Een nieuw ex vivo voorbereiding voor het afbeelden van de muis ruggenmerg. Dit protocol maakt twee-foton beeldvorming van levende cellulaire interacties gehele ruggenmerg.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Twee-foton Imaging van Cellular Dynamics in de Muis Spinal Cord
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Twee-foton (2P) microscopie wordt gebruikt om cellulaire dynamica en interacties diep in levende, intacte weefsels te onthullen. Hier presenteren we een methode voor live-celbeeldvorming in het muizenruggenmerg. Deze techniek is uniek geschikt om neurale voorloperceldynamica (NPC) te analyseren na transplantatie in ruggenmergen met neuroinflammatoire demyeliniserende aandoeningen. NPCs migreren naar locaties van axonaal letsel, prolifereren, differentiëren in oligodendrocyten en nemen deel aan directe remyelinisatie. NPCs zijn daardoor een veelbelovende therapeutische behandeling om chronische demyeliniserende ziekten te verlichten. Omdat getransplanteerde NPCs naar de beschadigde gebieden aan de ventrale kant van het ruggenmerg migreren, is traditionele intravitale 2P-beeldvorming onmogelijk en was er eerder alleen informatie over statische interacties beschikbaar met behulp van histochemische kleuringsbenaderingen. Hoewel deze methode werd ontwikkeld om getransplanteerde NPCs in het ventrale ruggenmerg te beeldvormen, kan deze worden toegepast op tal van onderzoeken naar getransplanteerde en endogene cellen in het gehele ruggenmerg. In dit artikel demonstreren we de voorbereiding en beeldvorming van een ruggenmerg met axenen die geverbeterd geel fluorescent eiwit tot expressie brengen en getransplanteerde NPCs die geverbeterd groen fluorescent eiwit tot expressie brengen.
Inleiding
Muismodellen van demyelinisatie, met inbegrip van experimentele auto-immune encefalomyelitis (EAE) en intracraniële infectie met neuroadapted muis hepatitis virus (MHV), zijn uitstekende tools waarmee moleculaire pathways en cellulaire interacties geassocieerd met de ziekte te bestuderen. Ze hebben geleid tot en ondersteunde de doeltreffendheid van FDA goedgekeurde farmaceutische therapieën, vooral gericht op beëindiging van auto-immuniteit en ontsteking 1. Echter, zodra endogene remyelinisatie is mislukt, de momenteel goedgekeurde behandelingen geen effectief herstellen lesies in het centrale zenuwstelsel. Derhalve-reparatie gerichte therapieën in dit sta....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
OPMERKING: Ethiek Verklaring: Het protocol voor de behandeling van dieren werd goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) van de Universiteit van Californië, Irvine, protocol # 2010-2943.
1. verwijderen van het ruggenmerg
- Leg papieren handdoeken bevochtigd met ~ 100% vloeibare isofluraan, USP in euthanizing kamer en plaats droog papieren handdoeken op de top. Plaats de muis in de kamer op de top van de droge papieren handdoeken, zodat de muis niet de isofluraan is het aanraken en zorg ervoor dat de kamer wordt gedekt. Wacht ten minste één minuut na ademstilstand zodat de muis gedood.
- Voer ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Terwijl de geëxplanteerde ruggenmerg beeldvorming protocol kan worden gebruikt om fluorescentie binnen het ruggenmerg visualiseren, onze representatieve resultaten tonen eGFP-NPC interacties met eYFP-axonen. Eerst geven we de ingebedde ventrale ruggenmerg preparaat in figuur 1A. Vervolgens laten we de 2P microscoop setup en belangrijke onderdelen in figuur 1B. Figuur 2 toont eGFP en eYFP fluorescentie in één z-stack binnen de ventrale ruggenmerg. Overname van opeenvolgende z-stack.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Real-time 2P beeldvorming van intact weefsel is nodig om NPC kinetiek en interacties na transplantatie in de gedemyeliniseerde muis ruggenmerg te onderzoeken. Intravitaal 2P beeldvorming wordt algemeen gebruikt om cellulaire dynamiek op de dorsale zijde van het ruggenmerg bepaald in levende muizen, en is gebruikt om dorsale demyelinisatie bestuderen demyeliniserende ziekte 17-19. Omdat getransplanteerde NPC migreren naar de ventrale witte stof, die te diep ligt ten afbeelding in situ middels 2P microscopie, e.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen concurrerende belangen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door National Institutes of Health (NIH) Grants R01 GM-41514 (aan M.D.C.), R39 GM-048071 (aan I.P.), en R01 NS-074987 (aan T.E.L.) en de National Multiple Sclerosis Society (NMSS) Collaborative Center Research Award CA1058-A-8 (aan C.M.W., T.E.L. en M.D.C.), NMSS Grant RG4925, NIH Training Grant T32-AI-060573 (aan M.L.G.), NMSS Postdoctoral Fellowship FG 1960-A-1 (aan J.G.W.), en financiering van de George E. Hewitt Foundation for Medical Research (M.P.M.).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Isoflurane, USP | Piramal Critical Care, Inc | N/A | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | sharp |
| scalpel blade #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Luer rongeurs | Fine Science Tools | 16001-15 | |
| Graefe forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| Vannas scissors | Fine Science Tools | 15615-08 | |
| scalpel blade #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| RPMI-1640 | Gibco | 12-115F | |
| agarose, low gelling temperature | Sigma | A9414-25G | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| Vetbond (tissue adhesive) | 3M | 1469SB | |
| 22 mm square cover slip | Fisher Scientific | 12-547 | |
| 25X dipping objective, 1.1 NA | Nikon | CFI Apo LWD 25XW | |
| Single inline solution heater | Warner Instruments | 64-0102 | |
| 520 nm single-edge dichroic beam splitter | Semrock | FF520-Di02-25x36 | Brightline |
| 560 nm single-edge dichroic beam splitter | Semrock | FF560-FDi01-25x36 | Brightline |
| photomultiplier tubes | Hamamatsu | R928 | |
| C/L variable-speed tubing pump | Masterflex | 77122-22 | |
| digital thermometer | Comar Instruments | 3501 | |
| Chameleon Ultra Ti:Sapphire laser | Coherent | N/A | |
| Slidebook 6 software | 3i | N/A | |
| Imaris 7.7 software | Bitplane | N/A |
Referenties
- Robinson, A. P., Harp, C. T., Noronha, A., Miller, S. D. The experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model of MS: utility for understanding disease pathophysiology and treatment. Handb Clin Neurol. 122, 173-189 (2014).
- Pluchino, S., Zanotti, L., Brini, E., Ferrari, S., Martino, G.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
