Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para gerar engenharia de tecidos enxertos de vasos que são funcionais para enxerto em camundongos por semeadura dupla parcialmente célula-tronco pluripotentes induzidas (PPCPE) - derivados de células musculares lisas e PPCPE - células endoteliais derivadas em um biorreator descelulada navio andaime.
Introduction
A construção de condutas vasculares é uma estratégia fundamental para a reparação cirúrgica de vasos danificados e feridos resultantes de doenças cardiovasculares. Até à data, materiais de enxerto utilizados em cirurgia incluem biocompatível polímeros sintéticos (politetrafluoretileno [Teflon], politetrafluoretileno expandido [ePTFE; Gore-Tex] ou tereftalato de polietileno [Dacron]), enxertos, tecido autólogo (pericárdio ou veia safena) e xenotransplantes 1. Enquanto enxertos artificiais (por exemplo, Gore-Tex e Dacron) são mais comumente usados, estes materiais provável causar inúmeras complicações a curto e longo prazo que incluem estenose, a deposição de cálcio, trombo-embolia e infecções. Embora os pacientes com enxertos biológicos apresentam redução de eventos tromboembólicos, eles ainda se deparam com limitações, como a falência do enxerto secundário e durabilidade encurtado devido à calcificação degradação 2. Portanto, apesar das melhorias significativas na cirúrgico techniques longo dos anos, pesquisadores e clínicos ainda estão sobrecarregados com a necessidade de identificar a conduta ideal para doenças vasculares. Mais recentemente, no campo da engenharia de tecido vascular investigação tem gerado um conceito em que as células são incorporados em suportes biodegradáveis, com o objectivo de criar um ambiente biomimética que simboliza um recipiente funcional de um enxerto bem sucedido. Fundamentalmente, o sucesso das construções vasculares dependem de três componentes essenciais; As células que compreendem o andaime, ou seja, uma camada interior de células endoteliais e uma camada de células de músculo liso, um andaime que contém a matriz extracelular apropriado para proporcionar propriedades mecânicas comparáveis à vasculatura nativa, e a sinalização celular / molecular que é necessário para iniciar / regulação reparação.
Dos enxertos a longo prazo e desenvolvimento sustentado dos neo-tecidos são altamente dependentes de semeadura de células eficaz de andaimes, thereby tornar a decisão do tipo de célula de importância crítica. Vários relatos demonstram a utilização de células endoteliais maduras e células do músculo liso a partir de várias fontes para desenvolver condutas de diâmetro pequeno 3-6. Embora promissora, a falta de vasos autólogos suficientes para se obter endoteliais maduras e células musculares lisas continuam a ser um fardo considerável. Mais recentemente, as células estaminais a partir de várias fontes têm sido exploradas para aplicações de engenharia de tecidos vasculares. Células mononucleares de fato, uma grande variedade de tipos de células-tronco, incluindo células-tronco embrionárias 7, células estaminais pluripotentes induzidas (iPSCs) 8,9, PPCPE 10,11, derivadas da medula óssea 12, células-tronco mesenquimais 13, células progenitoras endoteliais e da parede do vaso adulto -derived célula estaminal antigénio-1 (Sca-1) + de células estaminais / progenitoras 14,15 têm sido demonstradas ser capazes de se diferenciarem em células endoteliais ou funcional ou de músculo liso, em resposta a meios definidos econdições de cultura. Além disso, a capacidade de auto-renovação ilimitada das células estaminais torná-los melhores candidatos ao contrário endoteliais maduras e as células musculares lisas, que apenas se podem dividir para um número limitado de vezes antes de se submeter a paragem do crescimento e senescência.
A seleção do material andaime para gerar tecido sucesso navio projetado para enxertia depende de vários fatores, tais como biocompatibilidade, propriedades biomecânicas, e taxa de biodegradação. Fundamentalmente, os materiais usados para criar suportes para os enxertos devem ser biodegradáveis e não será montado receptores desnecessária respostas imunes. Além disso, ele deve abranger uma porosidade adequada e microestrutura para a fixação das células e subsequente sobrevivência. Até à data, os materiais mais comuns utilizados para suportes na engenharia de tecido vascular incluem polímeros de ácido poliglicólico, ácido poliláctico, e poli-caprolactona ε 16. Mais recentemente, materiais biológicos têm decelularizadastambém sido aplicada com algum sucesso. Vários laboratórios mostraram que a semeadura vasos porcino descelularizado humano, canino ou com células autólogas proporcionado um enxerto biológico que resistiu a coagulação e a hiperplasia intimal 17-19. Outras estratégias de engenharia de tecido vascular incluem enxertos vasculares extracelulares baseada em proteínas da matriz, por exemplo, células de semeadura em gel de fibrina 13 e folhas de células geradoras sem apoio andaime 20, 21.
O actual protocolo demonstra a diferenciação de PPCPE humano em endotelial funcional e células do músculo liso, a geração de um biorreactor que consiste em um recipiente de andaime descelularizado para abrigar células vasculares PPCPE derivados funcionais, e enxerto de vasos em engenharia de tecidos de imunodeficiência combinada severa (SCID ) camundongos. PPCPE são um tipo de célula ideal para usar para engenharia de tecidos de enxertos de vasos porque essas células não formam tumores em camundongos ou aumentar ética eas respostas alo-imunes. Além disso, mostramos que a estratégia para a geração de células musculares pips-células endoteliais e pips-suave é eficiente e reprodutível 10,11. Depois disso, foi elaborado um navio descelulada para a semeadura de células vasculares PPCPE derivados para imitar de perto as proteínas da matriz que existe dentro de um vaso nativo, reforçando assim a enxertia e sobrevivência eficácia. Além disso, a descelularização dos vasos antes da semeadura PPCPE impede a ocorrência de reacções inflamatórias montados por tipos de células imunes tais como os macrófagos. Mais importante, este protocolo não representa apenas uma metodologia para gerar prometendo condutas vasculares para a tradução para os seres humanos, mas também fornece valioso meio de estudar e compreender os mecanismos moleculares que governam a regeneração do tecido vascular através de modelos de mouse.
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Protocol
Executar todas as experiências com animais de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê Institucional de uso e cuidados de animais de laboratório.
1. Preparação de Meios de Cultura
- Adicione meios de cultura para a linha de células de fibroblasto humano CCL-153: F-12K Médio, 10% de soro fetal bovino (FBS) e 100 U / ml de penicilina e estreptomicina.
- Adicione reprogramação dos meios para geração de PPCPE: meio de Eagle modificado por KO Dulbecco (DMEM) contendo 20% de substituição KO Soro, 0,1 mM β-mercaptoetanol, 0,1 Mínimo mM Meio Essencial (MEM) não-aminoácidos essenciais, 10 ng / ml do factor de crescimento básico de fibroblastos 2 (bFGF-2) e 100 U / ml de penicilina e estreptomicina. Adicionar bFGF-2 recém cada vez antes de usar a mídia.
- Adicione Diferenciação Meios (DM) para induzir células de músculo liso (SMC) diferenciação: α-MEM meio contendo 10% de FBS, factor de crescimento de 0,1 mM β-mercaptoetanol, 100 U / ml de penicilina e de estreptomicina e 25 ng / ml Derivado de Plaquetas(PDGF-ββ).
- Adicione endotelial Diferenciação Meios (CE-MS) para induzir a diferenciação de células endoteliais (CE): crescimento endotelial meios-2 (EGM-2) meio contendo 50 ng / mL de Factor de Crescimento Endotelial Vascular (VEGF) e 100 U / ml de penicilina e estreptomicina.
2. reprogramação fibroblastos humanos em induzidas Parcialmente células-tronco pluripotentes (PPCPE)
- Cultura linha de células de fibroblastos humanos CCL-153 em 0,04% de solução de gelatina frascos revestidos em meio de cultura.
- Células de passagem a cada 3 dias, à razão de 1: 6. Use as células antes da passagem 9 para otimizar a eficiência da geração de PPCPE. As células estão prontas para transfecção ao atingir 80 - 90% de confluência.
- Linearizar pCAG2LMKOSimO plasmídeo polycistronic contendo 4 fatores de reprogramação octâmero vinculativo fator de transcrição 4 (OCT4), SOX2, fator Kruppel-like 4 (KLF4) e C-MYC (pCAG-OSKM). Digest 5 ug de plasmídeo com 5 unidades de enzima de restrição Pvul durante 3 horas a 37 ° C. Purificaro plasmídeo com um kit comercial de acordo com o protocolo do fabricante.
- Transfectar 2 x 10 6 de fibroblastos humanos com 4 ug de plasmídeo linearizado pCAG-OSKM por electroporação com o kit de fibroblasto dérmico humano (NHDF) nucleofection de acordo com o protocolo do fabricante. Suavemente semear as células transfectadas para pré 0,04% de gelatina revestida frasco T25 contendo 5 ml de pré-aquecido reprogramação mídia.
- Após 24 h, alterar forma com suplementos de 25 ug / ml de neomicina para seleccionar uma população pura de células transfectadas.
- Alterar médio em dias alternados até dia 4.
Nota: fibroblastos humanos tornam-se PPCPE após 4 dias de reprogramação.
3. Diferenciação de PPCPE em endotelial e nas células musculares lisas
- PPCPE Semente em pratos colágeno IV pré-revestidos contendo DM por 4 dias para induzir a diferenciação em células musculares lisas. Alterar médio em dias alternados até dia 4.
- PPCPE Semente sobre o colágeno IV pré-revestidas pratos containing endotelial-DM durante 6 dias para induzir a diferenciação em células endoteliais. Alterar médio em dias alternados até dia 6.
4. descelularizado Aorta Graft Preparação
Nota: Todas as soluções e equipamento deve ser estéril.
- Sacrifique o mouse por deslocamento cervical e corrigir o mouse em uma posição supina sob dissecção microscópio.
- Corte através do esterno e em torno da caixa torácica para abrir a cavidade torácica. Retirar o coração, pulmões e esôfago para expor a aorta. Com cuidado, retire a gordura peri-aorta com uma pinça.
- Corte a aorta a partir do final anterior com uma tesoura e gentilmente segure a ponta com uma pinça sem corte. Retire a aorta da coluna vertebral para trás por dissecção romba. Feche cuidadosamente todas as artérias se ramificam a partir da aorta por ligação com um electrocoagulador bipolar e corte a partir da extremidade da ligação com uma tesoura.
- Use uma seringa de 5 ml para irrigar o lúmen da aorta com 3 ml de solução salina contendo 100 U de heparina para prevenir a formação de coágulos sanguíneos.
- Corte a extremidade posterior da aorta antes de se ramifica na renal. Manter a integridade da aorta é muito importante durante todo o procedimento.
- Lave o lúmen da aorta ascendente com 5 ml de solução de 0,075% de dodecil sulfato de sódio (SDS), diluída em tampão fosfato salino (PBS).
- Mergulhe a aorta torácica em solução SDS 0,075% em uma placa de Petri de 10 cm. Colocar a placa de Petri num agitador orbital durante 2 horas a 150 rpm à temperatura ambiente.
- Lave o lúmen da aorta com 5 ml de PBS.
- Mergulhe a aorta na PBS em uma placa de Petri de 10 cm. Colocar a placa de Petri num agitador orbital durante 2 horas a 150 rpm à temperatura ambiente. Refresque PBS a cada 20 min.
- Lave o lúmen da aorta com 5 ml de PBS.
- Manter enxerto aorta descelularizado em PBS a 4 ° C durante até uma semana.
5. Dupla Sementeira de PPCPE e Bioreactor Condicionado
Nota: Toda a soluçãos e o equipamento deve ser estéril. Realizar todas as operações em uma capa de cultura de tecidos.
- Montar o circuito de fluxo biorreactor, como ilustrado na Figura 1. Ligue câmara de incubação, meios reservatório, bomba peristáltica, e câmara de conformidade com tubagem. Volume mínimo de meio necessário para a circulação é de 40 ml.
- Pré-condição do navio descelularizado com meio de cultura por imersão da aorta em meio DM em um prato de Petri de 10 cm. Colocar a placa de Petri num agitador orbital durante 1 h, a 50 rpm à temperatura ambiente.
- Inserir um centímetro de comprimento de nylon tubos (OD 0,9 milímetros, 0,75 milímetros ID) em ambas as extremidades do recipiente de descelularização sob microscópio. Amarre a embarcação e os tubos com 8-0 suturas de seda.
- Montar o enxerto descelularizado aorta na câmara de incubação, ligando os tubos de nylon com as portas de entrada e de saída (1/32 ") de tubagem a partir da parede da câmara. Manter a câmara de incubação com 5 ml de meio de cada vez.
- Trypsinize PPCPE adicionando pré-aquecidotripsina para cobrir a placa de cultura e agite levemente o prato 10 vezes. Descarte a tripsina e deixar o prato na incubadora por 2-3 min. Adicionar meio de cultura pré-aquecido no prato e misturar o meio com as células.
- Contar o número de células usando um hemocitômetro. Centrífuga de duas alíquotas de suspensões de células contendo 5 x 10 5 células por cada 5 min a 300 x g. Aspirar o sobrenadante completamente.
- Depois de aspirar o sobrenadante completamente, ressuspender um sedimento dos pips sedimentos celulares em 50 ul de DM. Injetar a suspensão de células no lúmen do vaso descelularizados.
- Em seguida, voltar a suspender o outro pellet pips celular em 100 ul de Matrigel. Pipeta cuidadosamente a mistura sobre o enxerto aorta descelulada.
- Espere por 10-15 min até que a mistura se transforma em um estado de gel-like e uniformemente envolve em torno de superfície externa do navio. Encha a câmara de incubação com DM.
- Colocar todo o biorreactor configuração em um 5% de CO2 a 37 ° C. Rodar manualmente o enxerto descelularizado 90 ° em torno do eixo longitudinal a cada meia hora durante as primeiras 2 horas.
- Mantenha cultura estática durante 12 horas para permitir a adesão celular.
- MS entregar através do lúmen pela bomba peristáltica para induzir a diferenciação de células de músculo liso. Iniciar a taxa de fluxo inicial de 5 ml / min e aumento gradual de 20 mL / min ao longo de 24 h.
- Manter a taxa de fluxo do meio que circula em 20 ml / min durante 24 horas.
- Interromper o fluxo médio e mover a configuração fora da incubadora biorreator.
- Re-semente a luz do enxerto com PPCPE. Trypsinize, contar e centrífuga de 1 x 10 6 PPCPE como nos passos 5,5-5,6. Ressuspender as células em 50 ul de meio EGM-2 contendo 50 ng / ml de VEGF. Injectar a mistura de células para o lúmen do enxerto.
- Alterar a forma da câmara de incubação e toda a circulação de meio EGM-2 que continha 50 ng de VEGF / mL para induzir a diferenciação endotelial.
- Mova o biorreator configuração de volta ao the incubadora. Rodar manualmente o enxerto 90 ° de cada 30 min durante as primeiras 2 horas e, em seguida, manter uma cultura estática, durante 12 h.
- Começar a circular o fluxo de 5 ml / min e aumento gradual de 35 ml / min. Manter a taxa de fluxo a 35 ml / min, durante 5 dias. Alterar circulando e médio câmara a cada dois dias.
- Colher o enxerto de engenharia para posterior enxertia para mouse.
6. Alongamento das Duplo-semeado PPCPE Graft em Ratos
- Uso NOD.CB17-Prkdc scid / NcrCrl ratos macho como receptores de enxertos navio. Assegure-se sempre que os ratos são cerca de 10 semanas de idade, pesar cerca de 25 - 35 g, e estão em boas condições de saúde.
- Anestesiar rato destinatário através da administração de uma combinação de Hypnorm (25 mg / kg) e Hypnovel (25 mg / kg) por via intraperitoneal. Aplique vaselina pomada oftálmica nos olhos para evitar a secura e sob anestesia. Confirme anesthetization eficiente, garantindo que os ratos têm músculos relaxados e está respirando de forma constante.
- Corrigir o mouse em decúbito dorsal com o seu pescoço raspada e estendida. Administrar sulfato de atropina (1,7 mg / kg) em combinação com os anestésicos para assegurar que o tracto respiratório do rato permanece claro.
- Prepare uma incisão na linha média da mandíbula para esterno do mouse. Sob um microscópio de dissecação com 5- a 10-vezes a amplificação, levantar as glândulas salivares direita lateralmente e remover o músculo cleidomastoid direito para expor a artéria carótida comum direita.
- Suavemente remover tecidos ligados a mobilizar a artéria carótida comum direita a partir da extremidade distai para a extremidade proximal. Ligadura a porção média da artéria carótida comum, duas vezes com uma sutura de seda 8-0 e dissecar entre os dois laços.
- Passe por uma braçadeira feita de tubo de nylon autoclavable em cada extremidade do vaso e corrigir cada extremidade com grampos microhemostat.
- Remover laço de sutura numa extremidade e aplicar uma gota de heparina (100 U / ml). Imediatamente depois, inverter a extremidade distal do the artéria para cobrir todo o corpo cuff e corrigir o navio invertido com uma sutura 8-0 seda para o manguito.
- Repetir o mesmo procedimento para a outra porção da artéria. Lave artéria com solução salina para remover coágulos sanguíneos.
- Implantar um enxerto navio descelulada entre duas extremidades da artéria carótida, deslizando as extremidades dos vasos decelularizadas do ao longo dos punhos das artérias e fixando-o com fio de seda 8-0. Remover pinças vasculares a partir de qualquer termina antes de avaliar a pulsação do enxerto.
- Coloque a glândula salivar de volta à sua posição original. Fechar a pele sobre o local cirúrgico com uma sutura interrompida utilizando um fio de sutura 6-0 de poliglactina.
- Consistentemente observar os sinais vitais do rato após o procedimento for concluído, até que ele retoma a consciência. Sacrifique ratos receptores por luxação cervical e vasos colheita enxertos ou 24 horas ou 3 semanas mais tarde, para posterior análise.
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Representative Results
A geração bem sucedida de PPCPE foi confirmada 4 dias após nucleofecting fibroblastos humanos com um plasmídeo linearizado pCAG2LMKOSimO transportando quatro fatores de transcrição, Oct4, SOX2, KLF4 e c-Myc (OSKM). PPCPE apresentaram um fenótipo marcadamente distinta quando comparados com os fibroblastos (Figura 2A) e expressa os quatro factores de reprogramação no ARNm (Figura 2B) e de proteína (Figura 2C) 10 níveis. A eficácia de um enxerto vascular com base em PPCPE é altamente dependente da capacidade do PPCPE de se diferenciar em ambas linhagens de músculo liso e endoteliais. É, portanto, crucial para confirmar estas propriedades de PPCPE in vitro através da diferenciação das células em meios definidos antes utilizando-os para gerar enxertos de vasos. A Figura 3 mostra a capacidade de PPCPE para se diferenciar em células endoteliais funcionais tanto do gene (Figura 3A) e proteína ( A Figura 3B-D) levels, com base em marcadores específicos do endoteliais 10. Da mesma forma, PPCPE também são capazes de se diferenciar na linhagem do músculo liso, em resposta a meios de comunicação específico (Figura 3E-H) 11.
Descelularização aorta total foi conseguida por tratamento com SDS, um detergente aniónico que lisa células e solubiliza os componentes citoplasmáticos. Depois de 2 horas de tratamento, a aorta descelularizado apareceu como um andaime acelular translúcida quando em comparação com uma aorta recentemente colhido (Figura 4A-B) 22. A avaliação histológica na Figura 4C-F ilustra a ausência de núcleos ou coloração citoplasmática em vasos descelularizados, mas não na aorta de rato normal. Seguindo dupla semeadura de endotelial PPCPE derivado e células musculares lisas dentro aortas decelularizados, os enxertos vasculares engenharia mostrar propriedades das células endoteliais e do músculo liso, respectivamente. HE (HE) do double-seeded enxertos revelou uma arquitectura semelhante à de vasos nativos (Figura 4G) com várias camadas de células musculares lisas e uma monocamada de células endoteliais tal como confirmado por coloração positiva para músculo liso-22α (SM22), do músculo liso α-actina (SMA) , CD31 e CD144 marcadores, respectivamente (Figura 4H-M) 11.
Para confirmar a desobstrução dos vasos do tecido engenharia in vivo, as duplas semeados vasos PPCPE derivados foram enxertados em ratos - tanto rato normal e artérias descelularizados foram utilizados como controle. A análise posterior mostrou que, enquanto camundongos enxertados com vasos descelularizados apresentaram taxas de mortalidade mais elevadas marcadamente tão cedo quanto o dia 1, enxertos de vasos PPCPE conferiu uma taxa de sobrevivência de 60% 3 semanas após o transplante (Figura 5A) 11. Além disso, a 3 semanas de idade PPCPE-enxertos derivados foram totalmente caracterizados pela presença de endotélio humano PPCPE-derivado e células de músculo liso e a infiltração de macrófagos do hospedeiro (Figura 5B e Tabela 1) 11. Tomados em conjunto, os resultados indicam que PPCPE têm a capacidade de se diferenciar em ambas as linhagens são vasculares e potente para gerar vasos engenharia de tecidos funcionais que podem substituir vasos nativos in vivo.
Figura 1. Representação esquemática do circuito de fluxo de biorreactor descelularizado enxerto. O enxerto de vaso descelularizado é montado na câmara de incubação. Uma bomba peristáltica é a montante da câmara de incubação para proporcionar fluxo de perfusão forma estável. O reservatório está em mídia a jusante da câmara de incubação. A câmara de amortecimento é melhorar o regime de fluxo. A direcção de fluxo é indicada pelas setas."target =" _ large.jpg blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Geração de PPCPE a partir de fibroblastos humanos. Fibroblastos humanos foram nucleofected quer com quatro genes de reprogramação (OCT4, SOX2, KLF4 e C-MYC) ou um vector vazio (controlo). (A) de contraste de fase imagens mostram a morfologia de sementes após 4 dias. PPCPE expressa todos os quatro factores de transcrição, em ambos os ARNm de (B) e (C) os níveis de proteína. A barra de escala para as imagens exibidas são 50 mm e os dados são médias ± SEM (n = 3); * P <0,05, *** P <0,001. Este valor foi modificado a partir Margariti, A. et al. 10 Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura. </ A>
Figura 3. PPCPE podem diferenciar-se em ambas as células de músculo liso e endoteliais. As células de controlo foram PPCPE ou diferenciar-se em células endoteliais. (A) Em comparação com células de controlo, PPCPE-as células endoteliais expressos marcadores específicos de endoteliais, tais como CD31, CD144, cinase do receptor do domínio de inserção (KDR), óxido nítrico sintase endotelial (eNOS) e factor de von Willebrand (vWF) no ARNm nível. (B) Isto foi confirmado ao nível da proteína usando a análise de Western blot. (C) imunofluorescência indicou coloração positiva de CD144 (VE-caderina) em PPCPE-endotelial, mas não abrange as células. (D) a análise de citometria de fluxo confirmou a expressão de células PPCPE-endotelial de CD31 e CD144. PPCPE (ou de controle de células) Colágeno IV-semeados também foram diferenciadas emcélulas de músculo liso. (E, F) Contrariamente às células de controlo, as células musculares lisas derivadas de PPCPE-expressa marcadores específicos do músculo liso ao nível do gene, incluindo a SMA, calponina, SM22, miosina do músculo liso da cadeia pesada II (SMMHC), factor de resposta do soro (SRF) , myocardin, smoothelin, elastina e colágeno 1A1. (L) Os níveis de expressão de SMA, calponina SM22 e em células derivadas de PPCPE foram confirmadas utilizando análise de Western blot. (H) imunofluorescência usando microscopia confocal mostrou um típico suave coloração marcador músculo para calponina e SM22. Os dados representam médias ± SEM (n = 3); * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001. Barra de escala para imagens mostradas são de 25 mm ou 50 mm. Estes números foram modificados a partir Margariti, A. et al. 10 e Karamariti, E. et al. 11 Por favor,clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Geração de double-semeado tecido PPCPE derivado engenharia enxertos vasculares. (A, B) Descelularização de rato aorta torácica preservado sua estrutura e ainda se assemelhava ao de um navio normal, ampliação original 2X. (CF) HE coloração da aorta descelulada confirmou decellularization sucesso e remoção completa das células quando comparados aos controles, ampliação original: 50X ou 200X. (G) HE coloração de células endoteliais derivado de PPCPE e células musculares lisas dupla vasos semeados revelou uma arquitectura que era similar a um vaso nativo. (J, M) da engenharia de tecidos vasos duplas-semeado PPCPE marcação positiva para endotelial (CD31 e CD144) e células musculares lisas (SM22 e SMA) marcadores ao contrário deceenxertos de vasos llularized. (H, K) A expressão concomitante de marcadores vasculares, bem como a morfologia característica e localização de células endoteliais derivado de PPCPE e células do músculo liso no interior das zonas medial e da íntima foi comparável aos vasos nativos. Barra de escala para as imagens mostradas são 50 mm. Estes números foram modificados a partir de Tsai, T. et al. 22 e Karamariti, E. et al. 11 Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. engenharia de tecidos de enxertos vasculares PPCPE derivados Double-semeados são patente para substituição a embarcações nativas in vivo. Embarcações PPCPE derivados foram enxertados na artéria carótida de imunodeficiência combinada severa (SCID), mou normaisse e artérias descelularizados foram utilizados como controle. (A) Análise de camundongos enxertados com vasos PPCPE derivados mostrou 60% de taxa de sobrevivência de três semanas após a cirurgia, enquanto camundongos enxertados com vasos descelularizados apresentaram taxas de mortalidade significativamente mais elevados e menor sobrevivência (20%). Os dados representam médias (n = 10). (B) Os vasos da engenharia de tecidos também foram colhidas 3 semanas após a enxertia e submetido a HE (painéis da esquerda) ou imunofluorescência (painéis da direita) para a presença de CD144 humano e de rato ou calponina CD11b / CD18 (Mac-1); quantificação da coloração estão resumidos na Tabela 1. Ampliação original de imagens mostradas são 400 vezes menos que indicado. Este valor foi modificado a partir Karamariti, E. et al. 11 Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| As células positivas de campo (40X) | Engenharia de navio antes de enxertia | Enxerto de engenharia de reservatório (3 semanas) |
| calponina | 72 ± 9 | 22 ± 11 * |
| CD144 | 20 ± 8 | 5 ± 6 * |
| Mac-1 | 0 | 71 ± 11 * |
Tabela 1. Caracterização dos vasos da engenharia de tecidos três semanas depois do enxerto. O número de células endoteliais derivado de PPCPE e musculares lisas e macrófagos do hospedeiro foi quantificada após coloração de imunofluorescência com calponina humano, CD144 humano e de ratinho Mac-1, respectivamente. Os dados representam a média ± SEM (n = 6); * P <0,05, diferença significativa a partir dos navios da engenharia de tecidos antes de serem enxertados. Este quadro foi modificado a partir Karamariti, E. et al 11.
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Discussion
O protocolo atual indica um som, rápido, estratégia simples, eficiente e reprodutível em que os navios da engenharia de tecidos funcionais podem ser gerados usando PPCPE a partir de fibroblastos humanos. Esta técnica é uma ferramenta valiosa para a medicina regenerativa, engenharia de tecidos e terapia celular específico paciente potencialmente no futuro próximo. As etapas críticas para assegurar a eficácia do protocolo inclui a preparação de PPCPE, preparação de aórticos descelularizados totalmente estéreis e, semeadura sucesso e diferenciação de PPCPE nos andaimes e manter a esterilidade aórticos no bioreactor vascular.
Para iniciar a geração de sucesso dos enxertos de engenharia de tecidos, é de extrema importância para garantir que a preparação de PPCPE é realizado de forma eficaz. O protocolo tem sucesso "reprogramadas" uma linha de células de fibroblastos humanos em PPCPE via nucleofection com um plasmídeo pCAG2LMKOSimO OSKM. O survival de fibroblastos após nucleofection se baseia em vários pontos-chave, tais como o uso de plasmídeos OSKM alta qualidade, plasmídeos de concentrações que variam entre 500 - 1,000 ng / mL, evitar atrasos na semeadura de fibroblastos imediatamente após nucleofection como células são particularmente sensíveis na sequência da introdução de relativamente grandes plasmídeos e, finalmente, a adição de FGF-2, que é fundamental e deve ser adicionado na mídia recentemente preparadas imediatamente antes da utilização. Além disso, descobrimos que era fundamental a utilização de células de até 9 passagem para evitar envelhecimento replicativo, para garantir a eficiente "reprogramação" em PPCPE e subsequente diferenciação em células endoteliais e do músculo liso. A pureza de PPCPE pode ser melhorada por selecção das células nucleofected com neomicina. O plasmídeo pCAG2LMKOSimO tem um gene de resistência a neomicina e, portanto, a adição de neomicina numa gama de 25 ug / ml de um dia após a nucleofection durante 3 dias resulta na selecção de uma população pura dePPCPE. Para projetar uma embarcação PPCPE eficiente para enxerto em camundongos, foi considerada a integridade e esterilidade das aortas decelularizadas ser de maior prioridade. Para manter a integridade das aortas antes e após a descelularização, foi necessário aplicar constantemente destreza manual durante a manipulação dos vasos, como eram relativamente frágeis e consideravelmente em tamanho diminuto. A remoção eficiente de tecido perivascular e vedação de ramificação artérias usando um bipolar electro-coagulador foi fundamental para garantir posterior semeadura de células competentes e para evitar o vazamento de mídia. Em qualquer ponto, é assegurado que todo o material e aparelhos utilizados para gerar o bioreactor (isto é, uma pinça, tubos, frascos, câmaras, tesouras, adaptadores e conectores) foram autoclave, reduzindo assim o risco de contaminação bacteriana e falha de enxertos vasculares, previamente à cirurgia .
Enquanto o protocolo atual sustenta aplicações clínicas promissoras no dise cardiovascularases, existem algumas limitações que devem ser melhorados no futuro próximo para aumentar ainda mais a metodologia. Até o momento, os fatores de transcrição OSKM foram introduzidos em fibroblastos humanos através nucleofection. Embora esta técnica é relativamente simples e directa, também resultou em eficiências de transfecção variáveis em diferentes tempos experimentais. Notavelmente, esta inconsistência pode ser superada através da introdução de um passo adicional de selecção a neomicina acima mencionado. Da mesma forma, pode-se considerar a introdução dos quatro factores em fibroblastos humanos utilizando integração lentivírus, que pode potencialmente aumentar a eficiência de "reprogramação" e melhorar a sobrevivência de células após a infecção. Em termos de bio-reactor, verificou-se que a descelularização completa da aorta pode ser conseguido usando 0,075% de SDS. Embora esta técnica foi considerado óptimo para a remoção de células, em comparação com outros detergentes (por exemplo, Triton X-100), pode no entanto causar potential alterações dentro dos ultra-estruturas de proteínas da matriz extracelular 23. Assim, este fenômeno merece estratégias decelularização mais eficientes para minimizar a interrupção das proteínas da matriz extracelular associados. Além disso, também considerou que a espessura de diâmetro e parede de aortas decelularizadas variar entre ratos, dependendo de sua idade, tensão e fundo, e, assim, causar possíveis diferenças na velocidade do fluxo e da tensão de cisalhamento dentro de biorreatores e a distribuição de PPCPE seguinte PPCPE seeding . Tudo isso deve ser esclarecido.
Este protocolo aqui descrito a geração de engenharia de tecidos enxertos funcionais usando PPCPE que encerram um potencial promissor para futuras aplicações clínicas em terapia com células-tronco para doenças cardiovasculares. Este processo que utiliza a reprogramação direta de uma linhagem de células somáticas (fibroblastos) para outra (a utilização de células musculares lisas ou endoteliais) saltando pluripotência pode ser uma forma de obter células seguras e adequadas de interesse. De fato, vários protocolos foram publicados para descrever a geração de linhas de células estaminais a partir de embriões humanos, células iPS e as células-tronco adultas 24-26, os quais, contudo, ainda levantam a respeito de questões com relação ao seu uso na clínica. Sabe-se agora que não desenvolvem PPCPE teratomas em ratinhos SCID, eliminando assim a preocupação de formação de tumores. Além disso, as células de levar um tempo significativamente mais curto para gerar, cultura e diferenciar 10,11, e têm sido mostrados para gerar bem sucedidas e funcionais enxertos de vasos da engenharia de tecidos que são comparáveis aos aortas nativas. Portanto, PPCPE presente como uma fonte de células promissora para o tratamento de pacientes que utilizam terapia celular personalizado porque fibroblastos (por exemplo, a partir de pele) podem ser derivadas de um indivíduo específico. O sistema de vasos decellularised neste protocolo fornece um modelo mais biomimético que fornece células semeadas com uma extracellulproteína de matriz ar que é mais representativo para a de uma aorta 11 nativa. Estes pontos principais são críticas para assegurar a sobrevivência, a diferenciação e a funcionalidade das células semeadas e vasos da engenharia de tecidos posteriormente. Estudo recente da Sumitran-Holgersson e colegas demonstraram um repovoamento bem sucedida de um enxerto de veia ilíaca anteriormente decelularizadas de uma pessoa falecida antes de enxerto 27, postulando, assim, um valor de translação do atual protocolo em seres humanos no futuro próximo. Além disso, os enxertos de vasos descelularizados pode representar um bom modelo para o qual o papel e o comportamento de outros tipos de células vasculares, que também contribuem para a engenharia de tecidos, enxertos pode ser avaliada. Este sistema modelo em camundongos poderia fornecer uma ferramenta poderosa para a seleção da droga futuro e também na elucidação dos mecanismos celulares e moleculares envolvidos na biologia de células-tronco vascular. Tomados em conjunto, o protocolo atual tem valor promissor para a sua aplicação em vascengenharia de tecidos ular e um avanço na medicina personalizada.
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Disclosures
Os autores não têm interesses financeiros conflitantes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Fibroblasts CCL-153 | ATCC | CCL-153 | Prenatal human embryonic fibroblasts |
| ATCC F-12K Medium (Kaighn's Modification of Ham's F-12 Medium) | ATCC | 30-2004 | |
| Fetal Bovine Serum | ATCC | 30-2020 | |
| Knockout DMEM medium optimized for embryonic stem cells | Life technologies (Gibco) | 12660-012 | |
| Knockout Serum Replacement | Life technologies (Invitrogen) | 10828-028 | |
| Human Basic FGF-2 | Miltenyi Biotech | 130-093-837 | |
| alpha-MEM medium | Life technologies (Invitrogen) | 32571093 | |
| Human PDGF | R&D System | 120-HD-001 | |
| Gelatin Solution 2% | Sigma | G1393 | |
| Plasmid 20866: pCAG2LMKOSimO (SOX2, OCT4, KLF4, C-MYC) | Addgene | 20866 | |
| PvuI Restriction Enzyme | New England Biolabs | RO150S | |
| SureClean Plus | Bioline | BIO-37047 | |
| Nucelofection Kit (NHDF Kit) | LONZA | VPD-1001 | |
| Neomycin | SIGMA | G418 | |
| KL 1500 LCD, Illumination for Stereo Microscopy | SCHOTT | KL 1500 LCD | Cold light illumination for stereo microscopy |
| Nikon Zoom Steromicroscope SMZ800 | Nikon | SMZ800 | |
| Heparin sodium salt | Sigma | H3393 | |
| 10% SDS Stock Solution Molecular Biology Reagent | Severn Biotech | CAS 151-21-3 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8537 | |
| Matrigel (10mg/ml) | BD | A6661 | |
| Shaker IKA Vibrax with Shaking platform VX 7 | Jepson Bolton's, Janke&Kunkel | S32-102 | |
| Masterflex L/S Digital Pump Drive | Cole-Parmer | WZ-07523-80 | |
| Masterflex L/S 6-channel, 6-roller cartridge pump head | Cole-Parmer | EW-07519-15 | |
| Masterflex L/S large cartridges for pump head | Cole-Parmer | EW-07519-75 | |
| Masterflex platinum-cured silicone pump tubing, L/S 14, 25 ft | Cole-Parmer | WZ-96410-14 | Tubing goes through the peristaltic pump |
| 0.5mm ID, 0.8 mm OD Silicone Tubing | SILEX | N/A | Tubings connect incubation chamber, media reservoir and compliance chamber |
| Fitting Reducer 0.5 to 1.6, natural Polypropyline | Ibidi | 10829 | Adapter connect above two types of tubings |
| 1/32" Tubing, ID 0.01" (250µm) Material: PEEK | LabSmith | T-132-010P | Tubing through the incubation chamber wall which connects the graft with outside tubing |
| One-Piece Fittings | LabSmith | T-132-100 | Fix the above tubings through the incubation chamber wall |
| Nylon tubes (OD 0.9mm, ID 0.75mm) | Smiths Medical | N/A | Tubings insert into two ends of the aorta graft |
| NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl mouse | Charles River | ||
| Surgical sutures, 8-0 silk | ETHICON | W819 | |
| Hypnorm | Vetapharm | Vm21757/4000 | Neuroleptanalgesic for use in mice |
| Hypnovel (Midazolam) | Roche | 59467-70-8 | Induction of anaesthesia |
| Dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 | |
| Nylon Tubing | Portex LTD | 800/200/100/200 | 0.65 mm in diameter and 1 mm in length; to make artery cuff |
| Electrocoagulator | Martin | SN 54.131 | Ligation of artery branches on aorta |
| Bipolar micro hemostat forceps | Martin | 80-91-12-04 | Fixation of vessel ends |
| Vessel Dilator | S&T | JFX-7 | |
| Vessel Dilator | S&T | JFL-3dZ | |
| Vessel Dilator | S&T | D-5aZ | |
| Mini applier | AESCULAP | FE572K | |
| Micro hemostats clips | AESCULAP | FE720K | |
| Surgical sutures, 6-0 VICRYL | ETHICON | V489 |
References
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