Summary
Un nuovo ex vivo preparazione per l'imaging del midollo spinale di topo. Questo protocollo consente a due fotoni imaging interazioni cellulari vivi tutto il midollo spinale.
Introduction
Modelli murini di demielinizzazione, tra cui l'encefalomielite sperimentale autoimmune (EAE) e l'infezione intracranica con neuroadapted mouse virus dell'epatite (MHV), sono ottimi strumenti per studiare percorsi molecolari e interazioni cellulari associati con la malattia. Essi hanno portato e sostenuto l'efficacia della FDA ha approvato terapie farmacologiche, rivolti principalmente la cessazione di autoimmunità e infiammazione 1. Tuttavia, una volta che la rimielinizzazione endogena ha fallito, le terapie attualmente approvate non riparano efficacemente lesioni demielinizzati nel sistema nervoso centrale. Pertanto, le terapie di riparazione focalizzato in questa fase della malattia sono fondamentali per la riduzione dei sintomi cronici e il miglioramento della qualità della vita. Recentemente, le cellule precursori neurali (NPC) sono venuti alla ribalta come un potenziale rigenerativo modalità terapeutica per aree di infiammazione e demielinizzazione bersaglio. Diversi studi hanno evidenziato la capacità di NPC di indurre endogenonoi rimielinizzazione e partecipare direttamente rimielinizzazione 2-8. Perché NPC sono coinvolti in rimielinizzazione diretta, è fondamentale per capire le loro cinetiche e le interazioni con le cellule endogene successivi al trapianto. Dopo il trapianto, NPC migrano ventralmente ad aree di danno sostanza bianca, poi rostralmente e caudalmente relativi al sito di trapianto 5,9. La cinetica della migrazione differiscono in risposta a stimoli ambientali; NPC trapiantati in un midollo spinale danneggiato non hanno velocità maggiori rispetto NPC trapiantate in un midollo spinale danneggiato 6. Dopo un periodo migratorio, trasferiti NPC proliferano ampiamente, ad un tasso più elevato in un cavo danneggiato rispetto spinale per un midollo spinale intatto 6. Infine, la maggior parte degli NPC differenziarsi in oligodendrociti e avviare 4,6,9 rimielinizzazione diretta.
La lesione demyelinated è complesso e può includere una popolazione eterogenea di cellule in diverse fasi di unctivation. Ad esempio, un sclerosi multipla (MS) lesione attiva può includere una frazione significativa di cellule T attivate, microglia e dei macrofagi M1 M1, ma un MS lesione cronica silente può essere costituito principalmente da astrociti reattivi con poche cellule infiammatorie 10-13. A causa della diversità delle cellule effettrici, a due fotoni (2P) per immagini in modelli murini di demielinizzazione è uno strumento estremamente utile per aiutare a capire le interazioni cellulari locali all'interno della lesione. In MS e molti modelli di ricerca MS ampiamente utilizzati, la maggior parte delle lesioni si trovano sul lato ventrale del midollo spinale, una regione inaccessibile per l'imaging intravitale 2P grazie alla profondità della lesione e l'alto contenuto lipidico del midollo spinale. Per aggirare questi problemi e interazioni studio cellula-cellula all'interno lesioni lungo il midollo spinale ventrale abbiamo sviluppato un semplice vivo 2P preparazione di imaging 6 ex.
Questo studio fa seguito ad una precedente pubblicazione metodi, che ha mostratola procedura per il trapianto di proteine maggiore fluorescente verde (eGFP) NPC esprimente nel midollo spinale dei topi dopo JHMV ceppo di demielinizzazione MHV-indotta 14. Cinque settimane di età i topi sono infettati con JHMV e trapiantati con eGFP-NPC a livello toracico 9 al giorno 14 dopo l'infezione. Il protocollo presentato qui fornisce la procedura dettagliata su come estrarre il midollo spinale, fare un ex vivo agarosio preparazione, e di immagine trapiantato interazioni eGFP-NPC con proteine maggiore giallo fluorescente (EYFP) assoni esprimente. Mice esprimenti EYFP sotto il promotore Thy1 specifico-neuronale sono stati utilizzati in questa procedura 15. Solo alcuni degli assoni esprimono EYFP, rendendolo utile per l'imaging singoli assoni. Qui vi mostriamo midollo spinale rimossi a 7 giorni dopo il trapianto; tuttavia, midollo spinale possono essere estratti in qualsiasi punto nel tempo dopo il trapianto. Mentre noi mostriamo interazioni di NPC con assoni danneggiati, il nostro protocollo può essere utilizzato in combinazione con marcatori fluorescenti geneticidi altri tipi di cellule per indagare una moltitudine di interazioni cellulari che si verificano durante il mouse midollo spinale.
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Protocol
NOTA: Etica Dichiarazione: Il protocollo per la gestione degli animali è stato approvato dalla cura e l'uso degli animali Comitato Istituzionale (IACUC) della University of California, Irvine, il protocollo # 2010-2943.
1. Rimozione del midollo spinale
- Posizionare asciugamani di carta bagnati con ~ 100% di liquido isoflurano, USP di eutanasia da camera e mettere gli asciugamani di carta a secco in cima. Posizionare il mouse nella camera in cima ai tovaglioli di carta a secco in modo da mouse non sia a contatto con l'isoflurano e assicurarsi che la camera è coperto. Attendere almeno un minuto dopo la cessazione della respirazione per garantire che il mouse è eutanasia.
- Eseguire una sezione spinale del collo per assicurare il mouse è eutanasia. Non eseguire una dislocazione cervicale in quanto ciò potrebbe danneggiare il midollo spinale.
- Spruzzare il mouse con etanolo al 70% per bagnare i capelli.
- Utilizzare forbici Belle taglienti per rimuovere i capelli e la pelle dalla parte posteriore del mouse per esporre la colonna vertebrale cervicale lamina da circa 1 (C1) A lamina sacrale 4 (S4).
- Usando un bisturi con lama # 10, fare incisioni a sinistra ea destra della colonna vertebrale per separarlo dal muscolo e grasso. Questo renderà la rimozione del midollo spinale molto più facile.
- optional: a curve rongeurs Luer possono essere utilizzati per scavare via la carne supplementare.
- Tenendo la parte superiore delle vertebre spinali con seghettati pinze Graefe, inserto in titanio curva Vännäs forbici con il lato curvo in alto nella colonna vertebrale esposta a C1, facendo attenzione a non toccare il midollo spinale.
- Far scorrere il titanio curva forbici Vännäs tutta la strada a destra e fare un piccolo taglio. Un piccolo suono crunch deve essere ascoltato e sentito come le forbici tagliano le vertebre. Ripetere questo taglio sul lato più a sinistra del cavo. Fare attenzione a non andare troppo in fretta o fare troppo grande di un taglio come questo rischiare di danneggiare il cavo con le forbici.
- Il singolo lamina deve poter essere sollevato con la pinza una volta che i lati delle vertebre sono tagliate. REPEAT questo passaggio per ogni lamina fino S4, continuando a tenere e tirare indietro le vertebre del midollo spinale.
NOTA: le vertebre di sopra del sito di trapianto probabilmente verrà fuori una volta che è tagliato al sito di trapianto. Continuare la procedura di avviamento appena sotto il sito di trapianto. - optional: gettare le vertebre verso il basso per vedere dove il sito di trapianto è e misura e tagliare ~ 20 millimetri rostrale e caudale al sito di trapianto.
NOTA: Quando si trapiantano NPC più non saranno necessari come gli NPC trapiantati in genere non migrano più lontano di 15 mm. La quantità di midollo spinale necessaria dipenderà esperimento e migrazione caratteristiche del tipo di cellula trapiantato. Effettuare tagli rostrale e caudale equidistanti al sito di trapianto consentirà al sito di trapianto di essere poste più facilmente durante l'imaging. - Usando un bisturi con lama # 11 tagliare accuratamente i gangli a destra e sinistra del lato ventrale del midollo spinale a partire dalla fine rostrale. Questo will consentire il midollo spinale per essere rimosso dalle vertebre ventrale più facilmente.
NOTA: Fatto rapidamente (passaggi 1,7-1,11), il midollo spinale non si asciugherà. Tuttavia, 1x PBS può essere somministrato al cavo per mantenerlo umido. - Capovolgere il mouse e tenere premuto il mouse verso l'alto in modo che il midollo spinale è rivolto verso il basso. Sbucciare cautela il midollo spinale con pinze Graefe seghettate chiusi. Senza intaccare il midollo spinale, tagliare accuratamente ogni gangli rimanenti per consentire al midollo spinale da sollevare in un unico pezzo integro.
- Assicurarsi che il midollo spinale è in RPMI-1640 e posizionarlo sul ghiaccio per il trasporto al microscopio 2P.
2. Preparazione di Spinal Cord for Imaging
- Incorporare midollo spinale in agarosio
- Tenere il midollo spinale isolato in refrigerate RPMI-1640 sul ghiaccio prima di imaging.
- Pesare agarosio (bassa temperatura di gelificazione) e preparare una soluzione al 5% in 5 ml di PBS 1x. Microonde la soluzione di agarosio 5% per 15 secondi per sciogliere la agnata e lasciar raffreddare la soluzione a 37 ° C.
- Preparare il midollo spinale appoggiandolo su un foglio di Parafilm con il lato ventrale rivolto verso l'alto.
- Pipettare circa 5 ml di soluzione di agarosio 5% sopra il lato ventrale del midollo spinale. Sia l'agarosio solidificare per raffreddamento a temperatura ambiente. Solidificazione completa richiede circa 5 minuti.
- Applicare un leggero strato di adesivo di tessuto per una copertura di slittamento piazza 22 millimetri.
- Invertire il midollo spinale incorporato, posizionando il lato ventrale su parafilm. Il lato dorsale sarà ora rivolta verso l'alto. Rispettare la polizza di copertura sul lato dorsale, e immergere l'agarosio incorporato midollo spinale / copertura preparazione slittamento in RMPI per solidificare l'adesivo. Rimuovere l'eccesso solidificato agarosio con una lama di rasoio.
- Montaggio del midollo spinale sul palco microscopio
- Applicare vaselina sul fondo del vetrino. Questo stabilizzerà la preparazione durante la perfusione.
- Posizionare la preparazione del midollo spinale in unl'imaging bene sul palco microscopio con il lato ventrale rivolto verso l'alto verso l'obiettivo immersione 25X. Il pozzo di imaging costruito su misura è di circa 20 mm di profondità, 50 mm di lunghezza, e 50 mm di diametro.
- Immagine mentre superfusing la preparazione con riscaldato (37 ° C), ossigenato (95: 5 ossigeno: anidride carbonica-CarboGen) medium RPMI-1640 senza siero.
- Supporti Pre-calda a 37 ° C nel bagnomaria e collegarlo alla pompa tubo inserendo il tubo nella bottiglia media.
- Mantenere la temperatura del fluido a 37 ° C un dispositivo riscaldatore al collegamento del tubo alla camera. Mezzi Superfuse attraverso bene a 3 ml / min usando tubo collegato alla pompa tubo (Figura 1B).
3. 2P Imaging di ventrale del midollo spinale
- Setup Microscopio
- Acquisire le immagini da Thy1-EYFP midollo spinale con un Ultra Ti Chameleon: laser Sapphire sintonizzati a 900 nm. Attenuare potenza del laser inesemplare a <5% per garantire la fototossicità minimo 16. Mantenere la temperatura mediante perfusione di ossigeno-perfuso RPMI-1640 ad una costante di 37 ° C utilizzando un unico riscaldatore soluzione di linea di garantire immagini stabili, e da evitare la dispersione dei tessuti e danno cellulare.
- Per separare segnale fluorescente eGFP e EYFP, posizionare una 520 nm dicroico singolo-edge e un nm singolo bordo beam splitter dicroico 560 in serie per separare 2P emissione in tre canali, volutamente dividendo l'emissione verde per migliorare la visibilità.
NOTA: Questi canali sono indicati come blu-verde (emissione <520 nm), verde-giallo (520-560 nm), e il rosso (emissione> 560 nm). Tubi fotomoltiplicatori rilevano emessi luce in ogni canale.
- Aree di imaging di posizionamento di interesse
- Utilizzando l'oculare e una fonte di luce campo chiaro, mettere a fuoco l'obiettivo di immersione a bordo ventrale del midollo spinale per impostare un punto di riferimento.
- Assicurarsi fonte di luce ambiente è sicuro spento e swprurito a 2P eccitazione aprendo l'otturatore laser.
- Se disponibile, durante la ricerca dei tessuti per le aree di interesse, di utilizzare un valore inferiore di risoluzione, un volume più alto senza zoom digitale, e velocità di scansione più elevata rispetto a quando l'acquisizione di immagini finali. Le impostazioni tipiche con questo sistema durante la ricerca dei tessuti per una regione di interesse sono: Risoluzione: 256 pixels; Volume: x = 600 micron, y = 600 micron, z = 0-300 micron.
- Osservare gli assoni EYFP vicino al bordo ventrale del midollo spinale. Secondo segnale armonico da collagene (blu) sarà più luminoso sul bordo del tessuto del midollo spinale. Individuare gli assoni EYFP solo dorsale per il secondo segnale armonica dal collagene e il segnale EYFP viene visualizzati nel canale verde-giallo.
- Individuare il sito di trapianto nel centro longitudinale della preparazione del midollo spinale 14. Per i topi 1 giorno dopo eGFP-NPC trapianto, individuare il sito di trapianto puntando il percorso del fascio nel piano z in profondità nei tessuti. Il sito trapianto will variare leggermente tra gli animali, ma è generalmente trova ~ 200 micron dal bordo ventrale. Osservare i gruppi di eGFP-NPC nei tratti di sostanza bianca, più vicino ai bordi ventrali e laterali nei topi dopo giorno 1 post-trapianto.
- Acquisizione immagini finali
- Acquisire risoluzione di 512 pixel; Volume: x = 270 micron, y = 212 micron, e z = 100 micron utilizzando il software Slidebook 6. Compilare z-stack con l'acquisizione di piani focali sequenziali in incrementi di 2,5 micron.
- Eseguire una scansione bidirezionale con adeguata compensazione per garantire una rapida quantificazione di tutti gli oggetti che migrano nel midollo spinale interlacciato. Assicurarsi che il frame rate di acquisizione ideale per determinare la velocità cellulari all'interno del midollo spinale è di circa 1 frame / sec.
NOTA: le impostazioni di imaging possono essere modificate per le preferenze dei singoli utenti, quali frame rate di acquisizione, la risoluzione delle immagini e dei volumi di imaging. Volumi di imaging più grandi in genere più tempo per acquisire a un GIVRisoluzione en. - Analizzare, colture, liscio, e PseudoColor file immagine Slidebook con il software di analisi di immagine, come Bitplane Imaris 7.7. Produrre video finali time-lapse da pettinatura volumi di imaging consecutivi utilizzando un processo automatizzato in Slidebook e Imaris.
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Representative Results
Mentre il protocollo di imaging midollo spinale espiantato può essere utilizzato per visualizzare alcuna fluorescenza all'interno del midollo spinale, i nostri risultati dimostrano rappresentativi interazioni eGFP-NPC con EYFP-assoni. In primo luogo, noi mostriamo la preparazione ventrale del midollo spinale incorporato nella Figura 1A. Avanti, mostriamo la configurazione 2P microscopio e componenti chiave nella Figura 1B. Figura 2 dimostra eGFP e EYFP fluorescenza in una singola z-stack all'interno del midollo spinale ventrale. Acquisizione di consecutivi z-stack può essere compilato per la produzione di video time-lapse per analizzare le dinamiche cellulari in tempo reale all'interno del tessuto intatto. Utilizzando un 520 nm dicroico singolo bordo e una 560 nm a singolo bordo beam splitter dicroico, come notato nel protocollo, in grado di separare il segnale eGFP e EYFP. I singoli canali possono essere pseudocolored software di imaging con verde e giallo.
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Figura 1: midollo spinale e la configurazione microscopio. (A) A midollo spinale incorporato in un gel di agarosio al 5% (a sinistra) e montato su un vetrino coprioggetto dopo la rimozione di agarosio eccesso (destra). (B) Un'immagine di setup microscopio con componenti chiave etichettati. 1. Bagnomaria impostato a 37 ° C. 2. Pre-riscaldato RPMI-1640. 3. C / L tubi a velocità variabile della pompa. 4. Singolo riscaldatore soluzione in linea. 5. Obiettivo immersione. 6. Termometro digitale. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: immagine Esempio 2P acquisita all'interno del midollo spinale ventrale ricostruzioni 3D del lato ventrale di un infetto, non danneggiate (A) e JHMV-infetti, demyelinated (B) del midollo spinale.da un mouse Thy1-EYFP seguito al trapianto con gli NPC eGFP-etichettati. Assoni fluorescenza marcata sono pseudocolored giallo e PNG sono pseudocolored verde. Risoluzione dell'immagine: 512 pixel; volume dell'immagine: (A) x = 239 micron, y = 259 micron, z = 65 micron costruiti utilizzando 26 z-stacks distanziate 2,5 micron a parte e (B) x = 497 micron, y = 389 micron, z = 127,5 micron costruiti usando 51 z-stacks distanziati 2,5 micron a parte.
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Discussion
In tempo reale 2P imaging tessuto intatto è necessario per indagare cinetica NPC e interazioni seguenti trapianto nel topo demyelinated midollo spinale. L'imaging intravitale 2P è comunemente usato per determinare le dinamiche cellulari sul lato dorsale del midollo spinale nei topi viventi, ed è stato utilizzato per studiare demielinizzazione dorsale in malattia demielinizzante 17-19. Tuttavia, poiché NPC trapiantate migrano alla materia bianca ventrale, che si trova troppo in profondità all'immagine in situ utilizzando la microscopia 2P, un preparato ex vivo è necessario. Questa metodologia è stata utilizzata nel nostro laboratorio per determinare la motilità e rimielinizzazione cinetica di NPC trapiantate nel midollo spinale danneggiato e non danneggiata 6. Ex vivo preparazioni abilitare la scansione del midollo spinale non solo longitudinalmente, ma anche trasversalmente dal lato ventrale 6,20 . Ciò consente l'analisi delle differenze di movimento cellulare (velocità e direzione) e interazioni a tsito ransplant, adiacente al sito di trapianto, e a varie distanze dal sito di trapianto 6. Considerando inizialmente ideato questa preparazione di immagine trapiantato eGFP-NPC sul lato ventrale del midollo spinale, che può essere utilizzato per qualsiasi immagine fluorescente o cella tinto a ventrale, dorsale, o fianchi laterali modificando l'orientamento del midollo spinale è montata. I vantaggi di questa preparazione sopra di imaging intravitale comprendono la possibilità di imaging lato ventrale e manca la necessità di anestesia e la chirurgia di sopravvivenza, che è ancora necessario con le nuove preparazioni intravitale utilizzando una configurazione 'finestra di vetro' che consentono di più sessioni di imaging senza ripetuti interventi chirurgici 19,21 . Va notato che una limitazione di questa procedura rispetto all'approccio 'finestra di vetro' in combinazione con l'imaging intravitale è l'incapacità di ottenere molteplici punti di tempo da un singolo mouse, poiché il midollo spinale viene rimosso e il mouse è eutanasia.
Immagini 2P è ideale per risolvere le dinamiche di singole cellule nei tessuti intatti 22,23. 2P eccitazione utilizza fotoni nel vicino infrarosso che permettono per lunghi periodi di imaging dei tessuti profondi con fototossicità minima. 2P eccitazione avviene sull'assorbimento simultanea di due fotoni da un fluoroforo. L'elevata concentrazione di fotoni necessari per 2P eccitazione si ottiene la compressione spazio-temporale dell'uscita laser 2P in un unico piano focale. Ciò limita eccitazione fluorescente al punto focale, riducendo ulteriormente fototossicità in regioni midollo spinale di fuori del piano focale. Fotoni nel vicino infrarosso hanno anche ridotto la dispersione, consentendo immagini fino a circa 300 micron dal lato ventrale del midollo spinale 16.
Come per ogni nuova tecnica, invece, 2P di imaging del midollo spinale espiantato ha dei limiti che devono essere tenuti in considerazione. Questo protocollo di imaging utilizza un dichro 520 nmspecchio ic che consente la separazione di eGFP e EYFP fluorescenza deviando emissione eGFP nel canale di fluorescenza di solito riservato a luce blu. Generazione di seconda armonica creato da collagene nel midollo spinale appare anche nel canale blu, ma è facilmente distinguibili dalle cellule eGFP marcate che sono significativamente più luminoso in questa preparazione, e hanno una parte della loro emissione identificabile nel canale verde-giallo come collagene non lo fa. Questa tecnica di miscelazione canale e separazione delle diverse porzioni di un spettri di emissione utilizzando dicroici specifici è spesso utile per l'identificazione visiva o automatica di fluorofori individuali con spettri di emissione vicino o quasi sovrapposizione. Fototossicità è un altro limite di questo protocollo di imaging 2P. Le cellule all'interno di un unico volume di imaging sono sensibili a fototossicità; quindi, sperimentatore deve essere pienamente consapevole dei segni di fototossicità. Fototossicità è tipicamente prima evidente nella riduzione o assenza di cellulemotilità, seguita da photobleaching e / o cambiamenti morfologici nei tessuti locali. Diversi fattori possono danneggiare il tessuto che porta alla fototossicità o renderlo inadatto per live-cell imaging. È fondamentale per monitorare la potenza del laser e la temperatura ed ossigenazione del perfuso RPMI-1640. È inoltre indispensabile per garantire la corretta rimozione del midollo spinale dal mouse senza eccessivo stiramento o compressione del midollo spinale e senza tagliare il midollo spinale con le lame. Se gestita correttamente, la preparazione del midollo spinale espiantato rimarrà valida fino a dieci ore, come stabilito dal robusto motilità cellulare all'interno del midollo spinale ventrale senza diminuzione in dieci ore post-estrattivi. Una varietà di tessuto estratto viene comunemente immaginata per lunghi periodi di tempo e considerata valida 23-26. Pertanto, la quantificazione delle dinamiche cellulari in più regioni all'interno di un singolo midollo spinale è possibile. Infine, va osservato che la stragrande maggioranza delle cellule that non sono fluorescente non verrà visualizzato da questa preparazione (salvo naturalmente autofluorescenti), ed è importante riconoscere che le cellule marcate interagiscono con un ambiente complesso di altri, apparentemente invisibili cellule endogene senza etichetta ed elementi strutturali.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane, USP | Piramal Critical Care, Inc | N/A | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | sharp |
| scalpel blade #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Luer rongeurs | Fine Science Tools | 16001-15 | |
| Graefe forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| Vannas scissors | Fine Science Tools | 15615-08 | |
| scalpel blade #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| RPMI-1640 | Gibco | 12-115F | |
| agarose, low gelling temperature | Sigma | A9414-25G | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| Vetbond (tissue adhesive) | 3M | 1469SB | |
| 22 mm square cover slip | Fisher Scientific | 12-547 | |
| 25X dipping objective, 1.1 NA | Nikon | CFI Apo LWD 25XW | |
| Single inline solution heater | Warner Instruments | 64-0102 | |
| 520 nm single-edge dichroic beam splitter | Semrock | FF520-Di02-25x36 | Brightline |
| 560 nm single-edge dichroic beam splitter | Semrock | FF560-FDi01-25x36 | Brightline |
| photomultiplier tubes | Hamamatsu | R928 | |
| C/L variable-speed tubing pump | Masterflex | 77122-22 | |
| digital thermometer | Comar Instruments | 3501 | |
| Chameleon Ultra Ti:Sapphire laser | Coherent | N/A | |
| Slidebook 6 software | 3i | N/A | |
| Imaris 7.7 software | Bitplane | N/A |
References
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