Introduction
Estudios recientes han demostrado que el calentamiento transitorio asociado con la absorción de luz infrarroja por el agua (longitud de onda> 1400 nm) se puede utilizar para inducir potenciales de acción en el tejido nervioso 1 y transitorios de calcio intracelular en cardiomiocitos 2. El uso de luz infrarroja ha planteado un gran interés para aplicaciones en prótesis neurales, debido al potencial de resolución espacial más fina, la falta de contacto directo con el tejido, la reducción al mínimo de artefactos de estimulación, y la eliminación de la necesidad de modificar genéticamente las células antes de la estimulación ( como se requiere en la optogenética) 1. A pesar de todos estos beneficios, modelos térmicos desarrollados recientemente sugirieron que los tejidos / células diana pueden verse afectados por efectos de calentamiento y acumulativos, cuando se utilizan múltiples sitios de estímulo y / o altas tasas de repetición 3,4.
En respuesta a estos desafíos, los investigadores han reconocido el potencial de utilizar ABSOR extrínsecabros de la estimulación del nervio para producir efectos de calentamiento más localizadas en el tejido. Huang et al. Demostró este principio mediante el uso de nanopartículas de ferrita superparamagnéticas para activar remotamente los canales TRPV1 sensibles a la temperatura en las células HEK 293 con una radio-frecuencia del campo magnético 5. Aunque esta técnica puede permitir una penetración más profunda (campos magnéticos interactúan relativamente débilmente con el tejido), las respuestas sólo se registraron durante períodos de segundos, en lugar de las duraciones de milisegundos requeridos en los dispositivos biónicos 5. Del mismo modo, Farah et al. Estimulación eléctrica demostrada de neuronas corticales de rata con micro-partículas negras en vitro. Mostraron precisión a nivel celular en la estimulación utilizando duraciones de pulso del orden de cientos de microsegundo y energías en el rango de mu J, permitiendo potencialmente las tasas de repetición más rápidas 6.
El uso de absorbentes de extrínsecos también se ha aplicado para inducircambios morfológicos in vitro. Ciofani et al. Mostraron un aumento de ~ 40% en el crecimiento externo celular neuronal utilizando piezoeléctricos nitruro de boro nanotubos excitados por ultrasonido 7. Del mismo modo, se ha informado de nanopartículas de óxido de hierro endocitosis en las células PC12 para mejorar la diferenciación de neuritas en una manera dependiente de la dosis, debido a la activación de moléculas de adhesión celular con el óxido de hierro 8.
Recientemente, el interés en absorbedores extrínsecos para ayudar a la estimulación neural también se ha centrado en el uso de nanopartículas de oro (Au NPs). Au NPs tienen la capacidad de absorber de manera eficiente la luz láser en el pico plasmónica y para disipar en el ambiente circundante en forma de calor 9. Entre todas las formas de las partículas disponibles, la absorción óptica de nanorods oro (Au NRS) convenientemente coincide con la ventana terapéutica de tejidos biológicos (infrarrojo cercano - NIR, longitud de onda entre 750-1,400 nm) 10. Además, en el context de estimulación neural, el uso de Au NR proporciona biocompatibilidad relativamente favorable y una amplia gama de opciones de funcionalización de la superficie 11. Estudios recientes han demostrado que un efecto estimulador en la diferenciación puede ser inducida después de exposiciones láser continuo de Au NR en NG108-15 células neuronales 12. Del mismo modo, los transitorios de calcio intracelulares se registraron en las células neuronales cultivadas con Au NR después de la irradiación láser modulada con frecuencias variables y longitudes de pulso 13. Despolarización de la membrana celular también se registró después de NIR láser de iluminación de Au NR en cultivos primarios de neuronas del ganglio espiral 14. La primera aplicación in vivo con irradiado Au NR se ha demostrado recientemente. Eom y compañeros de trabajo expuestos Au rupias en su pico plasmónica y registraron un aumento de seis veces en la amplitud de los potenciales de acción del nervio compuesto (CNaPS) y una disminución de tres veces en el umbral de estimulación en ratas nervios ciáticos. Los cuartosrespuesta hanced se atribuyó a los efectos de calentamiento locales que resultan de la excitación del pico plasmónica NR 15.
En el presente trabajo, se especifican los protocolos para la investigación de los efectos de la estimulación con láser en NG108-15 células neuronales cultivadas con Au rupias. Estos métodos proporcionan una simple, pero potente, forma de irradiar poblaciones celulares in vitro utilizando técnicas y materiales biológicos estándar. El protocolo se basa en un diodo láser de fibra acoplada (LD) que permite un funcionamiento seguro y la alineación repetible. La preparación de la muestra y los métodos de irradiación láser Au NR se pueden ampliar a diferentes formas de partículas y cultivos de células neuronales, siempre que los protocolos de síntesis y cultura específicas son conocidas, respectivamente.
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Protocol
1. Preparación Au rupias
Nota: Au NR se puede sintetizar por una serie de recetas 16, o comprados de vendedores comerciales.
- Medir la densidad óptica inicial (OD) de la solución de Au NR través de espectroscopía de UV-Vis, mediante el registro de los valores de absorción de 300 nm a 1000 nm con una resolución de 0,5-2 nm. Variar el volumen de la solución a ser utilizado con la cubeta disponible.
- Evaluar la concentración molar inicial NP con una técnica 17 adecuado (por ejemplo, la espectroscopia UV-Vis, partícula única espectrometría de masas con plasma acoplado inductivamente, microscopía electrónica de transmisión) o utilizar los valores de concentración proporcionados por el vendedor.
- Preparar una solución madre de 5 ml por dilución de la muestra inicial Au NR llegar a un OD = 1. Para el mejor repetibilidad, mantener constante la OD para todas las muestras ensayadas. Siga el protocolo del proveedor comercial para la composición del disolvente de dilución. Si no está seguro, Use agua destilada.
- Centrifugar 1 ml de la solución de Au NR dos veces durante 15 minutos a 7800 xg para eliminar cualquier exceso de sustancia química de la solución. Ciclos de centrifugación pueden variar en fuerza y el tiempo (por ejemplo, 20 min a 5600 × g) 18.
- Eliminar el sobrenadante y volver a suspender los NR en agua desionizada. Como partículas resuspendidas podrían formar agregados en solución, prepararlos diariamente para tener los mejores resultados. Alternativamente, almacenar en un refrigerador por no más de 1 semana. No lo congele.
- Antes de usar en condiciones de cultivo celular, sonicar la solución Au NR durante 5 min y luego esterilizar con luz UV durante 30 min (intensidad de la radiación UV no menos de 400 mW ∙ m -2 a 254 nm).
2. NG108-15 célula neuronal Línea Cultura y Diferenciación
- Para el medio de cultivo celular, preparar 500 ml de medio estéril de Dulbecco modificado Eagle (DMEM) que contiene 10% (w / v) de suero de ternera fetal (FCS), 1% (w / v) L-glutamina, 1%(W / v) de penicilina / estreptomicina y 0,5% (w / v) de anfotericina B.
Nota: Los suplementos pueden ser alicuotaron, almacenado a -20 ° C y se añaden a los medios de comunicación en el día requerido. Medio de cultivo celular se puede refrigerar en una condición estéril para un máximo de 1 mes. - Para el medio de diferenciación celular, preparar 50 ml de DMEM estéril que contenía 1% (w / v) L-glutamina, 1% (w / v) de penicilina / estreptomicina y 0,5% (w / v) de anfotericina B.
- Crecer NG108-15 células neuronales en 10 ml de medio de cultivo de células en matraces T75 de poliestireno en una incubadora con atmósfera humidificada (5% de CO2 a 37 ° C). Normalmente, las semillas 1.5-2 × 10 5 células de cada matraz para estar listo en 3-4 días. Cambio de medio de cultivo de células cada dos días.
Nota: Para evitar derivas genéticas o variación, no utilice células mayores de paso 21 para los experimentos. - Cuando el 70-80% de confluencia en la cultura, cambie el medio con una cálida medio de cultivo celular fresco. Mecánicamente separar las células suavemente knocrey el fondo del matraz confluente. No utilice la tripsina.
- Centrifugar la suspensión celular durante 5 min a 600 xg y volver a suspender el sedimento celular en 2 ml de medio de diferenciación celular caliente.
- Seed 2 × 10 4 células / cm 2 en una placa de cultivo de tejidos de poliestireno de 96 con 200 l de medio de diferenciación celular. Incubar el experimento durante 1 día a 5% de CO 2/37 ° C.
- Añadir entre 3,2 × 10 9 -4,2 × 1 0 10 partículas / ml de solución de Au NR en el día 2 y se incuba durante 24 h adicionales. No agregue las partículas para los experimentos de control.
Nota: A modo de control alternativo, Au NPs con una longitud de onda de absorción máxima bien diferenciado puede ser utilizado para propósitos de comparación 14. Para un comportamiento celular más consistente, mantener la densidad celular constante y de no modificar la superficie bien antes de la siembra de células.
3. neuritas Enhancement
- Parejael láser con una fibra óptica monomodo (apertura numérica = 0,13) y terminar con un conector de fibra (FC conectores son convenientes y comúnmente disponibles). Medir la potencia del láser de salida con un medidor de potencia estándar. Para obtener los resultados más eficaces, que coincida con la longitud de onda máxima del láser al pico de resonancia de plasmón de los NR.
- En el día 3 después de la incubación NR, fijar el conector FC al pozo. Irradiar muestras y los controles a TA durante 1 min en onda continua, para diferentes potencias de láser. Deje que la cultura de proceder durante 3 días adicionales en el 5% de CO 2/37 ° C. Repetir la irradiación con láser durante un mínimo de 3 mediciones independientes.
Nota: Los diferentes tiempos de irradiación y frecuencias de impulsos se pueden seleccionar, dependiendo de la aplicación. - Caracterizar el láser en términos de diámetro del haz y la irradiación láser (W ∙ cm -2).
- Para una fibra monomodo estándar, utilice NA = n ∙ pecado θ,donde n es el índice de refracción del medio en el uso y θ es el medio-ángulo del cono de luz que sale de la fibra (ver Figura 1A). De trigonometría, r = tan θ ∙ d, donde r es el radio del haz y d es la distancia entre la fibra y la muestra. El conector FC coincida con el diámetro del pozo, por lo tanto, la iluminación de la muestra a una distancia d = 2,70 ± 0,20 mm. Luz sale de la fibra en el agua (n = 1.33), lo que r = tan (sin-1 (NA / n)) ∙ d.
- Usando la última ecuación, calcular el radio del haz láser, el área del haz correspondiente y la irradiancia media de láser (láser de potencia dividida por el área del haz) en el objetivo (véase el ejemplo gráfico de la Figura 1B). Estos valores representan la irradiancia media de la zona iluminada.
- Evaluar los errores de las mediciones con la teoría general de la propagación de errores.
Nota: La distancia bntre el conector FC y la muestra se pueden medir por las fotografías de la disposición experimental y post-procesamiento de la imagen utilizando el software apropiado (por ejemplo ImageJ).
- En el día 5, retire medio de diferenciación celular a partir de los experimentos y fijar las muestras con 3,7% (v / v), solución de formaldehído durante 10 min, a continuación, permeabilizar las células con 0,1% (v / v) de Triton X-100 durante 20 min.
- Añadir 3% (w / v) de albúmina de suero bovino (BSA) a las muestras durante 60 minutos para bloquear los sitios de unión de proteína sin reaccionar. Etiquetar las muestras durante la noche anti-βIII-tubulina (5 mg / ml en PBS suplementado con 1% de BSA) a 4 ° C.
- Se incuban las células durante 90 min en la oscuridad con un anticuerpo secundario apropiado (ratón anti-anticuerpo conjugado con TRITC por ejemplo IgG) utilizando una concentración de 0,4-2 mg / ml en 1% de BSA en PBS. Etiquetar los núcleos celulares con DAPI (0,1 mg / ml en agua desionizada) durante 10 min.
Nota: la conjugación de anticuerpos y MIG concentraciónht puede variar de acuerdo con el protocolo de empresa. Lávese las muestras con PBS dos veces durante 5 minutos después de cada etapa de tinción.
- Muestras Imagen de epifluorescencia o microscopía confocal utilizando al menos un 20 × objetivo. Elige el microscopio filtra en consecuencia para el anticuerpo secundario. Seleccionar un filtro DAPI (λ EX = 358 nm; EM λ = 488 nm) para visualizar los núcleos celulares.
- Analizar las imágenes mediante la evaluación de: i) la longitud de las neuritas máximo (registro de la longitud desde la punta de la neurita hasta el comienzo del cuerpo celular), ii) el número de neuritas por célula neuronal (resumir todas las neuritas por célula) y iii) el porcentaje de células con neuritas (dividir el número total de células que expresan βIII-tubulina por el número total de células con un núcleo con tinción positiva) 19.
Inducida por láser 4. intracelular de Ca2 + Imaging
Nota: La solución de BSS puede ser preparado de antemano y se refrigeró durante un máximo de 1 mes. Añadir los suplementos (Fluo-4 de la mañana y Pluronic F-127) en el día del experimento.
- Medir la potencia del láser de salida con un medidor de potencia estándar. Inserte la fibra de distribución de luz en un soporte de fibra óptica y pegarla en un microposicionador. Consulte Brown et al. 20 para más detalles sobre la preparación de la fibra óptica y posicionamiento.
Precaución: Siga las normas generales de seguridad del láser durante la medición de la potencia del láser (por ejemplo, no mire directamente al rayo láser, Usar gafas de protección láser durante la manipulación, evitar la exposición a la luz parásita otros usuarios del laboratorio) <./ Li>
- Colocar las células bajo un microscopio confocal invertido y la posición de la fibra de suministro de luz 250 ± 50 m de distancia de la célula diana en el modo de iluminación de transmisión. A esta distancia, utilizar las ecuaciones presentadas en 3.3.1 para calcular el radio del haz en el blanco.
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Representative Results
Mediante el uso de los Protocolos 1, 2 y 3 descritos aquí, se observó un efecto estimulador en la diferenciación en células NG108-15 neuronales cultivadas con Au NP (Au rupias, poli (estirenosulfonato) presenta el revestimiento Au rupias y revestido con sílice Au NR) después de láser exposiciones entre 1,25 y 7,5 W · cm de -2. Las imágenes confocales de marcado con rhodamineB Au NR demostraron que las partículas se interiorizaron de 1 día de incubación 12. La localización se observó predominantemente en el citoplasma de la célula, lo que indica que el mecanismo preferido de la captación fue a través de la membrana cuerpo celular 12. Los principales cambios morfológicos detectados después de inducir la diferenciación en células neuronales NG108-15 fueron la detención de la proliferación, la expresión de la proteína βIII-tubulina y la consecuencia de neuritas, que fueron analizados en términos de máxima duración y el número 22.
Las muestras cultivadas con NR mostraron un aumento de la longitud de las neuritas en la irradiancia láserniveles ANCE medidos aquí (entre 1,25 y 7,5 W · cm -2). Las muestras de control (células cultivadas sin NPs y se irradió con la misma potencia del láser) no mostraron ningún cambio significativo en la longitud. El uso de una dosis de irradiación de 7,5 W · cm -2 la longitud de las neuritas final del NG108-15 cultivaron con Au NR fue aproximadamente 36% mayor (p <0,01) que las muestras sin láser irradiado. Este comportamiento no estaba vinculado específicamente a la química de la superficie de los NR. Estos valores eran casi 20% mayor que las neuritas desarrolladas por NG108 -15 solos y expuestos al mismo valor de la exposición al láser (p <0,05) 12. Estos resultados están en línea con los estudios publicados previamente en las células neuronales PC12 cultivadas con nanotubos piezoeléctricos y irradiados con radiación de ultrasonido 7.
Los experimentos de control sin Au NR también mostraron algunos efectos estimulantes de la luz 780 nm en términos de porcentaje de neuronas con axones y número de neurites por neurona. Esta estimulación fue más eficaz para potencias de láser inferiores (1,25 W ∙ cm -2) con la consiguiente disminución en la energía más alta del láser (7,5 W ∙ cm -2) 12. Una estimulación moderada causada por los NPs sin ninguna irradiación con láser (poli (estirensulfonato) y presenta el revestimiento recubierto de sílice solamente) se detectó en el porcentaje de neuronas con neuritas 12. Estos resultados están en línea con las observaciones publicadas recientemente que las nanopartículas de oro pueden aumentar la actividad neuronal in vitro 23,24. La figura 2 muestra un ejemplo de las imágenes de epifluorescencia de células neuronales diferenciadas NG108-15 cultivadas solas (Figura 2A) o con Au rupias (Figura 2B ) y se irradió con diferentes potencias de láser (indicado en la figura).
El potencial de Ca intracelular liberación fotogenerada 2+ se evaluó mediante luz pulsada NIR de acuerdo con los protocolos 1, 2, y4. Los iones de calcio juegan un papel importante en diferentes actividades celulares, tales como mitosis, la contracción muscular y la extensión de neuritas 25,26. En respuesta a un estímulo, Ca 2+ aumenta, oscila y disminuye, dando lugar a la activación, modulación o la terminación de una función celular específica. Recientemente, Ca 2 + transitorios también se han observado como consecuencia de la exposición de láser IR en los cardiomiocitos. En ese trabajo, las respuestas de la Ca 2 + evocados después de la exposición IR mostró amplitudes bajas y tiempos de recuperación más rápidos que los espontáneos Ca 2 + transitorios 2. La figura 3 muestra un ejemplo de NG108-15 células neuronales cargadas con Fluo-4 de la mañana y fotografiados con una microscopio confocal. Fluo-4 a.m. se observó para entrar en la membrana celular de una manera no disruptiva, lo que resulta en una distribución generalmente uniforme del indicador a través del citoplasma de la célula. Sólo se detectó tinción orgánulo nuclear o citoplasmática menor. Como se indicó anteriormente, Se esperaba que los NR que se encuentra intracelularmente 12. NG108-15 células neuronales cultivadas solas o con Au NR y poli (estirenosulfonato) recubiertas-Au NR se expusieron después a irradiancias láser entre 0,07 J ∙ cm -2 y 370 J ∙ cm -2, con la frecuencia de láser modulado en el intervalo de 0,5-2 Hz.
La Figura 4 muestra ejemplos representativos de cómo se asigna la amplitud de las respuestas como una función del tiempo. La amplitud de la Ca 2 + respuesta varió con la exposición radiante (Figura 4A - C) y no se observó que se active consistentemente por los pulsos de láser (Figura 4C) 13. Las explicaciones más probables fueron el agotamiento transitorio de Ca2 + intracelular tiendas atribuidos a incompleta Ca 2+ 2 de carga o la diferente eficiencia de NR internalización en las células neuronales. Cuando no se utilizaron rupias en culture (los experimentos de control, Figura 4D), también se observó un efecto estimulador de la luz 780 nm. Sin embargo, esto produce picos de amplitud de fluorescencia más bajos y una menor probabilidad de activación (detectado sólo en el 16% de las muestras analizadas). En general, se logró una 48% de probabilidad de activación de las células inducida por láser NR ya pesar de los eventos de fondo debido a la luz 780 nm, la exposición de las células tratadas-NR demostró una eficacia más alta de la estimulación con menor energía láser y los picos más altos de respuesta 13. De hecho, la respuesta de calcio se encontró que pico a 0,33 J ∙ cm -2 en las células tratadas-NR. Esto se atribuyó a la inhibición térmica 13. Durante los experimentos, no se detectó evidencia de la formación de ampollas o cualquier otra forma de disrupción de la membrana celular, lo cual es consistente con los resultados de Huang et al. Que informaron fotodestrucción celular con una relativamente alta densidad de potencia de 19 W ∙ cm -2 aplica para 4 2 min7. No hay actividad espontánea en las células tratadas con NR se registró sin exposición láser.
Figura 1: Fibra óptica configuración experimental (Un) y irradiancias medias láser como una función de la potencia del láser para un rayo láser de la superficie es igual a 0.4 mm 2 (B). Parámetros del haz son (A): el medio-ángulo del cono máximo de luz que sale de la fibra (θ), el radio del haz (r) y la distancia entre la fibra óptica y la muestra (d).
Figura 2: Ejemplos de imágenes de epifluorescencia de células neuronales diferenciadas NG108-15 cultivadas solas (A) o con Au NR (B) y se irradió con diferentes potencias de láser (indicado en la figura). Las muestras fueron incubated para un día antes de irradiación con láser. Las células se fijaron y se marcaron para tubulina anti-β-III (rojo) y DAPI (azul) tres días después de la irradiación con láser. Las barras de escala son 100 micras.
Figura 3: Ejemplo de NG108-15 células neuronales diferenciadas cargados con Fluo4-AM Ca 2+ indicador La imagen fue tomada utilizando un microscopio confocal invertido con un objetivo de inmersión en aceite 40X..
Figura 4: Ejemplos representativos de inducidas por láser Ca 2+ variaciones como una función del tiempo en NG108-15 células neuronales cultivadas en condiciones libres de suero durante tres días con (A) poli (estirenosulfonato) NR -aU, (B, C) Au NR, y (D) sin NR (muestra de control). Estos resultados fueronobtenido con pulsos de láser de 100 mseg (A, C, D) y 50 mseg (B). El frecuencias utilizadas para los experimentos (líneas verticales discontinuas) eran 1 Hz (A - C) y 0,5 Hz (D). Las exposiciones radiantes calculadas fueron 69,4 J ∙ cm -2 (A), 34,7 J ∙ cm -2 (B), 0.37 J ∙ cm -2 (C) y 138,87 J ∙ cm -2 (D). F max / F 0 indica el aumento máximo de fluorescencia detectada en NG108 -15 células neuronales, desde la calibración con ionomicina (reproducido con permiso 13).
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Discussion
Los protocolos descritos en esta presentación se describe cómo la cultura, diferenciar y ópticamente a estimular las células neuronales utilizando absorbentes extrínsecos. Las características NR (por ejemplo, dimensiones, forma, longitud de onda de resonancia de plasmón y química de la superficie) y los parámetros de estimulación láser (tales como longitud de onda, longitud de pulso, frecuencia de repetición, etc.) se pueden variar para que coincida con diferentes necesidades experimentales. Los efectos sobre el comportamiento celular pueden ser monitorizados utilizando ensayos y materiales biológicos estándar. En general, el enfoque proporciona un simple, pero potente, forma de irradiar las poblaciones de células in vitro y podría extenderse a pilas, las muestras de tejido y los estudios in vivo.
Los principales requisitos que NR Au necesitan para satisfacer para ser utilizado para aplicaciones biológicas son la estabilidad (tanto químicas como físicas) y la biocompatibilidad. Esto último es particularmente crítico, debido a la presencia de un tensioactivo catiónico (comúnly CTAB) en la superficie de la Au. CTAB se sabe que inducen citotoxicidad, tanto in vitro como in vivo 28 29 y se utiliza comúnmente durante el proceso de síntesis para conducir la formación NR-30 forma. Estabilidad y biocompatibilidad a menudo se mejoraron depositando capas adicionales en la superficie de Au NR (por ejemplo, polietilenglicol, sílice) 31. Para evaluar la biocompatibilidad, diferentes ensayos se pueden usar in vitro (por ejemplo, en vivo / muerto, MTS, MTT, etc.) mientras que el análisis histológico se realiza a menudo durante los experimentos de tejido 7,8,12,15.
Otro de los retos a enfrentar al trabajar con nanomateriales es la dificultad de determinar correctamente su concentración molar. La gran variedad de NPs en términos de forma, tamaño y propiedades químicas hace que las técnicas disponibles actualmente adecuada para ciertas clases de partículas. Por ejemplo, el scatt dinámica de luz estándarEring método asume que NPs tienen una forma esférica y de dispersión de luz isotrópicamente 17. Por lo tanto, la aplicación de este método a los resultados Au NR en las discrepancias entre la concentración medida y la real. La cuestión de la concentración de NP es particularmente problemático si se relaciona con el campo de la nanomedicina, donde necesita la concentración administrada a ser controlado con precisión a fin de maximizar la eficacia del proceso (por ejemplo, para aplicaciones de administración de fármacos) y minimizar la toxicidad de los nanomateriales 17. En los estudios aquí presentados, la densidad óptica utilizada dio buenos resultados en términos de viabilidad celular y número de partículas.
Debido a sus propiedades de absorción intrínsecas, Au PN se utilizan a menudo en combinación con una fuente de láser. Durante la exposición, absorción y dispersión son los dos procesos principales que puedan producirse en la superficie de los NPs. Si la longitud de onda de láser coincide con la longitud de onda de resonancia de plasmón, la absorción a menudoprevalece sobre la dispersión, emocionantes los electrones de conducción en la superficie NP. Estos forman un gas de electrones que se aleja de su posición de equilibrio y crea una oscilación resonante coherente llama la resonancia de plasmón de superficie localizada (LSPR). La energía se transfiere entonces a la red cristalina NP en forma de calor, que a partir de entonces se disipa rápidamente en el ambiente circundante 32. Puesto que el calor es el principal efecto observado después de la excitación del NR LSPR, es aconsejable para monitorear la viabilidad celular después de la exposición de láser.
Se ha planteado la hipótesis de que los efectos observados en el crecimiento de las neuritas y el Ca2 + intracelular vía eran debido al calentamiento transitoria derivada de excitación de la LSPR. Esta hipótesis está en línea con la activación del canal TRPV1 sensible a la temperatura después de la exposición magnética del PN de ferrita 5. Este proceso también es consistente con las observaciones que los canales TRPV4 térmicamente sensibles play un papel importante en estimulación nerviosa infrarrojos 33. A un nivel molecular, se ha demostrado recientemente que TRPV4 es termosensible sólo después de la interacción de phosphoinositide -4,5 -biphosphate (PIP 2) con el canal 34. Por lo tanto, es posible que el calentamiento transitorio que surge después de la excitación NR podría servir para acelerar y / o inducir la apertura de los canales de TRPV4. Esta hipótesis puede ser confirmada por experimentos futuros Ca2 + mediante el uso de Ca 2 + - medio libre y / o controles moleculares sobre el agotamiento PIP 2.
Diferentes grupos han demostrado también que los pequeños gradientes de temperatura en el rango de temperatura fisiológica se pueden utilizar para inducir otras respuestas, tales como cono de crecimiento neuronal de guía 25 o despolarizante corrientes en células de riñón embrionario humano 35. Yong y colaboradores registraron un aumento significativo de la actividad de la señal eléctrica en primaria auditiva neuronas cultoured con recubiertas de sílice Au NR después de la irradiación con láser de los NR en el LSPR. El calentamiento producido por las partículas irradiadas con láser se midió usando técnicas de patch-clamp 14. Más recientemente, Eom et al. Registró un aumento en la amplitud de CNaPS después de la exposición de láser de 3,4 × 10 9 Au NR cuando perfundido continuamente en las proximidades de la vaina del haz del nervio de un nervio ciático de rata 15.
El efecto estimulador del diodo láser de 780 nm observado durante los experimentos no estaba ligada al calor generado por la absorción de agua, ya que esto es conocido por ser despreciable a 780 nm 36. Los resultados publicados anteriormente también han informado de efectos estimulantes de 780 nm de luz sobre el tejido neuronal in vivo 37,38. Los estudios in vitro han demostrado la participación de especies reactivas del oxígeno en el proceso 39. Sin embargo, los mecanismos detallados por el cual NIR estimulación afecta transcriptio genn y otras actividades celulares son actualmente sin resolver. Los datos actuales sugieren la interacción de diferentes efectos en la estimulación, incluyendo la absorción de fotones dentro de cromóforos en la mitocondria (casi 50% de la energía en 780 nm puede ser absorbida por el citocromo c oxidasa) 37,39-41, los cambios en la permeabilidad de la membrana al calcio 37 y la inhibición de la actividad inflamatoria en las células 37.
Los resultados presentados en este manuscrito demuestran que los absorbedores de nanopartículas son muy prometedores para futuras aplicaciones en la estimulación óptica de las células neuronales. La ventaja principal reside en la capacidad de la luz NIR para penetrar profundamente en los tejidos (ventana terapéutica). Estos resultados también muestran que los absorbedores de nanopartículas pueden mejorar y / o sustituir el proceso de estimulación neural de infrarrojos basado en la absorción de agua. Para las futuras aplicaciones en prótesis neurales, sería de interés para investigar diferentes functionalizat superficieiones afinidad química para con los axones neuronales, que son los principales objetivos para muchas aplicaciones de estimulación ópticos.
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Acknowledgments
Los autores desean reconocer NanoVentures Australia para el apoyo financiero de viajes y el Prof. John Haycock por haber acogido parcialmente esta investigación en la Universidad de Sheffield y la Sra Jaimee Mayne por su ayuda durante el rodaje.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Au NR | Sigma Aldrich | 716812 | |
| NG108-15 | Sigma Aldrich | 8811230 | |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6546 | |
| FCS | Life Technologies | 10100147 | |
| L-glutamine | Sigma Aldrich | G7513 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| Amphotericin B | Life Technologies | 15290018 | |
| Formaldehyde | Sigma Aldrich | F8775 | |
| Triton X-100 | BDH | T8532 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A2058 | |
| Anti-βIII-tubulin | Promega | G7121 | |
| TRITC-conjugated anti-mouse IgG antibody | Sigma Aldrich | T5393 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Fluo-4 AM | Invitrogen | F14201 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | 472301 | |
| Pluronic F-127 | Invitrogen | P6867 | |
| UV-Vis spectrometer | Varian Medical Systems Inc. | Cary 50 Bio | |
| Mini centrifuge | Eppendorf | Mini Spin | |
| Sonic bath | Unisonics Australia | FPX 10D | |
| Cell culture incubator | Kendro | Hera Cell 150 | |
| Cell culture centrifuge | Hettich | Rotofix 32A | |
| Laser diode | Optotech | 780 nm single mode fibre - coupled LD | |
| Optical fiber | Thorlabs | 780 HP | |
| Power meter | Coherent | Laser Check | |
| ImageJ | http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html | ||
| Epifluorescent microscope | Axon Instruments | ImageX-press 5000A | |
| μ-slide well | Ibidi | 80826 | |
| Inverted confocal microscope | Carl Zeiss Microscopy Ltd. | LSM 510 meta-confocal microscope | |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS210 |
References
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