Introduction
最近的研究表明，用红外光的由水（波长> 1400纳米）的吸收相关的瞬态加热可以用于诱导动作电位的神经组织1，并在心肌2细胞内钙瞬变的。使用红外光的提出用于神经假体的应用极大的兴趣，由于潜在的更精细的空间分辨率，缺乏与组织去除的必要基因的直接接触，最小化刺激伪影，并修改之前刺激细胞（根据需要在光遗传学）1。尽管所有的这些优点，最近开发的热模型表明，目标组织/细胞可能受到的累积热效应，当多个刺激位点和/或高重复率使用3,4。
为了应对这些挑战，研究人员已经认识到使用外在absor电位的BER为神经刺激，以产生在组织中更局部加热效应。 Huang 等人通过使用超顺磁性铁氧体纳米远程激活温度敏感的TRPV1通道的HEK 293细胞与射频磁场表现出5这一原则。尽管这种技术可以允许更深的渗透（磁场相互作用相对较弱与组织），则反应进行仅记录在几秒钟期间，而不是在仿生器件5所需的毫秒的持续时间。大鼠皮质神经元用黑色微粒在体外的类似的，法拉等人证明电刺激。它们表现出刺激细胞级精度使用脉冲持续时间数百微秒和能量在μJ的范围的顺序，潜在地允许更快的重复率6。
使用外在吸收剂也被应用以诱导形态学变化的抑制作用 。 Ciofani 等显示在神经元细胞生长增加了〜40％的使用由超声7激发压电氮化硼纳米管。同样地，内吞氧化铁纳米颗粒在PC12细胞中已经报道了以提高神经突分化以剂量依赖的方式，由于细胞粘附分子的活化与氧化铁8。
近日，在吸收外在的利益，协助神经刺激还注重利用金纳米粒子（金纳米粒子）。金纳米粒子具有有效地吸收激光光线的电浆峰和消散它到周围环境中的热量9的形式的能力。在所有可用的粒子形状，金纳米棒的光吸收（凹NRS）方便地匹配的生物组织的治疗窗（近红外-红外，750-1,400纳米之间的波长）10。此外，在续神经刺激的电话分机，采用的Au卢比的提供了相对良好的生物相容性和广泛的表面功能选项11。最近的研究已经表明，在分化的刺激作用能够的Au卢比的NG108-15神经细胞12连续激光照射后所诱导。同样，细胞内钙瞬变记录后激光照射调制可变频率和脉冲长度13金自然保护区培养神经细胞。金自然保护区的螺旋神经节神经元14的原代培养NIR激光照射后，还记录了细胞膜去极化。首先在与辐照金自然保护区体内应用已被证明只是最近。 EOM和同事露出的Au卢比在其电浆峰和记录在6倍的增加的化合物的神经动作电位（CNAPS）的幅度和一个3倍的降低，在刺激阈值中的大鼠坐骨神经。带连接hanced响应归因于从NR电浆峰15的激发导致局部加热效应。
在本论文，调查激光刺激与金自然保护区培养NG108-15神经细胞的影响，协议规定。这些方法提供了一个简单，但强大的方式使用标准的生物技术和材料照射细胞群在体外 。所述协议是基于一个光纤耦合激光二极管（LD），允许安全操作和重复的排列。在Au NR样品制备和激光照射方法可以进一步扩展到不同的颗粒形状和神经元细胞培养物，提供了具体的合成和培养协议是已知的，分别。
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Protocol
1.金自然保护区准备
注意：金卢比可通过许多配方16来合成，或者从商业供应商购买。
- 通过UV-Vis光谱，通过与0.5-2纳米的分辨率记录从300纳米到1000纳米的吸收值测量在Au NR溶液的初始光密度（OD）。而变化，以用于与可用比色皿中的溶液的体积。
- 评估的初始的NP摩尔浓度与合适的技术17（ 例如 UV-Vis光谱，单粒电感耦合等离子体质谱法，透射电子显微镜）或使用由供应商提供的浓度值。
- 通过稀释的初始的Au NR样品达到的OD = 1。对于最好的重复性，保持外径恒定对于所有测试的样品制备5 ml储备溶液。按照商业供应商的协议，用于稀释的溶剂的组合物。如果不确定中，使用去离子水。
- 离心机将1ml的Au NR溶液两次15分钟，在7800×g离心以除去任何化学过量的溶液。离心循环可以在力量和时间（ 如 20分钟5600×克）18有所不同。
- 除去上清液并重新悬浮在去离子水中的卢比。作为重悬浮颗粒可能会形成聚集在溶液中，每天准备他们有最好的结果。可替代地，在冰箱商店不超过1周。不要冷冻。
- 细胞培养条件下，使用前，超声处理在Au NR溶液中5分钟，然后用UV光杀菌30分钟（UV辐射强度不小于400毫瓦∙米-2在254nm）。
2. NG108-15神经细胞培养和分化
- 对于细胞培养基，制成500毫升之无菌的Dulbecco含有10％（重量/体积）胎牛血清（FCS）的改良的Eagle培养基（DMEM），1％（重量/体积）的L-谷氨酰胺，1％的（重量/体积）青霉素/链霉素和0.5％（重量/体积）的两性霉素B.
注意：补充剂可以等分，储存在-20℃，并加入到所需要的天介质。细胞培养基可冷藏在无菌条件下，最多为1个月。 - 对于细胞分化培养基，制备50毫升含有1％无菌DMEM中（重量/体积）的L-谷氨酰胺，1％（重量/体积）青霉素/链霉素和0.5％（重量/体积）的两性霉素B.
- 生长在（在37℃，5％CO 2）的聚苯乙烯制在潮湿气氛的培养箱T75烧瓶NG108-15神经细胞在10ml细胞培养基。通常情况下，种子1.5-2×10 5个细胞在每个烧瓶中，以准备在3-4天。改变细胞培养基每两天。
注意：为防止遗传漂移或更改，请不要使用超过21通道的实验细胞。 - 当70-80％融合的文化，用温暖的新鲜细胞培养基改变介质。机械轻轻KNOC分离细胞王汇合烧瓶底部。不要使用胰蛋白酶。
- 离心细胞悬浮液5分钟，于600×g离心并重新悬浮细胞沉淀在2ml温暖细胞分化培养基。
- 种子2×10 4细胞/ cm 2在组织培养聚苯乙烯96孔板用200μl细胞分化培养基。孵育实验1天在5％的CO 2/37℃。
- 添加的金NR溶液之间3.2×10 9 -4.2×1 0 10个粒子/ ml，第2天，并培育它用于另外24小时。没有为对照实验中添加粒子。
注意：作为一个替代的控制，可用于比较目的的14金纳米粒子具有分化良好的峰值吸收波长。对于一个更加一致的细胞行为，保持细胞密度不变，不修改之前细胞种植井表面。
3.突起生长增强
- 对与单模光纤的激光器（数值孔径= 0.13），并用一光纤连接器终止它（FC连接器是方便和通常可获得的）。测量输出激光功率与标准功率计。以获得最有效的结果，匹配激光到卢比的等离子体共振峰的峰值波长。
- 在第3天以下NR孵化，修复FC连接器的很好。照射样品和对照在室温连续波1分钟，为不同的激光功率。允许培养至在5％的CO 2/37℃进行3天的附加 。重复激光照射了至少3个独立的测量。
注意：不同的照射时间和脉冲频率可被选择，这取决于应用。 - 表征激光光束直径和激光辐照方面（W∙厘米-2）。
- 对于标准单模光纤，用NA = N∙罪θ，其中n是所使用的介质的折射率，θ是光离开所述光纤的锥体的半角（参照图1A）。从三角，R =黄褐色θ∙d，其中r是光束半径，d是纤维和样品之间的距离。在FC连接器的直径匹配良好，因此照明在距离 d 2.70±0.20毫米样品=。光从水中纤维（N = 1.33），使R =棕褐色（SIN-1（NA / N））∙ð。
- 使用后者方程，计算出的激光束的半径，对应的光束面积和平均激光辐照（激光功率由波束面积除以）在目标（参见图1B的例子中图）。这些值代表平均照度以上的照明面积。
- 评估与错误传播的一般理论的测量误差。
注意：距离between对FC连接器和所述样品可通过实验装置使用适当的软件（ 例如 ImageJ的）图像和后处理的照片来测量。
- 在第5天，从实验除去细胞分化培养基和固定样品以3.7％为10分钟（V / V）的甲醛溶液，再透化的细胞含有0.1％（体积/体积）的Triton X-100进行20分钟。
- 加入3％（重量/体积）牛血清白蛋白（BSA）的样品60分钟，以封闭未反应的蛋白质结合位点。标记的样品用于抗βIII微管蛋白过夜（5微克/毫升的PBS补充有1％BSA的）在4℃下。
- 孵育所述细胞90分钟，在黑暗中与合适的二级抗体（ 例如，TRITC标记的抗小鼠IgG抗体），在PBS中的1％BSA中使用0.4-2微克/ ml的浓度。标记细胞核用DAPI（0.1微克/毫升的去离子水）10分钟。
注：抗体偶联和浓度MIGHT根据公司的协议而变化。洗涤样品，用PBS两次，每次染色阶段之后5分钟。
- 图像通过荧光或共聚焦显微镜使用至少一个20×的目标样本。选择显微镜相应滤波器的二级抗体，选择DAPI过滤器（λ= EX 358纳米;λEM = 488纳米），以可视化的细胞核。
- 通过评估分析图像：ⅰ）的最大神经突长度（记录从突起到细胞体的开头的前端的长度），ⅱ）每神经细胞神经突的数目（总结所有每个细胞的神经突的）和iii）细胞与神经突的百分比（除以细胞表达βIII微管蛋白通过细胞与阳性染色细胞核的总数）19的总数。
4.激光诱导细胞内Ca 2+成像
注意：BSS解决方案可以预先准备并冷藏最长不超过1个月。添加补充剂（的Fluo-4 AM和尼克F-127），在实验的日子。
- 测量输出激光功率与标准功率计。插入的光传输光纤到光纤保持器，并将其粘贴到一个微定位。参阅Brown 等人的 20对光纤制备和定位的更多细节。
注意：激光功率的测量过程中遵循激光安全的一般规则（ 例如，不要直视激光束，在操作时戴好激光护目镜，防止杂散光接触到其他实验室用户）<。/ li>
- 放置细胞的倒置共焦显微镜下的光递送纤维250±50μm的位置远离透射照明模式中的目标小区。在这个距离上，使用提出的方程3.3.1来计算光束半径的目标。
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Representative Results
通过使用协议1，2和3在此描述时，观察到在NG108-15神经元细胞培养用Au纳米颗粒上分化的刺激作用（凹卢比，聚（苯乙烯磺酸盐）包被的金卢比和二氧化硅被覆的Au NRS）激光后1.25和7.5 W之间曝光·厘米-2。 rhodamineB标记的Au卢比的共焦图像证实，该颗粒是从孵育12的第1天内化。本地化是主要在细胞质观察到的，这表明吸收的优选机制是经由细胞体膜12。在NG108-15神经细胞的分化诱导后检测到的主要形态变化是扩散的阻滞，βIII微管蛋白的蛋白质的表达和神经突的生长，这是在最大长度和数目22来分析。
样品自然保护区培养呈突起长度增加在激光irradi在这里测量ANCE水平（1.25和7.5 W之间·厘米-2）。对照样品（未经细胞培养的纳米粒和辐照以相同的激光功率）显示在长度没有显著变化。使用的7.5瓦·厘米-2，对NG108-15用Au卢比培养最终神经突长度的照射剂量为更高大致36％（P <0.01），比非激光照射样品。这种行为不是专门联系到自然保护区的表面化学。这些值比由NG108开发-15单独并暴露于激光曝光（P <0.05）12的值相同的突起较大，几乎20％的。这些结果与对PC12神经元细胞与压电碳纳米管培养并照射超声波辐射7先前公布的研究一致。
无金自然保护区控制实验还表明在神经元的比例有突起NE和数量方面的780纳米的光的某些刺激作用每个神经元urites。这种刺激是在较低的激光功率（为1.25W∙厘米-2），随后跌幅最高激光能量（7.5瓦∙厘米-2）12更有效。没有任何激光照射引起的纳米粒适度刺激（聚（苯乙烯磺酸盐）包被的和二氧化硅被覆只）中的神经元与突起12的比例进行检测。这些结果与最近发表的观察结果金纳米颗粒可以增加神经元的活动的体外 23,24线; 图2示出了分化NG108-15神经细胞单独培养（ 图2A）或用Au卢比的落射荧光图像（一个例子图2B ），并照射具有不同的激光功率（在图中表示）。
按照协议1，2使用脉冲近红外光的光生细胞内钙释放的潜力进行了评估，并4.钙离子起到不同的细胞活动，如有丝分裂，肌肉收缩和神经突伸展25,26中起重要作用。在响应于刺激， 钙离子增加时，振荡与降低，导致活化，调制特定细胞功能或终止。近来， 钙瞬变也已观察到心肌细胞红外激光曝光的结果。在这项工作中， 钙离子的反应诱发后IR暴露表现出较低的振幅和更快的恢复时间比自发钙瞬变2， 图3示出了装载的Fluo-4 AM和成象用NG108-15神经元细胞的一个例子共聚焦显微镜。的Fluo-4AM，观察到在非破坏性的方式进入细胞膜，从而导致整个细胞质指示器的大致均匀分布。检测只有轻微的核或细胞质细胞器染色。如前面所指出的，预计卢比将位于细胞内12。 NG108-15单独的神经元细胞或用Au卢比和聚（苯乙烯磺酸盐）培养的包被的金卢比被随后暴露于激光辐照0.07之间Ĵ∙cm -2并且370Ĵ∙cm -2时 ，用激光频率调制的范围0.5-2赫兹。
图4示出的响应的振幅如何被映射为时间的函数的代表性例子。的钙离子的反应而变化的辐射暴露（ 图4A - C）的振幅，并观察到不被一致地通过激光脉冲（ 图4C）13触发。最有可能的解释是细胞内Ca 2+存储归因于不完全的Ca 2+负荷2或在神经元细胞的不同效率NR内化的瞬态损耗。当文化性都没有使用卢比E（对照实验中， 图4D），也观察到了780nm的光的刺激作用。然而，这产生较低的荧光振幅的峰和激活的概率较低（中只有16％的分析样品的检测）。总体而言，NR激光诱导的细胞活化的48％的概率达到尽管背景事件由于780纳米的光，NR处理的细胞的曝光证明具有较低的激光能量和响应13的更高的峰值更高的刺激效率。事实上，钙的反应，发现峰在0.33Ĵ∙cm -2的在NR治疗的细胞。这是由于热抑制13。在实验过程中，没有证据起泡或任何其它形式的细胞膜破坏的检测，这与Huang 等人的结果所报告的蜂窝光破坏与为19W∙cm的相对较高的功率密度一致-2施加给4 2分钟7。被记录在NR处理的细胞无自发活动，而激光曝光。
图1：光学纤维实验装置（A）和平均激光辐照的激光功率区的激光束的函数等于至0.4mm 2（B）中 。束参数是：（A）光出射光纤（θ），光束半径（r）和所述光纤和所述样品（D）之间的距离的最大锥的半角。
图2：单独（A）中培养分化NG108-15神经元细胞或用Au卢比（B）的落射荧光图像的实施例和照射不同的激光功率（在图中表示）。样品我ncubated一天激光照射之前。细胞固定并标记为抗β-III微管蛋白（红色）和DAPI（蓝色）激光照射后三天。比例尺是100微米。
图3：装入Fluo4-AM的Ca 2+指示剂分化NG108-15神经细胞的实施例使用一个倒置的共焦显微镜用40X油浸物镜的图像拍摄。
图4：激光诱导的Ca 2+变化作为时间的NG108-15神经细胞三天用在无血清条件下培养的函数的代表性实例（A） 的聚（苯乙烯磺酸盐）-Au卢比，（B，C）的金自然保护区，和（D）无卢比（对照样品）。这些结果为100毫秒（A，C，D）和50毫秒（B）的激光脉冲获得。用于实验（垂直虚线）的频率分别为1赫兹（A - C）和0.5 Hz的频率（D）中 。计算出的辐射暴露为69.4Ĵ∙厘米-2（A），34.7Ĵ∙厘米-2（B），0.37Ĵ∙厘米-2（C）和138.87Ĵ∙厘米-2（D）。 F 最大 / f 0的表示NG108 -15神经细胞检测与离子霉素的最大荧光增加，从校准（转载许可13）。
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Discussion
在这个演讲中概述的协议描述了如何培养，区分和使用光学吸收外在刺激神经细胞。了NR特性（ 例如尺寸，形状，等离子体共振波长和表面化学）和激光的刺激参数（如波长，脉冲长度，重复率等 ）可以变化，以满足不同的实验的需要。可以使用标准的生物测定法和材料来监测对细胞行为的影响。总的来说，方法提供了一种简单，但功能强大，这样照射细胞群在体外 ，并且可以扩展至原代细胞，组织样本和体内研究。
该凹卢比需要满足以用于生物应用的主要要求是稳定性（包括化学和物理）和生物相容性。后者是特别关键的，由于阳离子表面活性剂的存在下（常见LY CTAB）在金表面上。 CTAB是已知诱导的细胞毒性在体外28和体内29和它在合成过程中是常用的，以驱动NR-形状形成30。稳定性和生物相容性通常通过沉积在Au NR表面附加涂层（ 例如聚乙二醇，二氧化硅）31改善。为了评估生物相容性，不同测定可在体外使用（ 例如活/死，MTS，MTT等），而在组织实验7,8,12,15经常进行组织学分析。
另一个挑战面对当与纳米材料的工作是正确地确定它们的摩尔浓度的难度。在形状，大小和化学性质方面的巨大的各种纳米颗粒的使得技术当前可用的适合只有某些种类的颗粒。例如，在标准动态光scatt化工e圈方法假定纳米粒具有球形形状和散射光各向同性17。因此，应用此方法坳自然保护区结果测得的浓度与真钞存在差异的。 NP浓度的问题是特别成问题的，如果相关的纳米域，其中需要施用的浓度，以便最大限度地处理（ 例如，用于药物递送的应用程序）的功效和减少的纳米材料17的毒性被精确地控制。在此处报道的研究中，所使用的光学密度，得到良好的结果中的细胞生存力和粒子数计。
由于它们的固有吸收性能，金纳米粒子经常结合使用的激光源。在曝光，吸收和散射是可能发生在纳米颗粒的表面上的两个主要过程。如果激光波长的等离子体共振波长相匹配时，吸收常战胜散射，令人兴奋的传导电子在NP表面。这些形成远离其平衡位置，并创建一个谐振相干振荡称为局域型表面等离子体共振（LSPR）的电子气。能量随后被转移到对NP晶格热，这是其后迅速消退到周围环境32。因为热是NR LSPR的激发后所观察到的主要效果，最好是监视激光照射后的细胞活力。
据推测，对神经突增生和细胞内Ca 2+途径所观察到的影响是由于从LSPR的激励而产生的瞬时加热。这种假设是在与温度敏感的TRPV1通道的铁素体纳米粒子5的磁曝光后的激活线。这个过程也与观测的热敏感TRPV4渠道解放军一致的y红外线神经刺激33中起重要作用。在分子水平上，它最近已表明，TRPV4是热敏唯一的磷酸肌醇-4,5- -biphosphate与通道34的相互作用（PIP 2）之后。因此，它是可能的NR激发后所产生的瞬态加热可有助于加速和/或诱导的TRPV4通道的开口。此假设可以通过将来的Ca 2+的实验来确认通过使用钙离子-在画中画2耗尽的培养基和/或分子的控制。
不同的基团还表明，小的温度梯度超过生理温度范围内，可用于诱导其它反应，如神经元生长锥指导25或去极化在人胚肾细胞35的电流。勇和同事记录在初级听觉神经元邪教电信号活性显著增加为带有网络实名制在LSPR的激光照射后的硅涂层金卢比。由激光照射的粒子所产生的加热，使用膜片钳技术测定14。最近，严等人记录的3.4×10 9欧NRs的激光曝光后的增加CNAPS的振幅时在大鼠坐骨神经15的神经束的护套的附近连续灌注。
在实验中观察到的780nm的激光二极管的刺激作用是未链接的热量被水吸收而产生，因为这是公知的可以忽略不计在780nm处36。以前发表的结果也报道了780纳米的光在体内对37,38神经组织的刺激作用， 在体外研究已证明的活性氧，在过程39中的参与。然而，详细的机制，其中近红外刺激影响基因transcription和其他细胞活动目前尚未解决。当前数据表明，在不同的刺激效果，包括在线粒体内发色团吸收光子的相互作用（能量在780nm处的近50％的可能是由细胞色素C氧化酶被吸收）37,39-41，对钙改变膜的渗透性37和抑制炎症活性的细胞中的37。
在这个手稿中提出的研究结果表明，纳米颗粒吸收按住神经细胞的光刺激未来应用前景广阔。的主要优势在于NIR光的深入渗透组织（治疗窗）的能力。这些结果还表明，纳米颗粒吸收剂可以增强和/或替换的基于水的吸收红外线神经刺激的过程。用于神经假体未来的应用，这将是感兴趣的，研究了不同的表面functionalizat离子与神经元轴突，这对于许多光学刺激应用的主要目标化学亲和力。
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Acknowledgments
笔者要感谢NanoVentures澳大利亚旅行的资金支持，并教授约翰·海科克为被部分托管于该研究在谢菲尔德和Jaimee梅恩女士的大学为她拍摄时的帮助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Au NR | Sigma Aldrich | 716812 | |
| NG108-15 | Sigma Aldrich | 8811230 | |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6546 | |
| FCS | Life Technologies | 10100147 | |
| L-glutamine | Sigma Aldrich | G7513 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| Amphotericin B | Life Technologies | 15290018 | |
| Formaldehyde | Sigma Aldrich | F8775 | |
| Triton X-100 | BDH | T8532 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A2058 | |
| Anti-βIII-tubulin | Promega | G7121 | |
| TRITC-conjugated anti-mouse IgG antibody | Sigma Aldrich | T5393 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Fluo-4 AM | Invitrogen | F14201 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | 472301 | |
| Pluronic F-127 | Invitrogen | P6867 | |
| UV-Vis spectrometer | Varian Medical Systems Inc. | Cary 50 Bio | |
| Mini centrifuge | Eppendorf | Mini Spin | |
| Sonic bath | Unisonics Australia | FPX 10D | |
| Cell culture incubator | Kendro | Hera Cell 150 | |
| Cell culture centrifuge | Hettich | Rotofix 32A | |
| Laser diode | Optotech | 780 nm single mode fibre - coupled LD | |
| Optical fiber | Thorlabs | 780 HP | |
| Power meter | Coherent | Laser Check | |
| ImageJ | http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html | ||
| Epifluorescent microscope | Axon Instruments | ImageX-press 5000A | |
| μ-slide well | Ibidi | 80826 | |
| Inverted confocal microscope | Carl Zeiss Microscopy Ltd. | LSM 510 meta-confocal microscope | |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS210 |
References
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