Summary
마우스 척수 이미징을위한 새로운 생체 준비. 이 프로토콜은 척수 걸쳐 라이브 세포 상호 작용의 두 광자 이미징을 허용한다.
Introduction
실험자가 면역 뇌척수염 (EAE) 및 neuroadapted 마우스 형 간염 바이러스 (MHV)과 두개 내 감염을 포함하여 탈수 초화의 마우스 모델은, 분자 경로 및 질병과 관련된 세포의 상호 작용을 연구하는 훌륭한 도구입니다. 그들은 주도하고 FDA의 효과는 주로자가 면역 및 염증 일의 중단을 대상으로, 제약 요법을 승인 지원했다. 내생 재유 수화가 실패하지만 일단, 현재 승인 된 치료는 효과적으로 중추 신경계의 탈수 초 병변을 복구하지 않습니다. 따라서, 질병의이 단계에서 복구에 초점을 맞춘 치료는 만성 증상과 삶의 질 향상 등의 개선을 위해 중요하다. 최근, 신경 전구 세포 (NPC들)은 염증과 탈수 초화의 영역을 대상으로 잠재적 인 재생 치료 양상으로 최전선에왔다. 몇몇 연구 endogeno을 유도하는 능력의 NPC를 강조우리는 재유 수화 및 재유 수화 2-8에 직접 참여한다. NPC의 재유 수화가 직접 관여되어 있기 때문에, 다음과 같은 내인성 세포 이식 그들의 동력학 및 상호 작용을 이해하는 것이 필수적이다. 이식 후, NPC가 다음 rostrally 및 이식 사이트 5,9에 꼬리 쪽 상대 백질 손상의 영역에 배쪽으로 이동한다. 이주의 반응 속도는 환경 단서에 대한 응답에 차이가; 비 손상된 척수에 이식 NPC가 손상된 척수 6에 이식 NPC들보다 더 큰 속도를 가지고있다. 철새 기간이 지나면 그대로 척수 6 손상된 척수 상대적으로 더 높은 비율로, NPC가 광범위하게 확산 옮겼다. 마지막으로, NPC의 대부분은 희소 돌기 아교 세포로 분화 및 직접 재유 수화의 4,6,9을 시작합니다.
탈수 초 병변은 복잡하고 여러 단계에서 세포의 다양한 인구를 포함 할 수 있습니다ctivation. 예를 들어, 활성화 된 다발성 경화증 (MS) 병변은 활성화 T 세포, M1의 미세 아교 세포 및 M1 식세포하지만 만성 자동 MS 병변은 주로 약간의 염증 세포 (10-13)와 반응성 성상 세포로 구성 될 수의 현저한 인구를 포함 할 수있다. 때문에 이펙터 세포의 다양성, 탈수 초화의 마우스 모델에서 이광자 (2P)는 촬상 병변 내의 로컬 셀룰러 상호 작용의 이해를 돕기 위해 매우 유용한 도구이다. MS 많은 널리 사용 MS 연구 모델에서, 병변의 대부분 의한 병변의 깊이와 척수 높은 지질 함량 척수, 생체 내에의 2P 촬상 접근 할 수없는 영역의 복부 측에 위치한다. 복부 척수를 따라 병변 내에서 이러한 문제와 연구 세포 - 세포 상호 작용을 회피하기 위해 우리는 생체 2P 이미징 준비 6 간단한을 개발했다.
이 연구는 보여 이전의 방법 간행물, 최대 다음MHV 유도 (14)의 탈수 초화 JHMV 균주 다음 마우스의 척수에 증강 된 녹색 형광성 단백질 (EGFP) 발현의 NPC 이식 절차. 5 주 된 쥐 JHMV에 감염 14 일 후 감염에 흉부 레벨 9에 eGFP는-NPC가 이식된다. 여기에 제시된 프로토콜은 생체 아가로 오스 준비를하기 위해선, 척수를 추출, 향상된 노란색 형광 단백질 (EYFP) 발현 축삭과 이미지 이식 eGFP는-NPC 상호 작용하는 방법에 대한 자세한 단계를 제공합니다. 뉴런 특이 Thy1 EYFP 프로모터하에 발현 된 마우스는이 절차 (15)에 사용 하였다. 만 축삭의 일부는 개별 축삭을 이미징 유용하게 EYFP을 표현한다. 여기에서 우리는 칠일 이식 후에서 제거 척수를 보여; 그러나, 척수는 식후 어느 시점에서 추출 될 수있다. 우리가 손상된 축색의 NPC와 상호 작용을 표시하는 동안, 우리는 프로토콜 형광 마커 유전자와 조합하여 사용할 수있다다른 세포 유형 마우스 척수 걸쳐 일어나는 세포 상호 작용의 다수를 알아보고자 하였다.
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Protocol
참고 : 윤리 문 : 동물 처리를위한 프로토콜은 캘리포니아, 얼바인, 프로토콜 # 2010년부터 2943년까지 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다.
척수 1. 제거
- 챔버를 안락사에 ~ 100 % 액체 이소 플루 란, USP 적신 종이 타월을 놓고 위에 마른 종이 타월을 배치합니다. 마우스가 이소 플루 란 접촉되지 않도록 마른 종이 타월 위에 챔버에 마우스를 놓고 챔버가 포함되어 있는지 확인합니다. 마우스가 안락사 될 수 있도록 호흡 중단 후, 1 분 정도 기다립니다.
- 마우스를 안락사 보장하기 위해 목의 척추 절개를 수행합니다. 이 척수에 손상을 줄 수 있습니다 자궁 경부 전위를 수행하지 마십시오.
- 젖은 모발, 70 % 에탄올로 마우스 스프레이.
- (약 자궁 얇은 판 1에서 척추를 노출 C1를 마우스의 뒷면에서 머리와 피부를 제거하는 날카로운 미세 가위를 사용하여) 성례의 얇은 판 4 (S4)에.
- # 10 메스 블레이드를 사용하여, 근육과 지방에서 분리하는 척주의 왼쪽과 오른쪽을 절개. 이 척수의 제거가 훨씬 쉽게 만들 것입니다.
- 옵션 : 곡선 루어 rongeurs 추가 살을 멀리 퍼하는 데 사용할 수 있습니다.
- 톱니 모양의 Graefe 씨 집게와 척수 척추의 상단을 누른 상태에서 척수를 만지지 않도록 조심하면서, 최대 C1에 노출 된 척추에 곡선면 티타늄 곡선 Vannas 가위를 삽입합니다.
- 모든 길 오른쪽에있는 티타늄 곡선 Vannas 가위를 밀어 하나의 작은 상처를합니다. 작은 크런치 소리가 들리지와 가위가 척추를 잘라으로 생각해야한다. 코드의 맨 왼쪽에이 컷을 반복합니다. 너무 빨리 이동하거나이 가위 코드의 손상 위험하므로 절단 너무 큰 확인하지 않도록주의하십시오.
- 하나의 얇은 판은 척추의 측면이 절단되면 집게로 해제 할 수 있어야합니다. R보유 척수 척추를 뒤로 당겨 계속 S4까지 각각의 얇은 판에 대해이 단계를 EPEAT.
참고 :이 이식 사이트로 삭감되면 이식 사이트 위의 척추 가능성이 붙지 않습니다. 바로 이식 사이트 아래에 시작하는 절차를 진행합니다. - 옵션 : 이식 사이트이며, 측정 및 ~ 이식 사이트에 20mm 주동이의 꼬리 잘라 곳을보고 아래 척추를하다.
참고 : 더 일반적으로 15mm보다 더 멀리 이동하지 않는 이식의 NPC로 필요하지 않습니다 NPC의 이식. 척수의 필요한 양은 이식 세포 유형의 실험 및 이동 특성에 의존 할 것이다. 이식 사이트에 등거리 주동이의 꼬리 컷을 만들기 이미징 동안 더 쉽게 위치 할 수있는 이식 사이트를 가능하게 할 것이다. - # 11 블레이드와 메스를 사용하여 조심스럽게 오른쪽에있는 신경을 절감하고 주동이의 끝에서 시작하여 척수의 복부 측면의 왼쪽. 이 w병이보다 용이하게 복부 척추로부터 제거 될 수 있도록 척수.
참고 : 빨리 완료는 (1.7-1.11 단계), 척수가 건조하지 않습니다. 그러나, 1X PBS 촉촉한 유지하는 코드로 투여 될 수있다. - 마우스 전환 등 척수가 아래로 향 마우스를 저장할 수 있습니다. 조심스럽게 폐쇄 톱니 모양의 Graefe 씨의 집게를 사용하여 척수를 껍질. 척수 새김없이 신중 척수 손상 단일 편에서 해제 될 수 있도록 나머지 신경절을 잘랐다.
- 척수는 RPMI-1640에 있는지 확인하고 2P 현미경에 전송 얼음에 놓습니다.
이미징 척수 2. 준비
- 아가로 오스 척수를 포함하기
- 촬영하기 전에 얼음에 냉장 RPMI-1640에 고립 된 척수를 유지합니다.
- 아가 로스 (저 겔화 온도)을 칭량하고 1X PBS 5 ml의 5 % 용액을 제조 하였다. AG를 용해 15 초 동안 5 % 아가로 오스 용액을 마이크로파일어나 37 ° C로 냉각 솔루션을 보자.
- 복부면이 위를 향하도록 파라 필름 한 장에 배치하여 척수를 준비합니다.
- 피펫 척수의 복부 측면에 걸쳐 5 % 아가로 오스 솔루션의 약 5 ml의. 아가 로스를 실온으로 냉각시켜 고화하자. 전체 응고 약 5 분 소요됩니다.
- 22mm 사각형 커버 슬립에 조직 접착제의 가벼운 코트를 적용합니다.
- 파라 필름에 복부 측면을 배치, 임베디드 척수 전환. 몸 윗면은 지금 직면한다. 등쪽에 커버 슬립을 준수하고, 접착제를 응고 RMPI의 아가로 오스 포함 된 척수 / 커버 슬립 준비 잠수함. 과잉 면도날을 사용하여 아가로 오스를 응고 제거합니다.
- 현미경 무대에서 척수를 장착
- 커버 슬립의 바닥에 바셀린을 적용합니다. 이것은 재관류 동안 제제를 안정화한다.
- 척수 제제를 놓고25X 찍기 목표를 향해 위로 향하도록 복부 측면과 현미경 무대에 잘 이미징. 맞춤형 이미징 아니라 약 20mm, 깊이 50mm 길고, 곳곳에서 50mm입니다.
- 이미지 산소 예열과 준비 (37 ° C), superfusing 동안 혈청이없는 (95 : 이산화탄소 carbogen : 5 산소) RPMI-1640 배지를.
- 전 따뜻한 물을 욕조에 37 ° C에 미디어 그것은 미디어 병에 튜브를 삽입하여 튜브 펌프에 연결합니다.
- 챔버에 튜브의 연결에서 37 ° C 히터 장치에서 미디어 온도를 유지합니다. Superfuse 미디어 우물가를 통해 3 ㎖ / 튜브 펌프 (그림 1B)에 연결된 튜브를 사용하여 분.
복부 척수 3. 2P 이미징
- 현미경 설정
- 900 nm의 조정 사파이어 레이저 : 카멜레온 울트라 티를 사용하여 Thy1-EYFP 척수의 이미지를 획득. 에서의 레이저 파워를 감쇄<5 % 표본은 최소 광독성 (16)을 보장합니다. 촬상 안정을 보장하기 위해 드리프트 및 조직 및 세포 손상을 방지하기 위해 단일 인라인 히터 용액을 이용하여 일정한 37 ℃에서 산소 - 관류 RPMI-1640을 환류시켜두면 온도를 유지한다.
- eGFP는 및 EYFP 형광 신호를 분리하기 위해, 의도적으로 시인성을 향상시키기 위해 녹색 발광을 분할, 세 개의 채널로 2P 발광을 분리하는 일련의 520 nm의 단일 에지 이색 및 560 nm의 단일 에지 이색 성 빔 스플리터를 배치했다.
참고 :이 채널은 파란색 - 녹색 (발광 <520 ㎚), (520-560 nm의) 녹색 - 노란색과 빨간색 (발광> 560 ㎚)라고합니다. 광전자 배증 관은 각 채널의 광을 방출 감지합니다.
- 관심의 위치 이미징 영역
- 접안 렌즈와 시야 광원을 이용하여, 기준점을 설정하는 척수의 복부 가장자리에 침지 대물 초점.
- 반드시 주변 광원을 끄고 자상 있는지 확인레이저 셔터를 열어 2P 여기에 가려움.
- 가능하면 관심 분야에 대한 조직을 검색 할 때, 최종 이미지를 획득 할 때보다 낮은 해상도 설정, 디지털 줌없이 높은 볼륨, 높은 스캔 속도를 사용합니다. 관심 영역에 대한 조직 검색이 시스템의 전형적인 설정은 다음과 같습니다 해상도 : 256 픽셀; 볼륨 : X = Y 600 μm의 = 600 μm의, Z = 0-300 μm의.
- 척수의 배쪽 가장자리 근처 EYFP 축삭을 준수하십시오. 콜라겐 (파란색)에서 두 번째 고조파 신호는 척수 조직의 가장자리에 밝은 될 것입니다. EYFP 축삭 그냥 콜라겐에서 2 차 고조파 신호에 지느러미 찾아 EYFP 신호는 녹색 - 노란색 채널에 보여집니다.
- 척수 준비 (14)의 길이 방향의 중앙에 이식 사이트를 찾습니다. eGFP는-NPC 이식 다음 마우스 일일를 들어, 깊은 조직으로 z 평면에서 빔 경로를 중심으로 이식 사이트를 찾습니다. 이식 사이트 위스콘신LL 동물 사이에 다소 차이가 있지만, 일반적으로 복부 가장자리에서 ~ 200 μm의 거리에 있습니다. 1 일 후 이식 후 쥐의 복부 및 측면 가장자리에 가까운, 백색질에 eGFP는-의 NPC의 클러스터를 관찰합니다.
- 최종 이미지를 획득
- 512 픽셀의 이미지 해상도를 취득; 볼륨 : X = 270 Y μm의 = 212 μm의, 및 z = 100 μm의 사용 Slidebook 6 소프트웨어. 2.5 μm의 단위로 순차적 초점면을 인수하여 Z-스택을 컴파일합니다.
- 척수에있는 모든 마이그레이션 객체의 신속한 정량을 보장하기 위해 오프셋 적절한 인터레이스와 양방향 검사를 수행합니다. 척수는 약 1 프레임 / 초입니다 내에서 이상적인 획득 프레임 속도가 휴대 전화 속도를 결정하는 것을 확인합니다.
주 : 이미징 설정은 포착 프레임 율, 해상도 및 촬상 촬상 볼륨으로 개별 사용자 선호도로 변경 될 수있다. 큰 이미지 볼륨은 일반적으로 GIV에서 획득을 더 오래 걸립니다욕실 해상도. - 이러한 비트 평면 Imaris 7.7 같은 영상 분석 소프트웨어를 자르기, 매끄러운 및 의사 색조 Slidebook 이미지 파일을 분석. Slidebook와 Imaris의 자동화 된 프로세스를 사용하여 연속적인 영상 볼륨을 빗질하여 최종 시간 경과 비디오를 생성합니다.
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Representative Results
외식 척수 촬상 프로토콜 척수 내의 형광을 시각화하는데 이용 될 수 있지만, 우리는 대표적인 결과 EYFP-축삭-eGFP는 NPC와 상호 작용을 보여준다. 첫째, 우리는 그림 1A에 포함 된 복부 척수 준비를 보여줍니다. 다음으로, 우리는 그림 1B에서 2P 현미경 설정 및 주요 구성 요소를 보여줍니다. (2) 복부 척수 내에서 단일 Z-스택에 eGFP는 및 EYFP 형광을 보여줍니다. 연속 Z - 스택의 취득은 그대로 조직 내에서 실시간으로 세포 역학을 분석하는 시간 경과 비디오를 생성하기 위해 컴파일 할 수 있습니다. 520 nm의 단일 에지 이색 및 560 nm의 단일 에지 이색 성 빔 스플리터를 사용하여 프로토콜에 명시된 바와 같이, 및 eGFP는 EYFP 신호를 분리 할 수있다. 개별 채널은 녹색과 노란색 사용 이미징 소프트웨어를 모조 할 수 있습니다.
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그림 1 : 척수 및 현미경 설정. (A) (왼쪽) 5 % 아가 로스 젤에 포함 된 척수 및 초과 아가로 오스 (오른쪽)의 제거 다음 커버 슬립에 장착. (B)라고 표시된 주요 구성 요소와 현미경 설정의 이미지입니다. 1. 물 목욕은 37 ° C로 설정. 2. RPMI-1640을 미리 예열. 3. C / L 가변속 튜브 펌프. 4. 단일 인라인 솔루션 히터. 5. 디핑 목적. 6. 디지털 온도계. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2 : 실시 예 2P 이미지 복부 척수 내부 취득한 비감염, 비 손상 (A)의 복부 측면과 JHMV 감염, 탈수 초 (B)의 척수를 3D 재구성.eGFP는 표지의 NPC와 Thy1-EYFP 마우스 다음 이식에서. 형광 표지 된 축삭은 노란색 모조하고 NPC의 녹색 모조있다. 이미지 해상도 : 512 픽셀; 이미지 볼륨 : (A) X = 239 μm의 y는 259 μm의은, 65 μm의 26 Z-스택을 사용하여 구성 = z를 사용하여 2.5 떨어져 μm의 X = 497 μm의, Y = 389 μm의, Z = 127.5 μm의가 구성 (B)를 간격 = 51 Z-스택은 2.5 μm의 이격.
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Discussion
실시간은 그대로 조직의 2P 영상은 탈수 초 마우스 척수에 이식 다음 NPC의 반응 속도 및 상호 작용을 조사하기 위해 필요합니다. 생체 내에 2P 촬상 일반적 살아있는 쥐 척수의 등쪽에 휴대 동성을 결정하는 데 사용되며, 탈수 초성 질환 17-19에서 척수 탈수 초를 연구하기 위해 사용되었다. 이식의 NPC가 2P 현미경을 사용하여 현장에서 이미지에 너무 깊이 자리 잡고 복부 백질로 이동하기 때문에, 생체 준비가 필요하다. 이 방법론은 손상 및 비 손상 척수 6 이식의 NPC의 운동성 및 재유 수화 반응 속도를 결정하기 위해 우리의 실험실에서 사용되어왔다. 생체 내 준비뿐만 아니라 세로 방향으로 척수의 검색을 사용뿐만 아니라 가로 방향으로 복부 측면 6,20에서 . 이 t에서 세포 이동의 차이 (속도와 방향)과의 상호 작용 분석을 위해 수 있습니다이식 사이트에 인접하고, 이식 사이트 (6)에서 다양한 거리에서 ransplant 사이트. 우리가 처음 척수의 복부 측에 eGFP는-NPC가 이식 된 화상이 조제품을 고안하는 반면, 그것은 이미지에 사용될 수있는 형광 표지 또는 복부 등쪽에서 염색 된 세포 또는 측면 척수가 방향을 바꿔서 장착. 생체 내에 영상을 통해이 준비의 장점 복부 측면 영상을 허용하고 여전히 반복 수술 (19, 21)를하지 않고 여러 이미지 세션을 허용 '유리 창'설정을 사용하여 새로운 생체 내에 준비에 필요한 마취과 생존 수술의 필요성을, 부족한 포함 . 이것은 척수가 제거되기 때문에 생체 내에 촬상과 함께 '유리 창'접근법에 비해이 절차의 하나의 제한은, 하나의 마우스에서 다수의 시간 점수를 획득 할 수 없다는 것을 주목해야한다 마우스가 안락사.
2P 영상은 이상적 그대로 조직 (22, 23) 내에서 단일 세포의 역학을 해결하기에 적합합니다. 2P 여기 최소한의 광독성 깊은 조직 이미징의 연장 된 기간 동안 수 근적외선 광자를 사용합니다. 여기 2P는 형광 물질에 의해 두 개의 광자의 동시 흡수에 발생한다. 2P 여기에 필요한 광자의 고농도 단일 초점면에 2P 레이저 출력의 시공간적 압축에 의해 달성된다. 이것은 상기 초점 평면의 외부 척수 영역에서 광독성을 최소화 초점 형광 여기에 제한한다. 근적외선 광자는 약 300 μm의 척수 (16)의 복부 측면에서까지 촬영이 가능 산란을 감소시켰다.
새로운 기술과 같이, 그러나, 이식 된 척수 2P 이미징 명심해야 한계가있다. 이 촬상 프로토콜은 520 nm의 dichro를 이용한다일반적으로 푸른 빛에 예약 된 형광 채널로 eGFP는 방출을 전환하여 eGFP는 및 EYFP 형광의 분리를 가능하게 IC 거울. 척수에 콜라겐에 의해 만들어진 두 번째 고조파 세대는 파랑 채널에 표시되지만 녹색 - 노란색 채널로의 식별이 준비 상당히 밝게, 그들의 방출의 일부가 eGFP는 표지 세포에서 쉽게 구별된다 콜라겐하지 않습니다. 채널 혼합 및 특정 dichroics를 사용하여 발광 스펙트럼의 다른 부분의 분리의이 기술은 종종 가까운 또는 거의 중복 발광 스펙트럼 개별 형광의 시각적 또는 자동 식별하는 데 유용합니다. 광독성이 2P 촬상 프로토콜의 또 다른 한계이다. 하나의 이미지 볼륨 내에서 세포 광독성에 민감하다; 따라서, 실험자은 광독성의 흔적을 예리하게 알고 있어야합니다. 광독성는 전형적으로 감소 또는 세포의 부족 제 명백운동성은 지방 조직 및 / 또는 형태 적 변화를 photobleaching에 하였다. 여러 가지 요인은 조직 광독성에 선행 또는 라이브 세포 이미징에 적합하지 그것을 렌더링을 손상시킬 수 있습니다. 이것은 관류 RPMI-1640 레이저 파워 온도 및 산소를 모니터링하는 것이 중요하다. 이는 과도한 연신 또는 척수 압축없이 블레이드 척수를 절단하지 않고 마우스 척수에서의 적절한 제거를 보장하는 것이 필수적이다. 제대로 처리하는 경우 십시간 후 추출 없음 감소와 복부 척수 내에서 강력한 세포 운동성에 의해 결정, 외식 척수 준비, 최대 10 시간 동안 생존 유지됩니다. 추출 된 조직의 다양한 일반적으로 시간의 긴 길이에 대한 이미징 및 23 ~ 26 가능한 것으로 간주됩니다. 따라서, 하나의 척수 내에서 여러 지역에서 세포 역학의 정량이 가능합니다. 마지막으로, 유의할 점 파치 셀의 대다수t는 형광 (자연 autofluorescent 제외)이 준비가 가시화되지 않습니다 표시되지 않으며, 그것은 그 표지 세포가 다른 레이블이없는, 겉으로는 보이지 않는 내인성 세포와 구조 요소의 복잡한 환경과 상호 작용을 인정하는 것이 중요하다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane, USP | Piramal Critical Care, Inc | N/A | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | sharp |
| scalpel blade #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Luer rongeurs | Fine Science Tools | 16001-15 | |
| Graefe forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| Vannas scissors | Fine Science Tools | 15615-08 | |
| scalpel blade #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| RPMI-1640 | Gibco | 12-115F | |
| agarose, low gelling temperature | Sigma | A9414-25G | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| Vetbond (tissue adhesive) | 3M | 1469SB | |
| 22 mm square cover slip | Fisher Scientific | 12-547 | |
| 25X dipping objective, 1.1 NA | Nikon | CFI Apo LWD 25XW | |
| Single inline solution heater | Warner Instruments | 64-0102 | |
| 520 nm single-edge dichroic beam splitter | Semrock | FF520-Di02-25x36 | Brightline |
| 560 nm single-edge dichroic beam splitter | Semrock | FF560-FDi01-25x36 | Brightline |
| photomultiplier tubes | Hamamatsu | R928 | |
| C/L variable-speed tubing pump | Masterflex | 77122-22 | |
| digital thermometer | Comar Instruments | 3501 | |
| Chameleon Ultra Ti:Sapphire laser | Coherent | N/A | |
| Slidebook 6 software | 3i | N/A | |
| Imaris 7.7 software | Bitplane | N/A |
References
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