di un vaso nativo, aumentando così l'innesto e la sopravvivenza di efficacia. Inoltre, la decellularization dei vasi prima PiPSC semina impedisce il verificarsi di risposte infiammatorie montati da tipi di cellule immunitarie quali macrofagi. Ancora più importante, questo protocollo non rappresenta solo un metodo per generare promettenti condotti vascolari per la traduzione in esseri umani, ma fornisce anche strumenti preziosi di studio e la comprensione dei meccanismi molecolari che regolano la rigenerazione del tessuto vascolare attraverso modelli di mouse.
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Protocol
Eseguire tutti gli esperimenti su animali secondo protocolli approvati dal Comitato istituzionale per l'uso e la cura di animali da laboratorio.
1. Preparazione della cultura media
- Fai terreni di coltura per la linea cellulare di fibroblasti umani CCL-153: F-12K Medium, siero fetale bovino 10% (FBS) e 100 U / ml di penicillina e la streptomicina.
- Fai riprogrammazione supporti per la generazione PiPSC: mezzo di Eagle modificato di Knockout Dulbecco (DMEM) contenente il 20% Knockout siero sostituzione, 0,1 mm β-mercaptoetanolo, 0.1 Minimum mM Essential Medium (MEM) non-aminoacidi essenziali, 10 ng / ml di base del fattore di crescita dei fibroblasti 2 (bFGF-2) e 100 U / ml di penicillina e streptomicina. Aggiungi bFGF-2 al momento ogni volta prima di usare i media.
- Rendere Differenziazione media (DM) per indurre cellule muscolari lisce (SMC) differenziazione: α-MEM supporti contenente 10% FBS, 0,1 mM β-mercaptoetanolo, 100 U / ml penicillina e streptomicina e 25 ng / ml Platelet Derived Growth Factor(PDGF-ββ).
- Fai endoteliale Differenziazione media (CE-DM) per indurre cellule endoteliali (EC) differenziazione: crescita endoteliale media-2 (EGM-2) supporto contenente 50 ng / ml Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) e 100 U / ml di penicillina e la streptomicina.
2. fibroblasti umani Riprogrammare in Parzialmente-cellule staminali pluripotenti indotte (PiPSC)
- Culture linea cellulare di fibroblasti umani CCL-153 0,04% su fiasche rivestite soluzione di gelatina in mezzo di coltura.
- Cellule Passage ogni 3 giorni con un rapporto di 1: 6. Utilizzare le cellule prima del passaggio 9 per l'efficienza ottimale di generazione PiPSC. Le cellule sono pronte per la trasfezione upon raggiunge l'80 - 90% di confluenza.
- Linearizza pCAG2LMKOSimO plasmide policistronica contenente 4 fattori di riprogrammazione ottamero vincolante fattore di trascrizione 4 (OCT4), SOX2, fattore Kruppel-like 4 (Klf4) e C-MYC (pCAG-OSKM). Digest 5 mg di plasmide con 5 unità di enzima di restrizione Pvul per 3 ore a 37 ° C. Purificareil plasmide con un kit commerciale secondo il protocollo del produttore.
- Trasfettare 2 x 10 6 fibroblasti umani con 4 mg di linearizzato pCAG-OSKM plasmide di elettroporazione con kit di fibroblasti del derma umano (NHDF) nucleofection secondo il protocollo del produttore. Sementi delicatamente cellule trasfettate sul pre 0,04% di gelatina rivestito pallone T25 contenente 5 ml di pre-riscaldato Riprogrammazione media.
- Dopo 24 ore, cambiare mezzo con supplementi di 25 mg / ml neomicina per selezionare una popolazione pura di cellule trasfettate.
- Cambiare medio a giorni fino al giorno 4.
Nota: fibroblasti umani diventano PiPSC dopo 4 giorni di riprogrammazione.
3. Differenziazione dei PiPSC in endoteliali e cellule muscolari lisce
- PiPSC Seed su piatti collagene IV pre-rivestite contenenti DM per 4 giorni di indurre la differenziazione in SMC. Cambiare medio a giorni fino al giorno 4.
- PiPSC Seed sul collagene IV pre-rivestite piatti containing endoteliale-DM per 6 giorni per indurre il differenziamento in cellule endoteliali. Cambiare medio a giorni fino al giorno 6.
4. decellularized Aorta Graft Preparazione
Nota: Tutte le soluzioni e le attrezzature devono essere sterili.
- Sacrifica il mouse per dislocazione cervicale e fissare il mouse in posizione supina al microscopio di dissezione.
- Tagliare lo sterno e intorno alla gabbia toracica per aprire la cavità toracica. Rimuovere il cuore, i polmoni e dell'esofago per esporre l'aorta. Rimuovere delicatamente il grasso peri-aorta con una pinza.
- Tagliare l'aorta dalla estremità anteriore con le forbici e tenere delicatamente l'estremità con una pinza smussato. Staccare l'aorta dalla colonna spina dorsale dietro per via smussa. Chiudere accuratamente tutte le arterie si diramano dall'aorta da legatura con elettrocoagulatore bipolare e il taglio dal fondo della legatura con le forbici.
- Utilizzare una siringa da 5 ml per irrigare il lume aorta con 3 ml di soluzione salina contenente 100 U di eparina per prevenire la formazione di coaguli di sangue.
- Tagliare l'estremità posteriore della aorta prima si dirama nel renale. Mantenendo l'integrità della aorta è molto importante durante l'intera procedura.
- Lavare lume aorta con 5 ml di soluzione 0,075% sodio dodecil solfato (SDS) diluita in tampone fosfato (PBS).
- Mettere a bagno l'aorta toracica in 0,075% soluzione SDS in una capsula di Petri 10 cm. Porre la capsula Petri in un agitatore orbitale per 2 ore a 150 rpm a RT.
- Lavare lume aorta con 5 ml di PBS.
- Immergere l'aorta in PBS in una capsula di Petri 10 cm. Porre la capsula Petri sul agitatore orbitale per 2 ore a 150 giri al minuto a temperatura ambiente. Aggiorna PBS ogni 20 min.
- Lavare lume aorta con 5 ml di PBS.
- Tenere decellularized trapianto dell'aorta in PBS a 4 ° C per un massimo di una settimana.
5. Doppio Semina di PiPSC e bioreattore condizionata
Nota: Tutti soluziones ed apparecchiature devono essere sterili. Eseguire tutte le operazioni in una cappa di coltura di tessuti.
- Assemblare il circuito di flusso bioreattore come illustrato in figura 1. Collegare camera di incubazione, serbatoio media, pompa peristaltica e la camera rispetto tubazione. Il volume minimo di supporto necessari per la circolazione è di 40 ml.
- Pre-condizione di nave decellularized con terreno di coltura immergendo l'aorta in mezzo DM in una capsula di Petri 10 cm. Porre la capsula Petri l'agitatore orbitale per 1 ora a 50 rpm a RT.
- Inserire uno centimetri tubi lunghezza Nylon (OD 0,9 millimetri, ID 0,75 millimetri) in entrambe le estremità della nave decellularized al microscopio. Legare la nave e le provette con 8-0 punti di sutura in seta.
- Montare l'innesto aorta decellularized nella camera di incubazione collegando i tubi di nylon con le porte di ingresso e di uscita (1/32 "tubi) dalla parete della camera. Mantenere camera di incubazione con 5mls di media ogni volta.
- Trypsinize PiPSC aggiungendo pre-riscaldatotripsina per coprire il piatto cultura e oscillare delicatamente il piatto 10 volte. Eliminare la tripsina e lasciare il piatto in incubatrice per 2 - 3 min. Aggiungere mezzo di coltura pre-riscaldato nel piatto e miscelare il mezzo con le cellule.
- Contare il numero di cellule utilizzando un emocitometro. Centrifugare due aliquote di sospensioni cellulari contenenti 5 x 10 5 cellule ciascuno per 5 min a 300 x g. Aspirare completamente il surnatante.
- Dopo aspirando completamente il surnatante, risospendere 1 pellet delle PIP pellet cellulari in 50 ml di DM. Iniettare la sospensione cellulare nel lume del vaso decellularized.
- Poi, risospendere il pellet altro Pips cellulare in 100 ml di Matrigel. Pipetta con cura il composto sulla aorta trapianto decellularized.
- Attendere 10 - 15 minuti fino a quando la miscela si trasforma in uno stato simile a gel e uniformemente avvolge intorno alla superficie esterna del serbatoio. Riempire la camera di incubazione con DM.
- Mettere il tutto in una impostazione di CO 2 incubatore 5% bioreattore a 37 ° C. Ruotare manualmente l'innesto decellularized 90 ° intorno all'asse longitudinale ogni mezz'ora nel primo 2 hr.
- Tenere cultura statica per 12 ore per permettere l'adesione cellulare.
- Invia DM attraverso il lume dalla pompa peristaltica di indurre il differenziamento delle cellule muscolari lisce. Inizia portata iniziale a 5 ml / min e aumento graduale a 20 ml / min oltre 24 ore.
- Mantenere il flusso medio circolante a 20 ml / min per 24 ore.
- Arrestare il flusso medio e spostare la definisce dell'incubatore bioreattore.
- Re-seme lume dell'innesto con PiPSC. Trypsinize, contare e centrifugare 1 x 10 6 PiPSC come in passaggi 5,5-5,6. Risospendere le cellule in 50 ml di EGM-2 di media contenenti 50 ng / ml VEGF. Iniettare la miscela di cellule nel lume del trapianto.
- Cambiare la media nella camera di incubazione e tutta la circolazione a EGM-2 terreno contenente 50 ng VEGF / ml di indurre il differenziamento endoteliale.
- Spostare l'impostazione torna th bioreattoree incubatore. Ruotare manualmente l'innesto di 90 ° ogni 30 min nelle prime 2 ore e poi mantenere una cultura statica per 12 ore.
- Inizia circolante flusso da 5 ml / min e aumento graduale a 35 ml / min. Mantenere la portata a 35 ml / min per 5 giorni. Cambia circolante e media camera ogni altro giorno.
- Raccolto l'innesto progettato per un'ulteriore innesto di mouse.
6. Accrescimento di doppia testa di serie PiPSC Graft in Mice
- Utilizzare NOD.CB17-Prkdc SCID / NcrCrl topi maschi come destinatari nave innesto. Assicurarsi sempre che i topi sono circa 10 settimane di vita, pesano circa 25 - 35 g, e sono in buone condizioni di salute.
- Anestetizzare topo ricevente somministrando una combinazione di Hypnorm (25 mg / kg) e Hypnovel (25 mg / kg) per via intraperitoneale. Applicare vaselina pomata oftalmica sugli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia. Confermare anestesia efficiente assicurando che i topi hanno muscoli rilassati e respirano costantemente.
- Fissare il mouse in posizione supina con il collo rasato ed esteso. Somministrare atropina solfato (1,7 mg / kg) in combinazione con gli anestetici per assicurare che il tratto respiratorio mouse rimane chiaro.
- Preparare una incisione mediana della mandibola sterno del mouse. Sotto un microscopio da dissezione con 5- a 10 volte di amplificazione, sollevare le ghiandole salivari giuste lateralmente e rimuovere il muscolo cleidomastoid diritto di esporre la carotide comune destra.
- Rimuovere delicatamente tessuti allegate mobilitare destra carotide comune dall'estremità distale verso l'estremità prossimale. Legare la porzione centrale della carotide comune due volte con una sutura di seta 8-0 e sezionare tra i due legami.
- Passare attraverso un bracciale in tubo di nylon autoclavabile in ogni estremità nave e fissare ogni estremità con fascette microhemostat.
- Rimuovere sutura cravatta su un'estremità e applicare una goccia di eparina (100 U / ml). Subito dopo, invertire l'estremità distale della the dell'arteria per coprire l'intero corpo bracciale e fissare il vaso invertita con una sutura di seta 8-0 al bracciale.
- Ripetere la stessa procedura per l'altra porzione dell'arteria. Arteria Lavare con soluzione fisiologica per rimuovere coaguli di sangue.
- Impiantare un innesto nave decellularized tra due estremità della carotide facendo scorrere le estremità dei vasi decellularized degli oltre polsini arteria e fissandolo con suture di seta 8-0. Rimuovere pinze vascolari da entrambi termina prima di valutare la pulsazione dell'innesto.
- Posizionare la ghiandola salivare destra nella sua posizione originaria. Chiudere la pelle sul luogo chirurgica con sutura interrotta con una sutura 6-0 polyglactin.
- Coerentemente osservare i segni vitali del mouse dopo la procedura è completata, fino a quando non riprende coscienza. Sacrificio topi riceventi da cervicali dislocazione e dei vasi di raccolta innesti o 24 ore o 3 settimane più tardi per ulteriori analisi.
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Representative Results
La generazione di successo di PiPSC stata confermata 4 giorni dopo nucleofecting fibroblasti umani con un plasmide pCAG2LMKOSimO linearizzato portando 4 fattori di trascrizione, Oct4, Sox2 Klf4 e c-Myc (OSKM). PiPSC visualizzato un fenotipo nettamente distinti rispetto ai fibroblasti (Figura 2A) ed espressa 4 fattori di riprogrammazione a mRNA (Figura 2B) e di proteine (Figura 2C) 10 livelli. L'efficacia di un innesto vascolare basato PiPSC è fortemente dipendente dalla capacità del PiPSC di differenziarsi in entrambe le linee muscolari endoteliali e lisce. È pertanto essenziale confermare queste proprietà di PiPSC in vitro differenziando le cellule in mezzi definiti prima utilizzarli per generare innesti per vasi. Figura 3 mostra la capacità di PiPSC di differenziarsi in cellule endoteliali funzionali sia gene (Figura 3A) e proteine ( Figura 3B-D) levEls, sulla base di indicatori specifici endoteliali 10. Allo stesso modo, PiPSC sono anche in grado di differenziarsi in lignaggio muscolatura liscia in risposta ai media specifici (Figura 3E-H) 11.
Tutta aorta decellularization stata ottenuta mediante trattamento con SDS, un detergente anionico che lisa le cellule e solubilizza componenti citoplasmatici. Dopo 2 ore di trattamento, dell'aorta decellularized apparso come ponteggio acellulare traslucida rispetto ad un dell'aorta appena prelevato (Figura 4A-B) 22. Valutazione istologica nella Figura 4C-F illustra l'assenza di nuclei o colorazione citoplasmatica in vasi decellularized, ma non nel normale dell'aorta mouse. Dopo doppia semina di endoteliale PiPSC-derivati e le cellule muscolari lisce all'interno aorte decellularized, gli innesti vascolari ingegnerizzati mostrano proprietà delle cellule muscolari lisce endoteliali e rispettivamente. Ematossilina e eosina (HE) colorazione del doppio-sinnesti eeded rivelato un'architettura simile a quella di vasi nativi (Figura 4G) con più strati di cellule muscolari lisce e un monostrato di cellule endoteliali, come confermato dalla colorazione positiva per muscolo liscio-22α (SM22), muscolo liscio α-actina (SMA) , CD31 e CD144 marcatori rispettivamente (Figura 4H-M) 11.
Per confermare la pervietà dei vasi dei tessuti ingegnerizzati in vivo, il doppio seminati vasi PiPSC-derivati sono stati innestati in topi - sia normale mouse e arterie decellularized sono stati utilizzati come controlli. L'analisi successiva ha mostrato che mentre i topi innestati con vasi decellularized presentato con tassi di mortalità nettamente più elevati fin dal giorno 1, PiPSC innesti vaso conferito un tasso di sopravvivenza del 60% 3 settimane dopo il trapianto (Figura 5A) 11. Inoltre, a 3 settimane di età innesti PiPSC-derivati sono stati completamente caratterizzati per la presenza di umana endoteliale PiPSC-derivato e cellule muscolari lisce e macrofagi ospite infiltrazione (Figura 5B e Tabella 1) 11. Nel loro insieme, i risultati indicano che PiPSC hanno la capacità di differenziarsi in entrambe le linee vascolari e sono potenti per la generazione di navi tissutale funzionali che possono sostituire vasi nativi in vivo.
Figura 1. Rappresentazione schematica del circuito dell'innesto flusso bioreattore decellularized. L'innesto nave decellularized è montato nella camera di incubazione. Una pompa peristaltica è a monte della camera di incubazione a fornire stabile flusso perfusione medie. Il serbatoio supporto è a valle della camera di incubazione. La camera di compliance è migliorare il regime di flusso. La direzione del flusso è indicata dalle frecce.large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Generazione di PiPSC da fibroblasti umani. Fibroblasti umani sono stati nucleofected sia con quattro geni riprogrammazione (OCT4, SOX2, Klf4 e c-Myc) o un vettore vuoto (controllo). Immagini (A) contrasto di fase mostrano la morfologia di pips dopo 4 giorni. PiPSC espresso tutti e quattro i fattori di trascrizione, sia a livello di mRNA (B) e proteine (C) livelli. Bar Scala per immagini indicate sono 50 micron e dati sono mezzi ± SEM (n = 3); * P <0.05, *** P <0.001. Questo dato è stato modificato da Margariti, A. et al. 10 Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. </ A>
Figura 3. PiPSC può differenziarsi in entrambe le cellule muscolari lisce endoteliali e. PiPSC cellule o di controllo sono state differenziate in cellule endoteliali. (A) Rispetto alle cellule di controllo, PiPSC-derivato cellule endoteliali espresso marcatori specifici endoteliali, come CD31, CD144, chinasi dominio inserto (KDR), endoteliale sintasi ossido nitrico (eNOS) e fattore di von Willebrand (vWF) al mRNA livello. (B) Ciò è stato confermato a livello proteico mediante analisi Western Blot. (C) Immunofluorescenza indicato colorazione positiva del CD144 (VE-caderina) in PiPSC-endoteliale, ma non il controllo delle cellule. (D) analisi citofluorimetrica confermata espressione cell PiPSC-endoteliale di CD31 e CD144. PiPSC (o controllo celle) Collagene IV-teste di serie sono stati differenziati incellule muscolari lisce. (E, F) Contrariamente alle cellule di controllo, le cellule muscolari lisce PiPSC-derivati espressi marcatori specifici del muscolo liscio a livello genetico, tra cui SMA, calponina, SM22, miosina del muscolo liscio catena pesante II (SMMHC), fattore di risposta del siero (SRF) , myocardin, smoothelin, elastina e collagene 1A1. (G) I livelli di espressione di SMA, calponina e SM22 in cellule PiPSC-derivati sono stati confermati utilizzando l'analisi Western Blot. (H) colorazione immunofluorescenza usando la microscopia confocale ha mostrato una tipica colorazione marcatore muscolo liscio per calponina e SM22. I dati rappresentano medie ± SEM (n = 3); * P <0.05, ** P <0,01, *** P <0.001. Barra di scala per le immagini mostrate sono 25 micron o 50 micron. Questi dati sono stati modificati da Margariti, A. et al. 10 e Karamariti, E. et al. 11 pregaclicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Generazione di doppio seminato tessuto PiPSC derivato ingegnerizzato innesti vascolari. (A, B) Decellularization di topo dell'aorta toracica conservato la sua struttura e ancora simile a quella di una nave normale, ingrandimento originale 2X. (CF) HE colorazione dell'aorta decellularized confermato decellularization successo e la rimozione completa delle cellule rispetto ai controlli, ingrandimento originale: 50X o 200X. (G) HE colorazione endoteliale PiPSC-derivati e le cellule muscolari lisce navi a doppio teste di serie ha rivelato un'architettura che era simile a un vaso nativo. (J, M) di ingegneria tessutale navi a doppio-seeded PiPSC colorate positivo per endoteliale (CD31 e CD144) e le cellule muscolari lisce (SM22 e SMA) marcatori differenza deceinnesti per vasi llularized. (H, K) L'espressione concomitante di marcatori vascolari nonché la caratteristica morfologia e localizzazione di endoteliale PiPSC derivate e cellule muscolari lisce all'interno delle zone mediale e intimale era paragonabile a vasi nativi. Barra di scala per le immagini mostrate sono 50 micron. Questi dati sono stati modificati da Tsai, T. et al. 22 e Karamariti, E. et al. 11 , cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. Fare doppio teste di serie di ingegneria tessutale innesti vascolari PiPSC-derivati sono di brevetto per la sostituzione vasi nativi in vivo. Vasi PiPSC-derivati sono stati innestati nella carotide di immunodeficienza combinata grave (SCID) topi, mou normalese e arterie decellularized stati usati come controlli. (A) Analisi di topi innestate con i vasi PiPSC derivati ha mostrato il 60% tasso di sopravvivenza chirurgia tre settimane dopo, mentre i topi innestate con vasi decellularized presentato con tassi di mortalità significativamente più elevati e di sopravvivenza inferiore (20%). I dati rappresentano mezzi (n = 10). (B) Le navi tissutale sono stati anche raccolti 3 settimane dopo l'innesto e sottoposto a HE (pannelli a sinistra) o immunofluorescenza (pannelli di destra) per la presenza di CD144 umana e calponina o il mouse CD11b / CD18 (Mac-1); quantificazione di colorazione è sintetizzata nella tabella 1. ingrandimento originale per le immagini mostrate sono 400X salvo. Questo dato è stato modificato da Karamariti, E. et al. 11 Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| Cellule positive Field (40X) | Progettato-nave prima innesto | Progettato vasi graft (3 settimane) |
| calponina | 72 ± 9 | 22 ± 11 * |
| CD144 | 20 ± 8 | 5 ± 6 * |
| Mac-1 | 0 | 71 ± 11 * |
Tabella 1. Caratterizzazione dei vasi tissutale 3 settimane dopo l'innesto. Il numero di cellule endoteliali PiPSC-derivati e della muscolatura liscia e macrofagi di accoglienza è stato quantificato in seguito immunofluorescenza con calponina umana, CD144 umana e mouse del Mac-1 rispettivamente. Dati rappresenta media ± SEM (n = 6); * P <0.05, differenza significativa da navi tissutale prima innesto. Questa tabella è stata modificata da Karamariti, E. et al. 11
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Discussion
Il protocollo attuale indica un suono, veloce strategia, semplice, efficiente e riproducibile in cui i vasi ingegneria tessutale funzionali possono essere generati utilizzando PiPSC da fibroblasti umani. Questa tecnica rappresenta uno strumento prezioso per la medicina rigenerativa, l'ingegneria dei tessuti e terapia cellulare potenzialmente paziente-specifica in un prossimo futuro. Passaggi critici per assicurare l'efficacia del protocollo comprendono la preparazione di PiPSC, preparazione di innesti aortica sterili e completamente decellularized, semina successo e differenziazione delle PiPSC nei ponteggi e mantenere la sterilità di innesti aortica nel bioreattore vascolare.
Per avviare la positiva generazione di innesti tissutale, è della massima importanza per garantire che la preparazione di PiPSC viene effettuata in modo efficace. Il protocollo ha successo 'riprogrammato' una linea cellulare di fibroblasti umani in PiPSC via nucleofection con un plasmide pCAG2LMKOSimO OSKM. Il survivabilityal di fibroblasti dopo nucleofection basa su diversi punti chiave come l'uso di plasmidi OSKM alta qualità, plasmidi di concentrazioni comprese tra 500 - 1,000 ng / ml, evitare ritardi nella semina dei fibroblasti immediatamente dopo nucleofection come cellule sono particolarmente sensibili a seguito dell'introduzione di relativamente grandi plasmidi e infine l'aggiunta di FGF-2, che è fondamentale e dovrebbe essere aggiunto in supporti preparate al momento dell'uso. Inoltre, abbiamo scoperto che era fondamentale per utilizzare le cellule fino a passaggio 9 per evitare la senescenza replicativa, per assicurare un efficiente 'riprogrammazione' in PiPSC e la successiva differenziazione in cellule endoteliali e muscolari lisce. La purezza di PiPSC può essere migliorata dalla selezione delle cellule nucleofected con neomicina. Il plasmide pCAG2LMKOSimO ha un gene resistente neomicina e quindi l'aggiunta di neomicina in un intervallo di 25 ug / ml il giorno dopo la nucleofection per 3 giorni porterà alla selezione di una popolazione puraPiPSC. Per progettare una nave efficiente PiPSC per l'innesto in topi, abbiamo considerato l'integrità e la sterilità delle aorte decellularized per essere di massima priorità. Per mantenere l'integrità delle aorte prima e dopo decellularization, era necessario applicare costantemente manualità durante la manipolazione dei vasi, come erano relativamente fragile e considerevolmente diminutivo dimensioni. La rimozione efficace del tessuto e la sigillatura di ramificazione arterie con un bipolare elettro-coagulatore perivascular era fondamentale per garantire la successiva semina cellulare competente e di evitare perdite di media. In qualsiasi momento, abbiamo garantito che tutti i materiali e le apparecchiature utilizzate per generare il bioreattore (cioè, pinze, tubi, bottiglie, camere, forbici, adattatori e connettori) erano in autoclave, riducendo così i rischi di contaminazione batterica e il fallimento di graft vascolari prima della chirurgia .
Mentre l'attuale protocollo tiene applicazioni cliniche promettenti dise cardiovascolareAsi, ci sono alcune limitazioni che dovrebbero essere migliorati in un prossimo futuro per migliorare ulteriormente la metodologia. Finora, i fattori di trascrizione OSKM sono stati introdotti in fibroblasti umani tramite nucleofection. Mentre questa tecnica è relativamente semplice e diretto, ma determina anche l'efficienza di transfezione variabili in diversi tempi sperimentali. In particolare, tale incongruenza può essere superato introducendo un ulteriore passo del citato selezione neomicina. Allo stesso modo, si potrebbe prendere in considerazione l'introduzione dei quattro fattori in fibroblasti umani utilizzando integrazione lentivirus, che potrebbero potenzialmente aumentare l'efficienza di 'riprogrammazione' e migliorare la sopravvivenza delle cellule dopo l'infezione. In termini di bioreattore, abbiamo scoperto che completa decellularization di aorte può essere ottenuto utilizzando 0,075% SDS. Sebbene questa tecnica è considerato ottimale per la rimozione delle cellule rispetto ad altri detergenti (ad esempio, Triton X-100), esso può tuttavia causare palterazioni otential all'interno delle ultra-strutture delle proteine della matrice extracellulare 23. Questo fenomeno merita pertanto strategie decellularization più efficaci per minimizzare i disagi delle proteine della matrice extracellulare associati. Inoltre, abbiamo anche considerato che il diametro e dello spessore di aorte decellularized variano tra i topi, a seconda della loro età, ceppo e lo sfondo, e quindi causare potenziali differenze nella velocità di flusso e di sforzo di taglio all'interno di bioreattori e la distribuzione di PiPSC seguenti PiPSC semina . Tutto questo rimane da chiarire.
Questo protocollo qui descritto la generazione di ingegneria tessutale innesti funzionali utilizzando PiPSC che detengono un potenziale promettente per future applicazioni cliniche in terapia con cellule staminali per le malattie cardiovascolari. Questo processo che utilizza la riprogrammazione diretta da un lignaggio somatica (fibroblasti) a un altro (sia cellule muscolari lisce endoteliali o) saltando pluripocoe- può essere un modo per ottenere cellule sicuri e adatti di interesse. Infatti, diversi protocolli sono stati pubblicati per descrivere la generazione di linee di cellule staminali da embrioni umani, cellule iPS e le cellule staminali adulte 24-26, ognuno dei quali però ancora sollevano su questioni per quanto riguarda il loro uso in clinica. E 'ormai noto che PiPSC non sviluppano teratomi in topi SCID, eliminando così la preoccupazione di formazione del tumore. Inoltre, le cellule hanno un tempo significativamente più breve per generare, cultura e differenziare 10,11, e hanno dimostrato di generare successo e funzionali vasi ingegneria tessutale innesti paragonabili a aorte nativi. Pertanto, PiPSC presente come fonte di cellule promettente per il trattamento di pazienti con terapia cellulare personalizzata perché fibroblasti (ad esempio, dalla pelle) possono derivare da un individuo specifico. Il sistema dei vasi decellularised in questo protocollo fornisce un modello più biomimetico che fornisce cellule seminati con extracellulproteina di matrice ar che è più rappresentativa a quella di un dell'aorta nativa 11. Questi punti chiave sono fondamentali per garantire la sopravvivenza, differenziazione e la funzionalità delle cellule seminati e vasi ingegneria tessutale dopo. Recente studio di Sumitran-Holgersson e colleghi ha dimostrato un ripopolamento di successo di un trapianto ILLIAC vena precedenza decellularized da una persona deceduta prima di attecchimento 27, postulando così un valore di traslazione del protocollo attuale in esseri umani nel prossimo futuro. Inoltre, gli innesti nave decellularized possono rappresentare un buon modello nel quale possono essere valutati il ruolo e il comportamento di altri tipi di cellule vascolari che contribuiscono anche ad innesti tissutale. Questo modello di sistema nei topi potrebbe fornire un potente strumento per la futura selezione della droga e anche nel chiarire i meccanismi cellulari e molecolari coinvolti nella vascolare biologia delle cellule staminali. Nel loro insieme, l'attuale protocollo ha un valore promettente per la sua applicazione in Vascingegneria dei tessuti lare e un importante passo avanti nella medicina personalizzata.
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Disclosures
Gli autori non hanno interessi finanziari in conflitto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Fibroblasts CCL-153 | ATCC | CCL-153 | Prenatal human embryonic fibroblasts |
| ATCC F-12K Medium (Kaighn's Modification of Ham's F-12 Medium) | ATCC | 30-2004 | |
| Fetal Bovine Serum | ATCC | 30-2020 | |
| Knockout DMEM medium optimized for embryonic stem cells | Life technologies (Gibco) | 12660-012 | |
| Knockout Serum Replacement | Life technologies (Invitrogen) | 10828-028 | |
| Human Basic FGF-2 | Miltenyi Biotech | 130-093-837 | |
| alpha-MEM medium | Life technologies (Invitrogen) | 32571093 | |
| Human PDGF | R&D System | 120-HD-001 | |
| Gelatin Solution 2% | Sigma | G1393 | |
| Plasmid 20866: pCAG2LMKOSimO (SOX2, OCT4, KLF4, C-MYC) | Addgene | 20866 | |
| PvuI Restriction Enzyme | New England Biolabs | RO150S | |
| SureClean Plus | Bioline | BIO-37047 | |
| Nucelofection Kit (NHDF Kit) | LONZA | VPD-1001 | |
| Neomycin | SIGMA | G418 | |
| KL 1500 LCD, Illumination for Stereo Microscopy | SCHOTT | KL 1500 LCD | Cold light illumination for stereo microscopy |
| Nikon Zoom Steromicroscope SMZ800 | Nikon | SMZ800 | |
| Heparin sodium salt | Sigma | H3393 | |
| 10% SDS Stock Solution Molecular Biology Reagent | Severn Biotech | CAS 151-21-3 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8537 | |
| Matrigel (10mg/ml) | BD | A6661 | |
| Shaker IKA Vibrax with Shaking platform VX 7 | Jepson Bolton's, Janke&Kunkel | S32-102 | |
| Masterflex L/S Digital Pump Drive | Cole-Parmer | WZ-07523-80 | |
| Masterflex L/S 6-channel, 6-roller cartridge pump head | Cole-Parmer | EW-07519-15 | |
| Masterflex L/S large cartridges for pump head | Cole-Parmer | EW-07519-75 | |
| Masterflex platinum-cured silicone pump tubing, L/S 14, 25 ft | Cole-Parmer | WZ-96410-14 | Tubing goes through the peristaltic pump |
| 0.5mm ID, 0.8 mm OD Silicone Tubing | SILEX | N/A | Tubings connect incubation chamber, media reservoir and compliance chamber |
| Fitting Reducer 0.5 to 1.6, natural Polypropyline | Ibidi | 10829 | Adapter connect above two types of tubings |
| 1/32" Tubing, ID 0.01" (250µm) Material: PEEK | LabSmith | T-132-010P | Tubing through the incubation chamber wall which connects the graft with outside tubing |
| One-Piece Fittings | LabSmith | T-132-100 | Fix the above tubings through the incubation chamber wall |
| Nylon tubes (OD 0.9mm, ID 0.75mm) | Smiths Medical | N/A | Tubings insert into two ends of the aorta graft |
| NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl mouse | Charles River | ||
| Surgical sutures, 8-0 silk | ETHICON | W819 | |
| Hypnorm | Vetapharm | Vm21757/4000 | Neuroleptanalgesic for use in mice |
| Hypnovel (Midazolam) | Roche | 59467-70-8 | Induction of anaesthesia |
| Dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 | |
| Nylon Tubing | Portex LTD | 800/200/100/200 | 0.65 mm in diameter and 1 mm in length; to make artery cuff |
| Electrocoagulator | Martin | SN 54.131 | Ligation of artery branches on aorta |
| Bipolar micro hemostat forceps | Martin | 80-91-12-04 | Fixation of vessel ends |
| Vessel Dilator | S&T | JFX-7 | |
| Vessel Dilator | S&T | JFL-3dZ | |
| Vessel Dilator | S&T | D-5aZ | |
| Mini applier | AESCULAP | FE572K | |
| Micro hemostats clips | AESCULAP | FE720K | |
| Surgical sutures, 6-0 VICRYL | ETHICON | V489 |
References
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