Introduction
최근 연구에 따르면, 물 (파장> 1400 ㎚)에 의해 외광의 흡수와 관련된 과도 가열 한 신경 조직 및 심장 근세포의 세포 내 칼슘이 과도에서 활동 전위를 유도하는데 사용될 수 있다는 것을 증명하고있다. 적외선 빛의 사용으로 인해 잠재적 인 미세한 공간 해상도로, 신경 보철에 응용 프로그램에 대한 큰 관심을 제기, 유전자에 직접 조직과 접촉, 자극 유물의 최소화 및 필요성을 제거 부족 (자극하기 전에 세포를 수정 ) optogenetics에 필요 하나. 이러한 모든 장점에도 불구하고, 최근에 개발 된 열 모델은 상기 대상 조직 / 세포 자극 여러 사이트 및 / 또는 고 반복율은 3,4- 사용되는 누적 가열 효과에 의해 영향을받을 수 있음을 제시 하였다.
이러한 과제에 대응하여, 연구자들은 외인성 absor를 사용할 수있는 가능성을 인식하고신경 자극에 대한 조직의 BER이 더 국부 가열 효과를 생성한다. 황 등. 원격 무선 주파수 자계 5 HEK 293 세포에서 온도에 민감한 TRPV1 채널을 활성화하기 위해 페라이트 초상 자성 나노 입자를 사용하여이 원리를 설명했다. 이 기술은 (자기장이 조직에 상대적으로 약한 상호 작용) 더 깊은 침투를 허용 할 수 있지만, 반응은 오히려 생체 공학 장치 (5)에 필요한 밀리 초 지속 시간보다, 초 기간에 걸쳐 기록되었다. 체외에서 검은 마이크로 입자를 쥐의 대뇌 피질 신경 세포의 유사, 파라 등. 입증 전기 자극. 이들은 잠재적으로 더 빠르게 반복 속도 6을 허용 μJ 범위의 에너지와 μS 수백 정도의 펄스 지속 시간을 사용하여 자극 세포 수준의 정밀도를 나타냈다.
외인성 흡수제의 사용은 또한 유도 적용된체외에서 형태 학적 변화. Ciofani 외는. (7)에 의해 여기 된 초음파 압전 질화 붕소 나노 튜브를 사용하여 신경 세포의 생장 ~ 40 %의 증가를 보였다. 마찬가지로, PC12 세포에서 endocytosed 산화철 나노 입자 인해 산화철 8 세포 접착 분자의 활성화, 용량 의존적으로 분화 신경 돌기를 향상시키기 위해보고되었다.
최근, 신경 자극을 지원하기 위해 외부 흡수에 대한 관심은 금 나노 입자의 사용 (금 NP에)에 초점을 맞추고있다. NPS는 효율적으로 AU 플라즈몬 피크에서의 레이저 광을 흡수하는 열 (9)의 형태로 주위 환경으로 방출 할 수있는 능력을 가지고있다. 10 - 가능한 입자 모양의 모든 사이에 금 나노 막대의 광 흡수 (금 NR을)를 편리하게 (NIR, 750-1,400 나노 미터 사이의 파장 적외선 근처) 생체 조직의 치료 창을 일치합니다. 또한, 계속에서신경 자극의 EXT는, Au로 각 NR 사용은 비교적 양호한 생체 적합성 및 표면 기능화 옵션 (11)의 넓은 범위를 제공한다. 최근의 연구 분화에 자극 효과가 NG108-15 신경 세포 12 금 NR을 지속적으로 레이저 노출 후 유도 될 수 있음을 보여 주었다. 마찬가지로, 세포 내 칼슘 과도 가변 주파수 및 펄스 변조 된 레이저 조사 13 길이 Au을 NR을 배양 신경 세포에서 기록되었다. 세포막 탈분극은 나선 신경절 신경 세포 (14)의 차 문화 금 각 NR NIR 레이저 조명 후에 기록되었다. 조사 금 NR을 가진 생체 응용 프로그램의 첫 번째는 최근에 증명되었다. 엄 동료는 플라즈몬 절정에 금 NR을 노출하고 복합 신경 활동 전위 (CNAPs)의 진폭의 6 배 증가 쥐의 좌골 신경의 자극 임계 값의 3 배 감소를 기록했다. 엉진일보 응답은 NR 플라즈몬 피크 (15)의 여기에 의한 발열 효과 지역에 기인 하였다.
본 논문에서는 금 NR을 배양 NG108-15 신경 세포에 레이저 자극의 효과를 조사하는 프로토콜이 지정됩니다. 이러한 방법은 표준 생물학적 기술 및 재료를 사용하여 시험 관내에서 세포 집단을 조사하는 간단하지만 강력한 방법을 제공한다. 프로토콜은 안전하게 작동하고 반복 가능한 정렬을 가능 광섬유 결합 형 레이저 다이오드 (LD)에 기초한다. 금 NR 샘플 준비 및 레이저 조사 방법에있어서, 상기 특정 프로토콜 합성 및 배양을 각각 제공하는 것으로 알려져있다, 다른 입자 형상 및 신경 세포 배양에 확장 될 수있다.
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Protocol
1. 금 NR을 준비
참고 : 금 NR을 조리법 (16)의 숫자에 의해 합성 또는 상업적 공급 업체에서 구입하실 수 있습니다.
- UV-비스 분광법을 통해, 0.5 nm의 해상도에서 300 내지 1000 nm가 내지 흡수 값을 기록함으로써 금 NR 용액의 초기 광학 밀도 (OD)를 측정한다. 용액의 부피는 큐벳 가능한 함께 사용하도록 다양하다.
- 적합한 기술 (17)의 초기 NP 몰 농도 (예를 들어 UV-비스 분광법, 단일 입자 유도 결합 플라즈마 질량 분석법, 투과형 전자 현미경)을 평가하거나 공급 업체에서 제공하는 농도 값을 사용한다.
- 가장 재현성 OD = 1 도달 테스트 샘플의 모든 OD를 일정하게 유지하기 위해 초기의 Au NR 샘플을 희석하여 5 ㎖ 스톡 용액을 준비한다. 희석 용매의 조성에 대한 상용 공급 업체의 프로토콜을 따르십시오. 잘 모르는 경우탈 이온수를 사용합니다.
- 두 번 15 분 동안 금 NR 용액 1 ml의 7,800 XG에 원심 분리기는 솔루션에서 어떤 화학 초과를 제거합니다. 원심 분리 사이클 힘과 시간 (예를 들면 20 분에서 5600 ×의 g) 18 다를 수 있습니다.
- 상층 액을 제거하고 탈 이온수 NR을 다시 일시 중지합니다. 재 부유 입자가 용액에 응집체를 형성 할 수 있듯이, 최상의 결과를 가지고 매일을 준비. 또한, 1 주 이상 더 이상을위한 냉장고에 보관. 냉동하지 마십시오.
- 세포 배양 조건에서 사용하기 전에, 5 분 동안의 Au NR 용액을 초음파 처리 한 다음 (MW가 m을 ∙하게는 400보다 -2 254 nm에서 UV 방사 강도)을 30 분 동안 UV 광으로 소독.
2. NG108-15 신경 세포 라인 문화와 차별화
- 세포 배양 배지를 들어, 멸균 된 둘 베코 변성 이글 배지 (DMEM) 소 태아 혈청 (/ V w) (FCS) 10 %를 함유하는 1 % (w / v)의 L 글루타민, 1 % 500㎖를 준비(w / v)의 페니실린 / 스트렙토 마이신 0.5 % (w / v)의 암포 테리 신 B를
주 : 보조제는 -20 ° C에서 저장, 분주 필요한 날에 배지에 첨가 할 수있다. 세포 배양 배지는 1 개월 최대 무균 상태로 냉각 될 수있다. - 세포 분화 배지를 들어, 1 %를 함유하는 멸균 된 50 ㎖의 DMEM을 준비 L 글루타민, 1 % (w / v)의 페니실린 / 스트렙토 마이신 및 0.5 % (w / v)의 암포 테리 B. (/ V w)
- (37 ° C에서 5 % CO 2) 가습 분위기 인큐베이터 폴리스티렌 T75 플라스크에 세포 배양 배지 10ml에 NG108-15 신경 세포 성장. 일반적으로 3-4 일 내에 준비 될 각 플라스크에 1.5 × 105 세포를 시드. 이틀 세포 배양 배지를 변경합니다.
참고 : 실험로 (21)보다 오래된 세포를 사용하지 않는, 유전 드리프트 또는 변화를 방지하기 위해. - 때 70~80% 합류는 문화, 따뜻한 신선한 세포 배양 매체 매체를 변경합니다. 기계적 공사 부드럽게하여 세포를 분리왕 합류 플라스크의 바닥. 트립신을 사용하지 마십시오.
- 원심 분리기 (600)와 XG에서 5 분 동안 세포 현탁액을 다시 일시 따뜻한 세포 분화 배지 2 ㎖로 세포를 펠릿.
- 세포 분화 배지 200㎕를 가진 조직 배양 96 웰 폴리스티렌 플레이트에 씨앗 2 × 104 세포 / ㎠. 5 % CO 37분의 2 ℃에서 1 일 동안 실험을 품어.
- 2 일에 금 NR 용액 10 0 1 × -4.2 9 10 × 3.2 사이의 입자 / ㎖를 추가하고 추가로 24 시간 동안 그것을 품어. 제어 실험에 입자를 추가하지 마십시오.
주의 : 다른 컨트롤로서 잘 분화 흡수 극대 파장의 Au NPS는 비교 목적 14에 사용될 수있다. 보다 일관된 셀 동작을 위해서 (때문에)는, 일정한 세포 밀도를 유지하고 세포 파종하기 전에 잘 표면을 수정하지 마십시오.
3. 신경 돌기 성 향상
- 한 쌍단일 모드 광섬유와 레이저 (개구 = 0.13)와 (FC 커넥터는 편리하고 일반적으로 사용할 수있는) 섬유 커넥터를 종료합니다. 표준 전력 측정기와 출력 레이저 파워를 측정한다. 가장 효과적인 결과를 얻기 위해서는 각 NR 플라즈몬 공진 레이저 피크의 피크 파장을 일치 시키.
- 3 일 다음 NR 배양에서 잘에 FC 커넥터를 고정합니다. 다른 레이저 파워를 들어, 연속 파형에서 1 분 동안 실온에서 샘플 및 컨트롤을 조사. 문화가 5 % CO 37분의 2 ℃에서 추가로 3 일 동안 할 수있게합니다. 세 독립적 인 측정의 최소 레이저 조사를 반복한다.
주의 : 다른 조사 시간 및 펄스 주파수는 응용에 따라 선택 될 수있다. - 빔 직경과 레이저 방사의 관점에서 레이저를 특성화 (W ∙ cm -2).
- 표준 단일 모드 광섬유를 들어, NA = N ∙ 죄 θ를 사용n은 사용되는 매질의 굴절률이고, θ는 출사 광 섬유의 원뿔의 반각이다 (도 1a 참조). R은 빔 반경 삼각법, R = θ ∙ 황갈색 D 및 D에서 섬유와 샘플 사이의 거리이다. FC 커넥터는 따라서 거리 (d)에서 샘플 = 2.70 ± 0.20 mm를 조명 잘의 직경과 일치합니다. 빛, R = 황갈색 (SIN-1 (NA / N))를 제공하는 d의 ∙ (N = 1.33)을 물에 섬유를 종료합니다.
- 후자의 방정식을 사용하여, 레이저 빔 반경 대응 빔 영역과 대상에 평균 레이저 조사량 (빔 면적으로 나눈 레이저 파워)를 계산 (도 1b에 예시 그래프를 참조). 이러한 값은 조명 된 영역에 걸쳐 평균 조도를 나타낸다.
- 에러 전파의 일반 이론과 측정 오류를 평가합니다.
참고 : 거리 B를etween FC 커넥터와 샘플은 적절한 소프트웨어 (예 ImageJ에)를 사용하여 화상의 실험 장치와 후 처리의 사진으로 측정 할 수있다.
- 5 일째, 실험에서 세포 분화 배지를 제거하고 3.7 %를 10 분 동안 (V / V) 포름 알데히드 용액으로 샘플을 고정하고, 0.1 내지 20 분간 (v / v) 트리톤 X-100 세포를 Permeabilize 하시려면.
- (/ V W) 60 분 동안 샘플을 소 혈청 알부민 (BSA)에 결합 부위 반응을 차단하는 단백질의 3 %를 추가한다. 4 ° C에서 안티 βIII - tubulin의 하룻밤 (PBS에서 / ㎖ 5 μg의이 BSA의 1 %로 보충)에 대한 샘플을 레이블.
- PBS에 1 % BSA에서 0.4-2 ㎍ / ml의 농도를 사용하여 (예 TRITC 공액 항 - 마우스 IgG 항체) 적절한 이차 항체로 어두운 90 분 동안 세포를 배양한다. 10 분 동안 DAPI (0.1 ㎍ / ㎖의에 탈 이온수)와 세포 핵 레이블.
참고 : 항체 활용과 농도 미그를HT는 회사의 프로토콜에 따라 다릅니다. 두 번 각각의 염색 단계 후 5 분 동안 PBS로 세척 샘플.
- 적어도 20 × 목표를 사용하여 표면 형광 또는 공 초점 현미경으로 이미지 샘플. 현미경은 이차 항체에 따라서 필터를 선택. DAPI 필터 선택 (λ EX = 358 nm의, λ EM은 488 나노 미터 =) 세포 핵을 시각화 할 수 있습니다.
- 평가함으로써 이미지 분석 : ⅰ) 최대 신경 돌기 길이 (기록 전지 본체의 시작 신경 돌기의 선단까지의 길이)를, ⅱ) 신경 세포 당 신경 돌기의 수 ()는 셀당 신경 돌기를 모두 합산 및 III) 신경 돌기를 가진 세포의 백분율 (적극적으로 핵 염색 세포의 총 수) 19 튜 불린 - βIII을 발현하는 세포의 총 수를 나눈다.
4. 세포 내 칼슘 이미징 레이저 유도
주 : BSS 용액을 미리 제조하고, 1 개월 최대 냉각 될 수있다. 실험의 날에 보충 (FLUO-4 오전 플루 F-127)를 추가합니다.
- 표준 전력 측정기와 출력 레이저 파워를 측정한다. 광섬유 홀더로 빛을 전달 섬유를 삽입하고 마이크로 포지셔너에 부착합니다. 브라운 등의 알을 참조하십시오. (20) 광섬유 준비와 위치에 대한 자세한 내용은.
주의 : (예 : 레이저 광선을 직접 보지 않는다 처리하는 동안 레이저 안전 고글을 착용, 다른 실험실 사용자에게 미광 노출을 방지) 레이저 파워의 측정하는 동안 레이저 안전에 대한 일반적인 규칙을 따르 <./ 리>
- 반전 된 공 초점 현미경으로 세포를두고 떨어져 투과 조명 모드에서 타겟 셀로부터 광 전달 섬유 250 ± 50 ㎛의 위치. 이 거리에서, 타겟에 빔 반경을 계산하도록 3.3.1에 제시된 방정식을 사용한다.
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Representative Results
여기에 설명 된 프로토콜 1, 2 및 3을 사용하여 분화에 자극 효과의 Au NP에 배양 NG108-15 신경 세포에서 관찰되었다 레이저 후에 (금 NR을, 폴리 (스티렌)의 Au NR을 실리카 코팅 된 금 각 NR을 코팅 처리) 1.25 및 7.5 W 사이의 노출 · cm -2. rhodamineB 표지 금 NR을 공 촛점 이미지는 입자가 배양 12 일 1 내면화되었다는 것을 보여 주었다. 지역화 주로 흡수 바람직한기구는 전지 본체 (12)를 통해 막임을 나타내는 세포질에서 관찰되었다. NG108-15 신경 세포로 분화를 유도 한 후 검출 된 주요 형태 학적 변화는 확산의 체포, βIII - 튜 불린 단백질의 발현 및 최대 길이와 수 (22)의 측면에서 분석 하였다 신경 돌기의 부산물이었다.
NR을 배양 샘플 레이저 irradi에서 신경 돌기 길이 증가를 보였다여기에 측정 ANCE 수준 (1.25 및 7.5 W 사이의 · cm -2). 대조 시료 NPS (않고 배양하고 동일한 레이저 조사 전력 셀) 길이의 유의 한 변화를 보이지 않았다. 7.5 W · cm -2), 금 (Au NR을 배양 NG108-15의 최종 신경 돌기 길이의 조사량을 사용하면 비 레이저 조사 된 샘플보다 더 높은 약 36 % (p <0.01)이었다. 이 동작은 특히 NR을의 표면 화학에 연결되지 않았습니다. 이들 값은 -15 NG108 단독에 의해 개발 및 레이저 노광 (p <0.05) (12)의 동일한 값에 노출 신경 돌기가 거의 20 %보다 더 컸다. 이러한 결과는 초음파 방사선 7 압전 나노 튜브 배양 및 조사 PC12 신경 세포에 이전에 발표 된 연구와 라인에 있습니다.
금 NR을하지 않고 제어 실험은 네브라스카의 신경 돌기 및 번호와 함께 신경 세포의 비율의 관점에서 780 nm의 빛의 일부 자극 효과를 보여 주었다신경 세포 당 urites. 이 자극은 낮은 레이저 파워 (1.25 W ∙ cm -2) 가장 높은 레이저 에너지의 후속 감소와 함께 (7.5 W ∙ cm -2) (12)에 더 효과적이었다. 어떤 레이저 조사없이 국민 연금에 의한 적당한 자극 (폴리 (스티렌)는 코팅 처리 및 실리카 코팅 만)는 신경 돌기 (12)와 신경 세포의 비율로 검출되었다. 이러한 결과는 금 나노 입자가 생체 외 (23, 24)에서 신경 세포의 활동을 증가시킬 수 있음을 최근 발표 관측과 라인에 있습니다.이 그림은 혼자 배양 분화 NG108-15 신경 세포 (그림 2A) 또는 금 NR을와의 표면 형광 이미지의 예 (그림 2B를 보여줍니다 )과 그림에 표시된 다른 레이저 힘 ()을 조사.
광 생성 세포 내 칼슘 방출을위한 잠재적 프로토콜은 1, 2에 따라 NIR 펄스 광을 사용하여 평가하고 있었다4. 칼슘 이온은 유사 분열, 근육 수축 및 신경 돌기 확장 25,26 등 다양한 세포 활성에 중요한 역할을한다. 자극에 응답하여, 칼슘 이온이 증가하고, 특정 세포 기능의 활성화, 변조 또는 종단 선도, 및 진동 감소한다. 최근 칼슘 과도도 심장 근세포의 IR 레이저 노광의 결과로서 관찰되었다. IR 노출 낮은 진폭과 자발적인 칼슘 과도 2보다 빠른 복구 시간을 전시 한 후 그 연구에서 칼슘 반응 유발. (3)와 FLUO - 오전 4시로드 군데 NG108-15 신경 세포의 예를 보여줍니다 공 초점 현미경. FLUO-4 오전 세포질 전반 인디케이터의 균일 한 분포의 결과, 비파괴 방식으로 세포막을 입력하는 것으로 관찰되었다. 사소한 핵 또는 세포질 소기관 염색 검출되었다. 이전에 나타난 바와 같이, NR을 12은 세포 내 위치 할 것으로 예상되었다. J는 cm ∙ 0.07 사이 NG108-15 단독으로 신경 세포 또는 Au로 NR을 및 폴리 (스티렌)으로 배양 - 코팅 - 금 NR을 레이저 irradiances로 후 노출 -2 370 J의 범위는 변조 된 레이저 주파수, cm -2 ∙ 0.5 Hz에서의.
도 4는 응답의 진폭을 시간의 함수로서 매핑 된 방법의 대표적인 예를 나타낸다. 조사량 (도 4a - C)에 따라 달라질 칼슘 응답의 진폭 및 관찰되지 일관 레이저 펄스 (도 4c) (13)에 의해 트리거된다. 가장 가능성있는 설명은 불완전한 칼슘 2 +로드 (2) 또는 신경 세포의 NR 국제화의 다른 효율에 의한 세포 내 칼슘 저장의 과도 고갈이었다. NR을은이 배양에 사용되지 않은 경우E (대조 실험,도 4d), 780 nm의 빛의 자극 효과도 관찰되었다. 그러나, 이것은 낮은 형광 피크 진폭과 (분석 샘플 만 16 %에서 검출) 활성화의 낮은 확률을 생산했다. 전반적으로, NR 레이저 유도 세포 활성화의 48 %의 확률은 달성되었다 인해 780 nm의 빛에 대한 배경 이벤트에도 불구하고, NR-처리 된 세포의 노출은 낮은 레이저 에너지 및 응답 (13)의 높은 봉우리와 높은 자극 효율을 보여 주었다. 사실, 칼슘 응답은 0.33 J ∙ cm -2 NR-처리 한 세포에서에서 피크에 발견되었다. 이 열 억제 (13)에 기인했다. 실험 도중에 blebbing 또는 세포막 파쇄 된 임의의 다른 형태의 증거는 19 W ∙ cm의 비교적 높은 파워 밀도 셀룰러 광 퇴색이 신고의 황 등. 결과와 일치하는, 검출되지 않았다 -2 4인가 분 27. NR-처리 된 세포의 어떤 자발적인 활동은 레이저 노출되지 않고 기록되지 않았다.
도 1 : 영역의 레이저 광에 대한 레이저 파워의 함수로서 광섬유 실험 장치 (A)와 평균 레이저 irradiances 0.4 mm 2 (B)에 동일하다. 빔 파라미터는 (A) 섬유 (θ), 빔 반경 (R)과 광 화이버와의 샘플 (d) 사이의 거리를 빠져 나가는 빛의 최대 원뿔의 반각.
도 2 : 단독으로 (A) 배양 된 분화 된 신경 세포의 NG108-15 금 또는 NR을 (B)로 표면 형광 이미지의 예 (도면에 표시된) 다른 레이저 파워로 조사. 샘플 내가이었다레이저 조사 전 하루 동안 ncubated. 세포는 고정 삼일 레이저 조사 후 항 β-III 튜 불린 (빨간색)와 DAPI (파란색) 표지 하였다. 스케일 바는 100 ㎛이다.
그림 3 : Fluo4-AM 칼슘 표시기로드 차별화 NG108-15 신경 세포의 예제 이미지는 40X 기름 침지 목적으로 반전 된 공 초점 현미경을 사용하여 측정합니다..
그림 4 :와 3 일 동안 무 혈청 조건에서 배양 NG108-15 신경 세포에서 시간의 함수로 레이저 유도 칼슘 변화의 대표적인 예 (A) 폴리 (스티렌) -au의 NR을, (B, C) 금 NR을하고, NR을 (제어 샘플)없이 (D). 이러한 결과는100 밀리 초 (A, C, D)와 50 밀리 초 (B)의 레이저 펄스를 얻을. 0.5 Hz의 (D) - 실험 (점선 수직선)에 사용되는 주파수는 1 Hz에서 (C)이었다. 계산 된 방사 노출 cm -2 (A), 34.7 J가 ∙ J가 ∙ 69.4이었다 cm -2 (B), 0.37 J ∙ cm -2 (C)과 138.87 J ∙ cm -2 (D). F 최대 / F 0 이오 노마 이신 교정에서 NG108 -15 신경 세포에서 검출 된 최대 형광 증가 (허가 13 재생)을 나타냅니다.
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Discussion
이 프레젠테이션에서 설명하는 프로토콜은 문화, 차별화 광학적으로 외부 흡수를 사용하여 신경 세포를 자극하는 방법에 대해 설명합니다. NR 특성 (예를 들어 치수, 형상, 플라즈몬 공진 파장 및 표면 화학) 및 (등과 파장, 펄스 길이, 반복율, 등)의 레이저 자극 파라미터는 다른 실험의 필요에 맞도록 변화 될 수있다. 세포 행동에 영향은 표준 분석 및 생물학적 물질을 사용하여 모니터링 할 수있다. 전반적인 접근 방법은 체외에서 세포 인구를 조사 할 수있는 간단하면서도 강력한 방법을 제공합니다 및 일차 전지, 조직 샘플과 생체 내 연구에서 연장 할 수있다.
금 NR을 생물학적 용도로 사용하기 위해 만족되어야 할 주요 요구 안정성 (화학적 및 물리적 모두) 및 생체 적합성이다. 후자 (인해 양이온 계면 활성제의 존재 때문에, 일반 특히 중요금의 표면에 LY CTAB). CTAB는 시험 관내 및 생체 내 (28) (29) 모두에서 세포 독성을 유도하는 것으로 알려져 있고, 그것은 일반적 NR-형성 형상 (30)를 구동하기 위해 합성 과정에서 사용된다. 안정성 및 생체 적합성 종종 NR 금 표면에 추가적인 코팅 (예 : 폴리에틸렌 글리콜, 실리카) (31)을 증착함으로써 개선된다. 조직 학적 분석은 종종 조직 실험 7,8,12,15 동안 수행되는 동안의 생체 적합성을 평가하기 위해, 다른 분석은 시험 관내에서 (예를 들어 실시간 / 죽은, MTS, MTT, 등)을 사용할 수있다.
나노 물질을 사용한 작업에 올바르게 몰 농도를 결정하는 데 어려움이있을 때 또 다른 문제는 얼굴. 모양, 크기, 화학적 특성의 관점에서 NP에의 거대한 다양한 입자의 특정 클래스에 적합한 기술을 현재 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 표준 동적 빛 scatt방법을 ering 것은 국민 연금 구형과 빛을 산란 등방성 (17)이 있다고 가정합니다. 따라서, 측정 된 농도와 진짜 사이의 불일치에 금 NR을 결과이 방법의 응용 프로그램입니다. 투여 농도가 정확하게 (약물 전달 애플리케이션 등) 방법의 효능을 최대화하고 나노 물질 (17)의 독성을 최소화하기 위해 제어 될 필요가 나노 의학 분야와 관련된 경우 NP 농도의 문제는 특히 문제가된다. 여기에보고 된 연구에서 사용 된 광학 밀도는 세포 생존 및 입자 수의 관점에서 양호한 결과를 주었다.
인해 내재 흡수 특성에, Au로 NPS는 종종 레이저 소스와 조합하여 사용된다. 노광시, 흡수 및 산란 된 NP의 표면에서 발생하기 쉽다 두 가지 주요 방법이다. 종종 레이저 파장 플라즈몬 공진 파장과 일치하는 경우, 흡수NP 표면에서 흥미로운 전도 전자, 산란에 우선합니다. 이러한 평형 위치로부터 멀어과 일관된 공진 진동 국부 표면 플라스 몬 공명 (LSPR)라고 작성 전자 가스를 형성한다. 이어서, 에너지는 그 후 주위 환경 (32)에 급속 열로서 방산 NP 결정 격자로 전달된다. 열 NR LSPR의 여기 후에 관찰 주요 효과이기 때문에, 레이저 조사 후 세포 생존을 모니터링하는 것이 바람직하다.
이 신경 돌기의 생장 및 세포 내 칼슘 이온 통로에 관찰 된 효과가 LSPR의 여기에서 발생하는 과도 가열에 의한 있다고 가정하고있다. 이 가설은 페라이트 자성 NP는 5 노광 후의 감온 TRPV1 채널의 활성과 일치한다. 이 프로세스는 또한 관측 감열 TRPV4 채널 PLA와 일치Y 적외선 신경 자극 (33)에서 중요한 역할. 분자 수준에서, 그것은 최근에 TRPV4는 채널 (34)와 포스 -4,5- -biphosphate의 상호 작용 (PIP 2) 후 열성 인 것으로 나타났다. 따라서, NR 여기 후에 발생하는 일시적 가열을 촉진하는 역할을하고 / 또는 TRPV4 채널의 개방을 유도 할 수있다. 이 가설은 칼슘을 사용하여 미래의 칼슘 실험을 통해 확인 할 수 있습니다 - PIP (2) 고갈을 통해 무료 매체 및 / 또는 분자를 제어합니다.
다른 그룹은 생리적 온도 범위에서 작은 온도 구배가 같은 신경 성장 원추 25를 안내 또는 인간 배아 신장 세포 (35)에 전류를 탈분극 다른 응답을 유도하는데 사용될 수 있다는 것을 증명하고있다. 용인과 동료 차 청각 신경 숭배 전기 신호 활동에 상당한 증가를 기록LSPR에서 각 NR 레이저 조사 후 실리카 피복 NR을 가진 금 어인. 레이저 조사에 의해 생성 된 입자를 가열 패치 - 클램프 기법 (14)을 사용하여 측정 하였다. 연속적 쥐 좌골 신경 (15)의 신경 다발의 시스의 근방에 관류 때 최근 엄 등. 3.4 × 10 9의 Au 각 NR 레이저 노광 후의 CNAPs의 진폭의 증가를 기록했다.
이것은 36 내지 780 무시할 것으로 알려진 바와 같이 실험 동안 관찰 780 nm의 레이저 다이오드의 자극 효과는 물 흡수에 의해 발생한 열로 연결되지 않았다. 이전에 게시 된 결과는 생체 내 37, 38의 신경 조직에 780 nm의 빛의 자극 효과를보고있다. 시험관 연구 과정 39 반응성 산소 종의 참여를 증명하고있다. 그러나, 자세한 메커니즘은하는 NIR 자극 유전자 transcriptio에 영향을 미치는n 및 다른 세포 활동은 현재 해결되지 않은 있습니다. 현재 데이터는 미토콘드리아 발색단 내의 광자 흡수를 포함한 자극 다른 효과의 상호 작용을 암시 37,39-41 (780 nm에서의 에너지의 약 50 %는 사이토 크롬 c 산화 효소에 의해 흡수 될 수 있음) 칼슘 막 투과성의 변화 셀 (37)의 염증 활성의 37 억제.
이 논문에 제시된 결과는 나노 입자의 흡수가 신경 세포의 광 자극 미래의 응용 프로그램에 대한 큰 약속을 잡고 있음을 보여줍니다. 가장 큰 장점은 조직으로 (치료 창)까지 침투하는 근적외선 빛의 능력에있다. 이러한 결과는 또한 나노 입자 흡수제 향상 및 / 또는 흡수에 기초하여 적외선 신경 자극의 방법을 대체 할 수 있음을 보여준다. 신경 보철 미래 애플리케이션, 상이한 표면 functionalizat 조사가 관심을 가질 것많은 광 자극 응용 프로그램의 주요 대상이되는 신경 세포의 축색 돌기, 화학 친화력과 이온.
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Acknowledgments
저자는 부분적으로 촬영하는 동안 그녀의 도움을 셰필드 씨 Jaimee 메인이 대학이 연구를 호스팅하는 데에 대한 여행 자금 지원을위한 NanoVentures 호주와 교수 존 헤이 콕을 인정하고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Au NR | Sigma Aldrich | 716812 | |
| NG108-15 | Sigma Aldrich | 8811230 | |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6546 | |
| FCS | Life Technologies | 10100147 | |
| L-glutamine | Sigma Aldrich | G7513 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| Amphotericin B | Life Technologies | 15290018 | |
| Formaldehyde | Sigma Aldrich | F8775 | |
| Triton X-100 | BDH | T8532 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A2058 | |
| Anti-βIII-tubulin | Promega | G7121 | |
| TRITC-conjugated anti-mouse IgG antibody | Sigma Aldrich | T5393 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Fluo-4 AM | Invitrogen | F14201 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | 472301 | |
| Pluronic F-127 | Invitrogen | P6867 | |
| UV-Vis spectrometer | Varian Medical Systems Inc. | Cary 50 Bio | |
| Mini centrifuge | Eppendorf | Mini Spin | |
| Sonic bath | Unisonics Australia | FPX 10D | |
| Cell culture incubator | Kendro | Hera Cell 150 | |
| Cell culture centrifuge | Hettich | Rotofix 32A | |
| Laser diode | Optotech | 780 nm single mode fibre - coupled LD | |
| Optical fiber | Thorlabs | 780 HP | |
| Power meter | Coherent | Laser Check | |
| ImageJ | http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html | ||
| Epifluorescent microscope | Axon Instruments | ImageX-press 5000A | |
| μ-slide well | Ibidi | 80826 | |
| Inverted confocal microscope | Carl Zeiss Microscopy Ltd. | LSM 510 meta-confocal microscope | |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS210 |
References
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