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Neuroscience

Dois fótons de imagem da Cellular Dynamics na Medula Espinhal Rato

doi: 10.3791/52580 Published: February 22, 2015

Summary

Uma nova ex vivo preparação para a imagem latente o mouse medula espinhal. Este protocolo permite a dois fotões imagiologia de interacções celulares vivos ao longo da medula espinal.

Introduction

Modelos de ratos de desmielinização, incluindo a encefalomielite autoimune experimental (EAE) e infecção intracraniana com neuroadapted vírus da hepatite do camundongo (MHV), são excelentes ferramentas para estudar vias moleculares e interações celulares associados à doença. Eles têm conduzido a e suportado a eficácia de terapias farmacêuticas aprovado pela FDA, principalmente contra a cessação de autoimunidade e inflamação 1. No entanto, uma vez que a remielinização endógeno falhou, as terapias actualmente aprovadas não eficaz para reparar lesões de desmielinização do sistema nervoso central. Portanto, terapias focadas no reparo nesta fase da doença são fundamentais para o alívio de sintomas crônicos e melhoria da qualidade de vida. Recentemente, as células precursoras neurais (NPCs) vieram à tona como um potencial modalidade terapêutica regenerativa para atingir áreas de inflamação e desmielinização. Vários estudos têm destacado a capacidade de NPCs para induzir endógenonos remielinização e participar diretamente remielinização 2-8. Porque NPCs estão envolvidos em remielinização direta, é imperativo compreender a sua cinética e interações com células endógenas após o transplante. Após o transplante, NPCs migrar ventralmente para áreas de lesões da substância branca, em seguida, rostral caudal e relativas ao local de transplante 5,9. A cinética da migração diferem em resposta aos estímulos ambientais; NPCs transplantadas em uma medula espinhal não danificado têm velocidades maiores que as NPCs transplantadas em uma medula espinhal danificada 6. Depois de um período migratório, transferido NPCs proliferam extensivamente, a uma taxa mais elevada num medular danificado em relação a uma medula espinhal intacta 6. Finalmente, a maioria dos NPCs diferenciar em oligodendrócitos e iniciar 4,6,9 remielinização directa.

A lesão desmielinização é complexo e pode incluir uma população diversa de células em vários estágios de umctivation. Por exemplo, uma lesão activa esclerose múltipla (EM) podem incluir uma população significativa de células T activadas, a microglia e macrófagos M1 M1, mas uma lesão crónica MS silenciosa pode ser constituída essencialmente por astrócitos reactivos com poucas células inflamatórias 10-13. Devido à diversidade de células efectoras, de dois fotões (2P) de imagem em modelos de rato de desmielinização é uma ferramenta extremamente útil para ajudar a compreender as interacções celulares locais no interior da lesão. Em muitos modelos de MS e MS de investigação amplamente utilizadas, a maioria das lesões está localizada no lado ventral da medula espinhal, uma região inacessível para imagens intravital 2P devido à profundidade da lesão e o elevado teor de lípidos da medula espinhal. Para contornar esses problemas e as interações célula-célula estudo dentro de lesões ao longo da medula espinhal ventral, temos desenvolvido um simples ex vivo 2P preparação imaging 6.

Este estudo segue-se uma publicação métodos anterior, que mostrouo procedimento para o transplante reforçada proteína verde fluorescente (eGFP) NPCs -expressing para a medula espinhal de ratos após JHMV estirpe de desmielinização induzida por MHV 14. Cinco semanas ratos velhos são infectadas com JHMV e transplantados com eGFP-NPCs ao nível torácico 9 no dia 14 pós-infecção. O protocolo apresentado aqui fornece etapas detalhadas sobre como extrair a medula espinhal, fazer uma preparação ex vivo agarose, e imagem transplantado interações eGFP-NPC com melhor proteína fluorescente amarela (EYFP) axônios -expressing. Ratos que expressam EYFP sob a Thy1 promotor específico neuronal foram usados ​​neste procedimento de 15. Apenas alguns dos axônios expressar EYFP, tornando-o útil para a imagem latente axônios individuais. Aqui nós mostramos medulas espinhais removidas em 7 dias pós-transplante; no entanto, a espinal medula pode ser extraída em qualquer momento após o transplante. Enquanto que mostram as interacções de NPCs com axónios danificados, o nosso protocolo pode ser utilizado em combinação com marcadores fluorescentes genéticosde outros tipos de células para investigar uma variedade de interacções celulares que ocorrem durante todo o rato medula espinhal.

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Protocol

Declaração de Ética: NOTA: O protocolo para manejo dos animais foi aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso do animal Institucional (IACUC) da Universidade da Califórnia, em Irvine, protocolo nº 2010-2943.

1. A remoção da Medula Espinhal

  1. Coloque folhas de papel umedecido com ~ 100% de isoflurano líquido, USP em câmara de eutanásia e coloque toalhas de papel seco em cima. Coloque o mouse na câmara em cima de toalhas de papel secas tão mouse não está tocando o isoflurano e certifique-se da câmara é coberto. Espere pelo menos um minuto após a cessação da respiração para garantir que o rato é sacrificado.
  2. Realize uma transection espinhal do pescoço para garantir o rato é sacrificado. Não realize uma luxação cervical, pois pode danificar a medula espinhal.
  3. Pulverizar o rato com etanol a 70% para molhar o cabelo.
  4. Use tesouras finas afiadas para remover o cabelo e pele do dorso do rato para expor a coluna vertebral cervical lâmina de aproximadamente 1 (C1) Para lamina sacral 4 (S4).
  5. Usando um bisturi com lâmina # 10, fazer incisões para a esquerda e direita da coluna vertebral, para separá-lo de músculo e gordura. Isso fará com que a remoção da medula espinhal muito mais fácil.
  6. opcional: a curvas rongeurs Luer pode ser usado para colher longe carne adicional.
  7. Enquanto mantém o topo da coluna vertebral com uma pinça Graefe serrilhadas, insira titânio curvadas tesoura Vannas com o lado curvo-se na coluna vertebral exposta na C1, tomando cuidado para não tocar na medula espinhal.
  8. Deslize o titânio curvadas tesoura Vannas todo o caminho para a direita e fazer um pequeno corte. Um pequeno som crise deve ser ouvida e sentida como a tesoura cortar o vértebras. Repita este corte no lado esquerdo do cordão. Tenha cuidado para não ir demasiado depressa ou tornar muito grande de um corte como este corre o risco de danificar o cabo com a tesoura.
  9. A única lâmina deve ser capaz de ser levantado com a pinça uma vez que os lados das vértebras são cortadas. REPEAT esta etapa para cada lâmina até S4, continuando a segurar e puxar para trás as vértebras da medula espinhal.
    NOTA: as vértebras acima do local de transplante provavelmente vai sair uma vez que é cortada para o site de transplante. Continuar o processo de arranque logo abaixo do local de transplante.
  10. opcional: lançar as vértebras para baixo para ver onde o site e transplante é medida e cortar ~ 20 milímetros rostral e caudal para o site de transplante.
    NOTA: Quando o transplante NPCs mais não serão necessários, como os NPCs transplantados geralmente não migram mais longe do que 15 mm. A quantidade de medula espinhal necessária será dependente das características da experiência de migração e de tipo de célula transplantada. Fazendo cortes rostral e caudal, os quais são equidistantes ao local de transplante permitirá que o local de transplante a ser localizado mais facilmente durante o exame.
  11. Usando um bisturi com uma lâmina de # 11 de corte cuidadosamente o gânglio à direita e à esquerda da face ventral da medula espinal começando na extremidade rostral. Este wdoente permitir a medula espinal a ser removido a partir das vértebras ventral mais facilmente.
    NOTA: Feito rapidamente (passos 1,7-1,11), a medula espinhal não vai secar. No entanto, 1x PBS pode ser administrado para o cabo para mantê-lo húmido.
  12. Inverta o mouse e segure o mouse para que a medula espinhal é voltado para baixo. Retire cuidadosamente para fora da medula espinhal usando uma pinça Graefe serrilhadas fechadas. Sem entalhamento da medula espinal, gânglios corte cuidadosamente quaisquer restantes para permitir a medula espinal a ser levantado para fora de uma peça única intacta.
  13. Certifique-se a medula espinhal está em RPMI-1640 e colocá-lo em gelo durante o transporte para o microscópio 2P.

2. Preparação de Medula Espinhal for Imaging

  1. Incorporação da medula espinhal em agarose
    1. Manter o isolado da medula espinal em arrefecida RPMI-1640 em gelo antes da imagiologia.
    2. Pesar de agarose (baixa temperatura de gelificação) e preparar uma solução de 5% em 5 ml de PBS 1x. Microondas A solução de agarose a 5% durante 15 segundos para dissolver o aglevantou-se e deixar a solução legal para 37 ° C.
    3. Preparar a medula espinal, colocando-o sobre uma folha de Parafilm com o lado ventral para cima.
    4. Pipetar cerca de 5 ml de solução de agarose a 5% sobre o lado ventral da medula espinal. Deixe a agarose solidificar por arrefecimento até à temperatura ambiente. Solidificação completa demora cerca de 5 min.
    5. Aplique uma leve camada de cola de tecido para um quadrado deslizamento de cobertura 22 mm.
    6. Inverta a medula espinhal incorporado, colocando o lado ventral em Parafilm. O lado dorsal será agora voltado para cima. Aderem a lamínula no lado dorsal, e mergulhe a preparação deslizamento agarose incorporado medula espinhal / tampa em RMPI para solidificar o adesivo. Retire o excesso de solidificou agarose usando uma lâmina de barbear.
  2. Montagem da medula espinal na platina do microscópio
    1. Aplique vaselina para a parte inferior da tampa de deslizamento. Isto irá estabilizar a preparação durante a perfusão.
    2. Coloque a preparação da medula espinhal em umimagiologia bem na platina do microscópio, com o lado ventral para cima para alcançar o objectivo de imersão 25X. O poço de imagem custom-built é de aproximadamente 20 mm de profundidade, a 50 mm de comprimento, e 50 mm de diâmetro.
    3. Imagem enquanto superfusing a preparação com aquecido (37 ° C), oxigénio (95: 5 de oxigénio: carbono em dióxido de carbogénio) meio RPMI-1640 sem soro.
      1. Mídia Pré-aquecer a 37 ° C em banho-maria e conectá-lo à bomba tubulação por inserir o tubo dentro da garrafa de mídia.
      2. Manter a temperatura do meio a 37 ° C, um dispositivo de aquecimento no ponto de ligação da tubagem para a câmara. Meios Superfuse através bem a 3 ml / min, utilizando tubagem ligada ao tubo da bomba (Figura 1B).

3. 2P por imagem da Medula Espinhal Ventral

  1. Setup Microscópio
    1. Adquirir imagens de Thy1-EYFP medulas espinhais usando um Chameleon Ultra laser de Ti: Safira sintonizado 900 nm. Atenuar potência do laser noespécime para <5% para assegurar o mínimo de 16 de fototoxicidade. Manter a temperatura irrigando perfundido com oxigénio meio RPMI-1640 a uma temperatura constante de 37 ° C utilizando um aquecedor de solução única linha de imagem para garantir estável, e para impedir a dispersão do tecido e danos celulares.
    2. Para separar o sinal fluorescente eGFP e EYFP, coloque um 520 nm dicróica de ponta única e um nm-edge único feixe dicróica divisor 560 em série para separar 2P de emissão em três canais, propositadamente dividir a emissão verde para melhorar a visibilidade.
      NOTA: Estes canais são referidos como azul-verde (emissão <520 nm), verde-amarelo (520-560 nm) e vermelho (emissão> 560 nm). Tubos fotomultiplicadores detectar a luz emitida em cada canal.
  2. Localizando áreas de imagem de interesse
    1. Usando a ocular e uma fonte de luz de campo claro, concentrar o objectivo de imersão no bordo ventral da medula espinal para definir um ponto de referência.
    2. Faça fonte de luz ambiente certeza está fora e swcoceira para 2P excitação abrindo o obturador laser.
    3. Se estiver disponível, na busca de tecido para áreas de interesse, use uma configuração de resolução mais baixa, maior volume sem zoom digital, e maior velocidade de varredura do que na aquisição de imagens finais. As configurações típicas com este sistema na busca de tecido para uma região de interesse são: Resolução: 256 pixels; volume de: x = 600 um, y = 600 um, z = 0-300 um.
    4. Observar os axónios EYFP perto da borda ventral da medula espinal. Segundo sinal harmónico de colágeno (azul) será mais brilhante na borda do tecido da medula espinhal. Localize os axônios EYFP apenas dorsal para o segundo sinal harmônico do colágeno e sinal EYFP é visualizado no canal verde-amarelo.
    5. Localizar o local de transplante no centro longitudinal da preparação da medula espinal 14. Para camundongos um dia após o transplante eGFP-NPC, localize o site de transplante, concentrando-se a caminho do feixe no plano z profundamente no tecido. O wi site de transplantell variam ligeiramente entre os animais, mas geralmente está localizado ~ 200 mm a partir da borda ventral. Observe os aglomerados de eGFP-NPCs nos tratos de substância branca, mais perto das bordas lateral e ventral em ratos após dia 1 pós-transplante.
  3. Obtenção de imagens finais
    1. Adquirir resolução de imagem de 512 pixels; volume de: x = 270 mm, y = 212 mm, e z = 100 um usando software Slidebook 6. Compilar z-stacks através da aquisição de planos focais sequenciais em incrementos de 2,5 mM.
    2. Executar uma verificação bidirecional com deslocamento para garantir quantificação rápida de quaisquer objetos que migram da medula espinhal interlace adequada. Certifique-se de que a taxa ideal quadro aquisição para determinar a velocidade do celular dentro da medula espinhal é de aproximadamente 1 frame / sec.
      NOTA: As configurações de imagem pode ser alterado para as preferências do usuário individuais, tais como taxa de quadros de aquisição, resolução de imagem e volumes de imagem. Volumes de imagem maiores geralmente levam mais tempo para adquirir a um GIVresolução en.
    3. Analisar, de culturas, liso, e pseudocoloridas arquivos de imagem Slidebook com software de análise de imagem, tais como Bitplane Imaris 7.7. Produza vídeos finais de lapso de tempo penteando volumes de imagens consecutivas usando um processo automatizado em Slidebook e Imaris.

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Representative Results

Embora o protocolo explantado imagiologia medula espinal pode ser utilizado para visualizar qualquer fluorescência na medula espinhal, os nossos resultados demonstram representativos interacções eGFP-NPC com EYFP-axónios. Em primeiro lugar, vamos mostrar a preparação cabo embutido ventral espinhal na Figura 1A. A seguir, mostram a configuração de 2P microscópio e componentes principais na Figura 1B. A Figura 2 demonstra eGFP e EYFP fluorescência em um único z-pilha no interior da medula espinal ventral. Aquisição de z-stacks consecutivos pode ser compilado para produzir vídeos de lapso de tempo para analisar a dinâmica celular em tempo real dentro do tecido intacto. Usando um 520 nm dicróica de ponta única e um 560 nm-edge único feixe dicróica splitter, como observado no protocolo, pode separar sinal eGFP e EYFP. Os canais individuais podem ser pseudocolored software verde e amarelo de imagem usando.

80 / 52580fig1.jpg "/>
Figura 1: medula espinhal e configuração microscópio. (A) A espinal medula colocada num gel de agarose a 5% (esquerda) e montada sobre uma lamela a seguir à remoção do excesso de agarose (direita). (B) Uma imagem de microscópio com a configuração de componentes fundamentais etiquetadas. 1. banho-maria regulado a 37 ° C. 2. Pré-aqueceu-se meio RPMI-1640. 3. C / L Bomba de tubulação de velocidade variável. 4. aquecedor solução embutida solteiro. 5. objetivo acabar. 6. termômetro Digital. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2: Exemplo 2P imagem adquirida na espinal medula ventral reconstruções 3D do lado ventral de um não infectado, não danificado (A) e JHMV-infectados, desmielinização (B) da medula espinal.de um rato após transplante Thy1-EYFP com NPCs eGFP-marcados. Axônios fluorescência-rotulados são pseudocolored amarelo e NPCs são pseudocolored verde. Resolução da imagem: 512 pixels; volume da imagem: (A) x = 239 mm, y = 259 mm, z = 65 um construído utilizando 26-z pilhas espaçadas de 2,5 mm aparte e (B) X = 497 mm, y = 389 mm, z = 127,5 mm construído usando 51 z pilhas espaçadas de 2,5 mm de intervalo.

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Discussion

Real-time 2P imagiologia de tecido intacto é necessária para investigar a cinética da APN e interacções após o transplante para o rato demyelinated medula espinhal. Intravital 2P imagem é utilizada para determinar a dinâmica celular na face dorsal da medula espinal em ratos vivos, e tem sido utilizada para estudar a desmielinização dorsal em doenças desmielinizantes 17-19. No entanto, porque NPCs transplantadas migrar para a substância branca ventral, o qual se encontra muito profundo para imagem in situ utilizando microscopia 2P, uma preparação ex vivo é necessário. Esta metodologia tem sido utilizada no nosso laboratório para determinar a motilidade e remielinização cinética de NPCs transplantadas na medula espinal danificado e não danificado 6. Ex vivo preparações permitir a verificação de medulas espinhais não só longitudinalmente mas também transversalmente a partir do lado ventral 6,20 . Isto permite a análise das diferenças no movimento celular (velocidade e direção) e interações na transplant local, adjacente ao local de transplante, e a várias distâncias do local de transplante 6. Considerando que foi inicialmente concebido para esta preparação imagem transplantado eGFP-NPCs no lado ventral da medula espinal, que pode ser usado para qualquer imagem marcado por fluorescência de células ou tingidos a partir do ventral dorsal, ou faces laterais, alterando a orientação da medula espinal é montado. Benefícios deste preparação ao longo de imagem intravital incluem permitindo imaging lado ventral e faltando a necessidade de anestesia e cirurgia sobrevivência, o que ainda é necessária com as novas preparações intravital usando um setup 'janela de vidro ", que permitem múltiplas sessões de imagem sem repetidas cirurgias 19,21 . Deve notar-se que uma limitação deste procedimento em comparação com a abordagem da "janela de vidro" em combinação com imagens intravital é a incapacidade de obter vários pontos de tempo a partir de um único ratinho, uma vez que a espinal medula é removida e o rato é sacrificado.

2P imagiologia é idealmente adequado para a resolução dinâmica de células individuais dentro dos tecidos intactos 22,23. 2P excitação utiliza fótons do infravermelho próximo, que permitem por longos períodos de imagens de tecidos profundos com fototoxicidade mínima. 2P excitação ocorre após a absorção simultânea de dois fotões por um fluoróforo. A alta concentração de fotões necessárias para 2P excitação é conseguida por compressão espaço-temporal da saída do laser 2P num único plano focal. Isto restringe excitação fluorescente para o ponto focal, minimizando ainda mais a fototoxicidade em regiões da medula exterior do plano focal. Fótons do infravermelho próximo também reduziram dispersão, permitindo imagens até aproximadamente 300 mm a partir do lado ventral da medula espinhal 16.

Como acontece com qualquer nova técnica, no entanto, 2P imagem da medula espinhal explantada tem limitações que devem ser mantidos em mente. Esse protocolo utiliza uma imagem dichro 520 nmic espelho que permite a separação de eGFP e EYFP fluorescência, desviando emissão eGFP no canal fluorescente normalmente reservado para azul claro. Geração de segunda harmônica criada por colágeno na medula espinhal também aparece no canal azul, mas é facilmente distinguidas das células eGFP-marcados, que são significativamente mais brilhante nesta preparação, e têm uma parcela de sua emissão identificável no canal verde-amarelo como colagénio não. Esta técnica de mistura de canal e separação de diferentes partes de um espectro de emissão usando dichroics específicas muitas vezes é útil para a identificação visual ou automatizada de fluorophores individuais com espectros de emissão próximo ou quase sobreposição. Fototoxicidade é outra limitação deste protocolo imaging 2P. As células dentro de um único volume de imagem são sensíveis a fototoxicidade; portanto, experimentalista deve ser bem consciente de sinais de fototoxicidade. A fototoxicidade é tipicamente primeiro evidente na redução ou ausência de célulasmotilidade, seguido de fotodegradação e / ou alterações morfológicas nos tecidos locais. Vários fatores podem danificar o tecido levando a fototoxicidade ou tornando-o inadequado para geração de imagens de células vivas. É crítico para monitorizar a potência do laser e da temperatura e oxigenação do perfundido meio RPMI-1640. Também é imperativo para assegurar a remoção adequada da medula espinal do rato, sem estiramento ou compressão excessiva da medula espinhal e sem cortar a medula espinal com as lâminas. Se manuseado adequadamente, a preparação explantado medular irá permanecer viáveis ​​por até dez horas, conforme determinado por mobilidade celular robusta dentro da espinal medula ventral com nenhuma diminuição em 10 horas pós-extracção. Uma variedade de tecido extraído é normalmente visualizada por longos períodos de tempo e considerado viável 23-26. Portanto, a quantificação da dinâmica celular em múltiplas regiões dentro de um único medula espinhal é possível. Finalmente, deve notar-se que a grande maioria das células that não são marcado por fluorescência não serão visualizados por esta preparação (a menos que naturalmente autofluorescente), e é importante reconhecer que as células marcadas estão interagindo com um complexo ambiente de outras células endógenas não marcados, aparentemente invisíveis e elementos estruturais.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isoflurane, USP Piramal Critical Care, Inc N/A
Fine scissors Fine Science Tools 14060-09 sharp
scalpel blade #10 Fine Science Tools 10010-00
scalpel handle Fine Science Tools 10003-12
Luer rongeurs Fine Science Tools 16001-15
Graefe forceps Fine Science Tools 11052-10
Vannas scissors Fine Science Tools 15615-08
scalpel blade #11 Fine Science Tools 10011-00
RPMI-1640 Gibco 12-115F
agarose, low gelling temperature Sigma A9414-25G
Parafilm Fisher Scientific 13-374-12
Vetbond (tissue adhesive) 3M 1469SB
22 mm square cover slip Fisher Scientific 12-547
25X dipping objective, 1.1 NA Nikon CFI Apo LWD 25XW
Single inline solution heater Warner Instruments 64-0102
520 nm single-edge dichroic beam splitter Semrock FF520-Di02-25x36 Brightline
560 nm single-edge dichroic beam splitter Semrock FF560-FDi01-25x36 Brightline
photomultiplier tubes Hamamatsu R928
C/L variable-speed tubing pump Masterflex 77122-22
digital thermometer Comar Instruments 3501
Chameleon Ultra Ti:Sapphire laser  Coherent N/A
Slidebook 6 software 3i N/A
Imaris 7.7 software Bitplane N/A

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References

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Weinger, J. G., Greenberg, M. L., Matheu, M. P., Parker, I., Walsh, C. M., Lane, T. E., Cahalan, M. D. Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord. J. Vis. Exp. (96), e52580, doi:10.3791/52580 (2015).More

Weinger, J. G., Greenberg, M. L., Matheu, M. P., Parker, I., Walsh, C. M., Lane, T. E., Cahalan, M. D. Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord. J. Vis. Exp. (96), e52580, doi:10.3791/52580 (2015).

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