Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Imaging Ca doi: 10.3791/52588 Published: May 6, 2015

Summary

Vi beskriver ett protokoll för att övervaka Ca2 + dynamiken i axonet terminaler kon fotoreceptorer med hjälp av en ex-vivo skiva beredning av musen näthinnan. Detta protokoll möjliggör omfattande studier av kon Ca2 + signalering i en viktig modellsystem däggdjur, musen.

Abstract

Retinal kon fotoreceptorer (koner) tjänar dagsljus vision och är grunden för färgdiskriminering. De är föremål för degenerering, vilket ofta leder till blindhet i många retinala sjukdomar. Kalcium (Ca2 +), ett nyckel andra budbärare i fotoreceptor-signalering och metabolism, har föreslagits vara indirekt kopplade med fotoreceptor degeneration i olika djurmodeller. Systematiskt studera dessa aspekter av kon fysiologi och patofysiologi har hämmats av svårigheterna med elektriskt inspelning från dessa små celler, i synnerhet i mus där näthinnan domineras av stavfotoreceptorer. För att kringgå detta problem, har vi etablerat en två-foton Ca2 + avbildning protokoll med hjälp av en transgen mus linje som uttrycker genetiskt kodade Ca2 + biosensor TN-XL uteslutande i kottar och kan korsavlade med musmodeller för ljusmätare degeneration. Protokollet som beskrivs här innefattar framställning vertikala sektioner (R20, skivor ") av näthinnor från möss och optisk avbildning av ljus stimulus framkallade förändringar i kon Ca2 + nivå. Protokollet ger också "in-slice mätning" av absoluta Ca2 + koncentrationer; eftersom inspelningarna kan följas av kalibrering. Detta protokoll möjliggör studier i funktionella kon egenskaper och förväntas bidra till förståelsen av konen Ca2 + signalering liksom potentiell inblandning av Ca2 + i ljusmätare död och retinal degeneration.

Introduction

Vision börjar med ljus-inducerade aktiveringen av ljusöver kaskaden i retinala fotoreceptorer. Rod fotoreceptorer tillåter syn vid låga ljusnivåer, medan kon fotoreceptorer förmedlar färg och hög upplösning dagsljus vision. Många fotoreceptor-specifika gener är känsliga för mutationer som leder till degeneration av dessa celler. Ett antal molekylära markörer i samband med fotoreceptor förlust har identifierats 1, men hittills har de detaljerade molekylära mekanismer och händelseförloppet är fortfarande oklara. Förändrad Ca2 + homeostas spekulerades vara en utlösande faktor för fotoreceptor celldöd, en hypotes som stöds av uppreglering av aktiviteten hos Ca2 + -beroende calpain typ proteaser under degeneration processen 2,3. Men hittills, denna hypotes är inte backas upp av fysiologiska mätningar av Ca2 +. Inkonsekvenser i flera studier om effekten av Ca2 + kanalblockerare i retinal sjukdomar utmanade ytterligare medverkan av Ca2 + i celldöd 4-6, kräver metoder för att direkt bedöma Ca2 + i däggdjurs kon fotoreceptorer.

Tidigare har de flesta elektriska inspelning och Ca2 + imaging studier utförts i amfibie och reptil modeller på grund av lättare tillgång till koner 7-9. Emellertid kan däggdjur ljusmätare fysiologi skilja sig från den hos icke-däggdjur 10 och i synnerhet, i samband med mänskliga ärftliga näthinnedegeneration, är en bättre förståelse av däggdjursfotoreceptor fysiologi en nyckel till utveckling av innovativa behandlingar. Många musmodeller härma mänskliga retinala sjukdomar finns men lite är känt om Ca2 + dynamiken i mus koner 11. Elektriska tekniker är inte lämpliga för hög genomströmning inspelningar från kottar, särskilt inte hos möss, där stavar (~ 97%) betydligt fler än kottar (~ 3%) 12 2 + strömmar men inte på absoluta intracellulära Ca2 + koncentrationer. Därför, trots den lägre tidsupplösning, är avbildning metoden för val när man hanterar frågor om kon Ca2 + dynamik. Nyckelfrågan med avbildning är hur man selektivt märka koner med en fluorescerande Ca 2 + indikator färgämne. Korrekt uppdelning och cell specificitet är svårt att uppnå med "bulk-loading" syntetisk Ca 2 + indikator färgämnen i vävnaden. Som en följd av märkta kottar, stänger 13,14, och Müller gliaceller kan inte säkert skiljas. Även syntetiska färgämnen tenderar att läcka ut ur cellerna och förhindrar långvariga inspelningar under enhetliga förhållanden. Dessutom laddar syntetiska Ca2 + indikatorer i sin AM-esterform är problematisk, eftersom den kräver detergents (t.ex. DMSO) och genererar formaldehyd 15. För absoluta Ca2 + mätningar ratiometriska indikatorer är obligatoriska. Men det bästa för närvarande tillgängliga syntetiska ratiometrisk indikator Fura-2 kräver excitation ljus i intervallet 700-760 nm (för tvåfotonexcitering), som, beroende på dess intensitet, kan i sig stimulera kottar, och därmed hindra studier av kon Ca2 + dynamik under fysiologiska belysningsförhållanden.

Till skillnad från syntetiska färgämnen, kan genetiskt kodade Ca2 + indikatorer uttryckas i en celltyp-selektivt sätt. De inte läcker ut ur celler, och därför, om blekning undviks långa och tillförlitliga ratiometriska mätningar är möjliga. Celltyp-selektiva uttrycket av Ca2 + biosensorer, i kombination med två-foton mikroskopi, utgör ett kraftfullt verktyg för att bedöma och studera subcellulära Ca2 + i hög grad fysiologiska förhållanden 13,16,17 + dynamiken i en transgen Ca2 + biosensor mus linje (HR2.1: TN-XL), som uttrycker FRET-baserade Ca2 + biosensor TN-XL 18 selektivt i kottar, enligt den mänskliga röda opsin promotor HR2.1 19. För att komma åt kon terminaler, var en ex-vivo skiva beredning 20 anställda. Protokollet var redan med framgång använts i tre studier på kon funktion hos friska möss 10,21,22. Dessutom tillåter protokollet studera kon Ca2 + signalering i specifika genetiska förhållanden, t.ex. genom att korsa musmodeller för ärftlig näthinnedegeneration med HR2.1: TN-XL möss.

Protocol

Alla djurförsök utfördes följa de riktlinjer och lagar för djurskydd bestäms av tyska förbundsregeringen och godkänts av den institutionella djurskyddskommitté vid universitetet i Tübingen.

1. Djur Modeller

  1. HR2.1: TN-XL Ca2 + biosensor mus
    1. Använd den transgena HR2.1: TN-XL mus som uttrycker Ca2 + biosensor TN-XL selektivt i kon fotoreceptorer 10. Använd 3-6 veckor gamla möss av båda könen upp med en vanlig 12 timmar dag / natt rytm.

2. Retinal Dissection

  1. Fysiologisk lösning
    1. Bered färskt 2 L av extracellulär lösning, innehållande 125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1,25 mM NaH 2 PO 4, 26 mM NaHCOs 3, 0,5 mM L-glutamin, och 20 mM (+) glukos. Blanda tills alla ingredienser lösas upp.
    2. "Bubble" extracellulära lösningmed carboxygen (95% O2, 5% CO2) under 5 - 10 min. Lägg CaCl2 för att nå en koncentration av 2 mM.
    3. Efter bubblande den extracellulära lösningen, mäta dess pH. PH-värdet bör vara 7,4, annars är det sannolikt att misstag har gjorts under framställningen av lösningen. Håll bubblande hastighet och lösningens temperatur konstant under hela experimentet för att säkerställa konstant pH.
    4. Separera lager i 2 flaskor, en för näthinnan dissektion och en för inspelning inställning (perfusion).
  2. Ögon enucleation och isolering av näthinnan (5 - 10 min)
    1. Upprätthålla en mörk röd belysning i arbetsområdet för enucleation. Använd lysdioder med en toppvåglängd av 650 nm (eller längre) för att undvika blekning av koner under dissekering.
    2. Dark-anpassa musen för 2 timmar genom att sätta sin bur i ett väl ventilerat, ljustäta rutan för att se till att kottar är fullt sensibiliserade vid tidpunkten för inspelningarna.
    3. Bedöva musen under ett laboratory huva med isofluran (5%) med användning av en förångare och en gastät behållare som innehåller en vanlig mus bur. Följ noga tillverkarens anvisningar vid hantering av förångaren. Använd handskar och ansiktsmask för att minska exponeringen för allergener.
    4. Använd en kikare mikroskop med en 10 - 40X förstoring för dissekering.
    5. Offra bedövade musen genom halshuggning.
    6. För orientering, markera toppen av varje öga (= rygg) med en vattentät penna. Håll koll på om du använder vänster eller höger öga.
    7. Ta ögat försiktigt med böjd sax genom att skära synnerven bakom ögongloben. För dissektion, överföra ögongloben till en petriskål med färskt carboxygenated extracellulära lösning. För överföring ögongloben, håller du den i synnerven stubben.
    8. Borra ögat vid någon punkt längs gränsen mellan hornhinnan och senhinnan (dvs. vid ora serrata) med en vass injektionsnål.
    9. Håll eni på sklera med en pincett och försiktigt in en sax blad i hålet som gjorts i föregående steg. Klipp längs ora serrata att separera den främre delen av ögat (hornhinnan, linsen, glaskropp) från den bakre delen (ögonmusslan). Skär ögonmusslan radiellt (mot synnervspapillen) vid positionen för pennans märkning som anger ryggläge på näthinnan.
      Obs: Förberedd på detta sätt, de ögonmusslor kan hållas i ständigt carboxygenated lösning för senare användning.
    10. Vrid ögonmusslan i petriskålen så att den dorsala skära punkter bort från sig själv. Ta sklera på vänster och höger sida av ögonmusslan med en pincett var genom att sätta pincetten tips mellan näthinnan och sklera.
    11. Lossa näthinnan genom att försiktigt vända den sklerala delen av ögonmusslan. Slutligen, skär synnerven med hjälp av mikro dissekera sax för att befria näthinnan från sklera.
      Obs! Detta är ett kritiskt steg. Undvik skador på näthinnan (t.ex. genomgripande och klämma med pincett).
    12. Håll en av kanterna på näthinnan med en pincett och försiktigt bort skräp och glaskroppen från näthinnan ytan med en andra pincett. När näthinnan ytan är ren, använda micro dissekera sax för att göra ytterligare tre korta, radiella snitt (ungefär var 90 °). Dessa nedskärningar tillåter en att noggrant platta näthinnan med ljusmätare sidan nedåt i petriskålen (Figur 1A).
  3. Slice förberedelse (10 - 15 min)
    1. Förbered i förväg nitrocellulosafiltermembran för retinala skivning och glastäckglas för montering skivor och överföra dem till inspelningen kammaren. Klipp nitrocellulosafiltermembran till ca 10 x 5 mm stora rektangulära bitar med hjälp av en sax. Skär täck till ca 10 x 5 mm stora rektangulära bitar med hjälp av en glasscutter.
    2. Sakta doppa en glasskiva i den extracellulära lösningen näravävnad. Försiktigt, drar näthinnan på glasskiva med gangliecell uppåt genom att ta tag den på mycket kanten med en pincett. Denna process reducerar mekanisk skada och vikning av vävnad.
    3. Välj området av näthinnan som är relaterad till den respektive frågeställning (se även diskussion). Kom ihåg att den långa snitt i steg 2.2.9 markerar rygg näthinnan hälften (Figur 1A). Skär en rektangulär, ca 1 x 2 mm stor bit av den valda retinal region med en böjd skalpellblad. Torka bort överskottslösning runt vävnaden.
    4. Placera filtermembranet ovanpå stycket av näthinnan så att gangliecell sidan vidhäftar till membranet. Omedelbart, tillsätt en droppe extracellulära mediet på membranet för att stadigt fästa vävnaden till membranet.
    5. Överför membranet monterade näthinnevävnad till skiv kammare som innehåller färsk extracellulära lösning.
    6. Skär näthinnan i vertikala skivor 200 umtjocklek (Figur 1B) med en ny rakblad ansluten till en vävnad chopper 23. Ändra blad för varje retinal bit.
      Obs: rakblad måste perfekt inriktade med ytan av den skivning kammarens botten, så att hela membranet delar samtidigt, såsom anges med en "klickande" ljud vid skärning - annars bladet kan böjas och skada segmentet.
    7. Limma en enda membran monterad skiva till en glaskupa-slip genom att tillämpa höga fett vakuum till membranet slutar bara (Figur 1C). Håll glasytan under näthinnan fri från fett.
    8. Håll täckmonterade skivor som omfattas av en droppe av extracellulärt lösning i mottagningskammaren - en sluten och lightproof behållare, t.ex. en petriskål med lock täckt med aluminiumfolie - under carboxygen atmosfär vid rumstemperatur. Införa carboxygen genom att bubbla en liten vattenreservoar för att hålla stämningen på anläggningenkammaren fuktas; detta förhindrar skivorna från att torka ut.
    9. Låt skivor att vila i mottagningskammaren under 10 - 15 min innan du flyttar dem (ett i taget) till inspelningen kammaren. Skivor kan bibehållas upp till 4-5 timmar i hållkammare vid RT (~ 21 ° C).

3. Två-fotonen Ca2 + Imaging

  1. Två-foton mikroskopi
    1. Använd en Rörlig Mål Mikroskop (MOM) -typ två-photon mikroskop. Både design och avbildningsförfaranden MOM beskrevs tidigare 24, för mer information se även 10,21,25 (för källor och företag, se tabell 1).
      Obs: Alla upprätt två-photon mikroskop som uppfyller följande minimikrav kan användas: Det måste vara utrustade med (a) en pulsad laser avstämbar till ~ 860 nm, (b) minst två samtidigt förvärvade fluorescenskanaler, (c ) filter för eCFP och citrin fluorescens, (d)en lätt stimulator (för eventuella motiv se 24,26), och (e) programvara som gör det möjligt att spela in tids förfallit bildsekvenser på en bildhastighet är tillräcklig för att lösa Ca 2 + -signaler av intresse.
    2. Starta två-foton-avbildningssystem såsom anges av tillverkaren. Strikt följa anläggningens riktlinjer lasersäkerhets. Starta lasern och anpassa det till ~ 860 nm.
    3. Överför en skiva från mottagningskammaren till inspelningen kammaren och omedelbart börja perfusion med carboxygenated extracellulära lösning. Upprätthåll en perfusions flödeshastighet av 2 ml / min och en temperatur av 37 ° C i inspelningen kammaren.
    4. Använd en 20X 0,95 NA nedsänkning i vatten mål. Om tillgängligt, använd en CCD-kamera i kombination med en infraröd LED under inspelningen kammare för att hitta den retinala slice (Figur 2). Annars lokalisera segment med hjälp av två-photon avbildning (se 3.1.5).
    5. Växla till två-foton imaging att visa biosensor uttryck. Sätta påde två detekteringskanaler för fluorescens avbildning av eCFP och citrin.
    6. Använd bilden förvärvet programvara som styr två-photon mikroskop för att skanna och välja en rad kottar terminaler för inspelning (figur 3A). Ställ in bildtagning till 128 x 16 pixel bilder (31,25 Hz) eller en liknande konfiguration. Begränsa skannade område kon terminaler för att undvika blekning av photopigments i yttre segment.
      Obs: För TN-XL kalciumsensor (τ = ~ 0,6 sekunder för Ca2 + bindning, τ = ~ 0,2 sekunder för Ca2 + ej bindande, se 16) en minimibildhastighet på ~ 8 Hz rekommenderas.
  2. Lätt stimulans och inspelning
    1. Använd en sub-scenen full fält ljus stimulator som beskrivs på annat håll 10,21,26 att utföra följande steg.
      Obs: En enkel lösning för en full-fältet ljus stimulator är att använda två bandpass-filtrerade lysdioder (t.ex. "blå": 360 BP 12, "gröna": 578 BP 10)som matchar våglängdskänsligheter av mus kottar men samtidigt inte överlappar med de filter som används för fluorescensdetektering (jfr. 3.2.4). Ljuset från lysdioderna fokuseras av kondensorn genom botten av inspelningen kammaren (Figur 2). Mer information om detta stimulator design, kalibrering, Ijusintensiteterna används och den framkallade kon foto isomerisering priser, se 10,21,26.
    2. Sätt på lasern och tillåta koner att anpassa sig till avsökningslaser och stimulus bakgrundsljus (20-30 sek, se även möjliga fallgroparna) innan presentera ljusstimuli (se 3.2.3) eller applicering farmakologiska medel.
    3. Starta presentation av godtyckliga stimuli (t.ex., ljusblixtar, såsom visas i fig 3B, C). I fallet med stimulatorn beskrivs i steg 3.2.1, generera stimuli genom att modulera intensiteten för de två lysdioderna över tiden med användning av en mikroprocessorkortet styrs av kundanpassad programvara (tilldetaljer, se 10,21,26).
    4. Starta inspelningen de två fluorescenskanaler (t.ex. vid 483 nm för "blue" FRET-givare eCFP och vid 535 nm för "gul" FRET-acceptor;. För specifikationer se tabell 1) samtidigt med hjälp av respektive bild förvärv programvara (se även 3.1 0,6). Till exempel när det gäller blinkar (Figur 3B, C), spela in minst 8 - 10 stimulans presentationer (prövningar).
  3. "I-skiva" Ca2 + kalibrering
    1. Spela Ca 2 + -signaler i kon terminaler (enligt beskrivningen i 3.1.6 och 3.2.4) och extrahera baslinjen Ca2 + nivå i en uppsättning av koner (som beskrivs i 3.4).
    2. Växla till "Ca2 + fri" extracellulärt medium med 5 | iM jonomycin (löst i DMSO) och 10 mM EGTA (eller, alternativt, BAPTA) tillsattes. Spela cone terminaler igen varje fem minuter för att bestämma den minimala fluorescensförhållandet (Rmin), <em> dvs förhållandet i den (nära) frånvaro av intracellulära Ca2 +. Det kan ta allt mellan 15-30 minuter.
      Obs! En perfusionssystem krävs som gör att växla mellan olika behållare.
    3. Växla till extracellulära mediet med 5 iM ionomycin (löst i DMSO) och 2,5 mM Ca 2 +. Efter en inkubationstid av 5 min, diagram koner igen var 5 min för att mäta den maximala fluorescensförhållandet (Rmax), dvs förhållandet i närvaro av mättande koncentrationer av intracellulär Ca2 +. Efter ionomycin ansökan, kan det ta mellan 3-15 minuter för Ca2 + förhållandet att bli stabil.
      Obs: Utsätta skivorna till högt Ca2 + och jonomycin under en längre period kommer så småningom skada cellerna. Inkludera endast celler i analysen som behåller sin normala morfologi. Koncentrationer (dvs, EGTA, jonomycin) kan behöva anpassas. För mer information om Ca2 + kalibreringprotokollet, se 13,17.
  4. Dataanalys
    Obs: Använd en bildbehandling och dataanalys programpaket som är kompatibelt med respektive mikroskop programvara och kan köra egna analys skript.
    1. Ladda en avbildning datafil och rita områden av intresse (ROI) runt varje kon terminal (Figur 3A). För varje ram, genomsnittlig fluorescensintensitet inom ROI och subtrahera bakgrundsfluorescens, innan beräkning av förhållandet (R) mellan FRET-acceptor (citrin) och givare (eCFP) fluorescens (R = F A / A D, fig 3B, C). Detta förhållande används vanligen som ett mått på relativ intracellulär Ca2 + koncentration, men efter kalibrering (se 3.3), också absoluta koncentrationer kan uppskattas (se 3.4.3).
      Obs: De pediklar kan kännas igen av deras läge i det yttre plexiformskiktet och deras morfologi (något tillplattad "blobbar" mindre än konensomata, som ligger i slutet av konen axonet).
    2. Genomsnittliga stimulansförsök (Figur 4A). Utdrag svarsparametrar från genomsnitt spår (Figur 4B), såsom Ca2 + basnivå (R bas) före ljus stimulering, toppamplitud (R amp), och området under kurvan (R A) som åtgärder för respons storlek. Dessutom, extrahera svars kinetik från i genomsnitt spår, såsom svar ökning (t uppgång) och förfall (t förfall) (= respektive tidsintervall mellan 20% och 80% av R amp; se illustrationen i Figur 4B). För mer information om hur du bestämma dessa parametrar, se 10.
    3. Beräkna en uppskattning av den absoluta könen Ca2 + koncentration baserad på mätningar från steg 3.3.1-3.3.3. Använd förhållandena för minimal och maximal Ca2 + koncentration, R min och R max respektive donator fluorescens i Ca2 + D, Ca bundna) och -unbound (F D, Ca-fri) tillstånd, liksom in vivo dissociationskonstant (Kd = 0,77, se 16) för TN-XL med följande ekvation (analog till 27):

Ekvation 1

Representative Results

Genom att kombinera vertikala segment (Figur 1), framställd från HR2.1: TN-XL mus näthinnan med två-foton-avbildning (Figur 2), kunde vi utföra ratiometriska mätningar av ljus stimulus framkallat Ca 2 + -signaler i kon fotoreceptor axonet terminaler . Detta tillvägagångssätt utgör en betydande förbättring av tillgång och visualisera mus koner över befintliga optiska avbildningsmetoder med syntetiska Ca2 + indikatorer. Till exempel kon specifika uttryck av genetiskt kodade ratiometrisk Ca2 + biosensor TN-XL hög grad underlättade identifieringen av konen axon terminaler (se ROI i figur 3A). Därför eliminerar våra protokoll risken för inspelningssignaler av oklar ursprung, som till exempel "blandade" signaler med bidrag från både kon och stav axonet terminaler.

Vårt förhållningssätt gör att lösa enda rättegång svar på samma nivå som den fysisk persondubbel kon axonet terminalen. Ljus-framkallade extrudering av Ca2 + från konen terminalen är markerad av en ökning och en minskning i donator och acceptor fluorescensen, respektive (figur 3B). Minskning av fluorescensförhållande (R) motsvarar extrudering av Ca2 + från konen terminalen (fig 3C), som orsakas av ljus-inducerade hyperpolarisering av könen och efterföljande stängning av spänningskänsliga Ca 2 + kanaler. Eftersom flera kon axon terminaler kan övervakas samtidigt (Figur 3A), är datainsamling mycket effektiv och hundratals kon Ca2 + svar kan samlas i ett enda experiment. Genom att bedöma dessa svar kvantitativt (Figur 4), kan kon Ca 2 + -signaler jämföras och utvärderas i en rad villkor (se diskussion).

Det är ofta tillräckligt att använda förhållandet mellan FRET-acceptor (citrin) och -donor (eCFP) fluorescens(F A / F D, för mer information, se 3.4) som ett relativt mått på den intracellulära Ca2 + nivå. Men när det är nödvändigt, förhållandet kan kalibreras för att få absoluta intracellulära Ca2 + koncentrationer ([Ca2 +]) (Figur 5). Vid bakgrundsbelysningen används i detta protokoll (för mer information, se 10 och Figur 3 legend), kalibrering gav en uppskattning för den absoluta vila [Ca2 +] i "wild-type" HR2.1: TN-XL mus kon terminaler 243 ± 159 nM (medelvärde ± SD), vilket är inom intervallet rapporterats för möss i litteraturen 11.

Figur 1
Figur 1. Beredning av vertikala retinal skivor. (A) Isolerade och slätat ut näthinnan förberedd för skivning. (B) rektangulär bit av näthinnan (see röd ruta i A) är monterad på filterpapper membran (mörkgrå) efter skivning. (C) Uppifrån av membranet monterade retinal skiva fäst på ett täckglas med fett. (D) Schematisk bild av en del av en retinal skiva (se röd ruta i C). Cone fotoreceptorer indikeras i grönt. V, ventrala; D, rygg; N, nasalt; T, temporal; OS yttre segment; ENDA, yttre kärnskiktet; OPL, yttre plexiform lager; INL, inre kärnskiktet; IPL, inre plexiform lager; GCL, ganglion cellager. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2
Figur 2. Två-foton avbildning av retinala skivor: Illustration av konfigurationen inspelningen Top:. Vatten nedsänkning objektiv fokusera varaam av scanning laser (röd nedåtpilen) i näthinnan, och samla den emitterade fluorescensen (uppåt pilar). Linsen samlar också överföras infrarött ljus från en belysnings LED monterad under kondensorn när avbildning av segment med hjälp av en CCD-kamera Center:.. Retinal skiva monterad i inspelningen kammaren och perfusion med extracellulära lösning Nederst: kondensorlins fokuserar ljuset från stimulerings lysdioder (och den infraröda LED för CCD-kamera avbildning) genom den transparenta botten av inspelningen kammaren in i näthinnans vävnad. IR LED, infrarött ljus-emitterande dioder, CCD, charge-coupled device; BP, bandpass. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. Ljus Evoked Ca2 + svar i axon terminaler mus cone fotoreceptorer. (A) Vänster: Inspelningar fokuserat på synaptiska terminaler (röd box) av kon fotoreceptorer (grön) i näthinnan skivor Höger:. Exempel på en inspelad region med 7 enskilda terminaler. Fluorescens registrerades med användning av två kanaler:. En för FRET-acceptor citrin (överst; 535 BP 50) och en för FRET-givare eCFP (botten; 480 BP 32) (B) ljus-framkallade förändringar i citrin (F A) och eCFP (F D) fluorescens registreras i en enda ROI. (C) Ca2 + svar (som förhållandet F A / F D) i en kon terminal till en serie av 1 sek ljusa ljusblixtar i 5 sek intervall. ROI, region av intresse; BP, bandpassfilter; F, fluorescensintensitet; au, godtyckliga enheter; FRET, Förster resonansenergiöverföring; eCFP, förbättrad cyan fluorescerande protein. Stimulusintensitet (som poto-isomerisering takten i 10 3 · P · s -1 per kon). 13.0 och 12.8 för M- och S-opsins, respektive lägga till en bakgrundsnivå (= LED off, excitation laserskanning) på ~ 10 Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4
Figur 4. Exempel på kvantitativ analys av ljus framkallade kon Ca2 + svar (A) Ljus framkallade Ca 2 + svar (som AR) från en enda kotte terminal (enstaka prövningar: grå spår, n = 16, genomsnittlig:. Svart spår ) (B) Parametrar som fastställts för den genomsnittliga Ca2 + svar:. Vila Ca2 + nivå (R bas) motsvarar baslinjen före ljus stimulans, svars storlek som area-under-kurvan (RA) och toppamplituden (R amp), kinetiken för svars debut (t stiga, tidsintervallet från 20% till 80% av R-amp) och offset (t förfall, tidsintervallet från 80% till 20% av R amp). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5
Figur 5. Uppskattande absolut Ca2 + -koncentrationen. Vilande Ca2 + -koncentrationen ([Ca2 +], som förhållandet F A / F D) in i åtta kon axonet terminaler i en TN-XL mus (cirklar, med medelvärde ± SD) för olika extracellulära lösningar: två gånger i standard extracellulära mediet (Ctrl 1 och 2), därefter med minimal ("noll") [Ca2 +] (10 mM EGTA) end med hög [Ca2 +] (2,5 mm), de två sistnämnda villkoren i närvaro av 5 iM jonomycin att jämvikt extracellulära och intracellulära Ca2 +. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Pre-existerande protokoll som använder elektro encelliga inspelningar eller Ca2 + avbildning med syntetiska fluorescerande indikatorer kämpar för att registrera Ca2 + dynamiken i mus kon fotoreceptorer för ett antal tekniska skäl (se inledningen). Protokollet som beskrivs här möjliggör mätning av Ca 2 + -signaler och även absoluta Ca2 + nivåer i enskilda, identifierade mus kon terminaler i ett effektivt och relativt enkelt sätt.

Detta protokoll har redan med framgång använts i tre studier som behandlar olika aspekter av kon funktion hos friska mus näthinnan. I den första studien 10, den HR2.1: var TN-XL mus karakteriseras med hjälp av immunohistokemi, ERG inspelningar, två-foton Ca2 + avbildning och farmakologi, visar att kon specifika uttryck av Ca2 + biosensorn inte hindrar kon anatomi och funktion. I den andra studien 21, kromatiskoch akromatiska responsegenskaperna hos mus kottar kartlades över näthinnan, visar slående skillnader i kon funktion mellan "gröna" opsin dominerade rygg och "blå" opsin dominerade ventrala mus näthinnan. Dessa regionala skillnader i kon egenskaper matchas distributionsdifferential kontrast i den naturliga miljön (dvs himmel vs jord), vilket tyder på att de olika spektrala typer av mus kottar föreskriver (nära) optimal provtagning av akromatiska kontraster och därmed kan erbjuda en evolutionär fördel. I den tredje studien 22 ömsesidigt feedback som kon axon terminaler får från horisontella celler undersöktes. Eftersom alla föreslagna återkoppling horisontell cellmekanismer verka på spänningskänsliga Ca2 + kanaler i kon axonet terminalerna 28, kan kon terminal Ca2 + fungera som en proxy för övergripande cell-till-kon interaktioner. Studien av Kemmler och medarbetare 22 stödenanser att horisontella celler använder ett komplext återkopplingssystem som omfattar flera mekanismer för att kontrollera ljusmätare glutamatfrisättning.

Dessa studier visar mångsidigheten hos den beskrivna protokollet och visar att det kan anpassas till ett brett spektrum av frågor rörande kon funktion och dess synaptiska kretsar. Dessutom möjliggör protokollet studera lokala Ca2 + signalering i de olika kon facken, mot en bättre förståelse av kon fysiologi. Sådan kunskap är viktigt att förstå patofysiologiska processer i degenererande kottar, för att så småningom göra det möjligt för en rationell utveckling av potentiella terapeutiska metoder, i synnerhet för degenerativa sjukdomar som drabbar kottar.

I HR2.1: TN-XL mus linje, är den Ca2 + biosensorn uttryckt i hela kon, med undantag av det yttre segmentet. Detta ger en möjlighet till direkt och ratiometrisk bedömning av Ca2 + dynamiskasi olika cone fack. Eftersom förändringar i Ca 2 + strömmar i det yttre segmentet återspeglas i terminaler via membranpotentialen och den resulterande aktiveringen av spänningskänsliga Ca2 + kanaler, kan observeras processer i det yttre segmentet indirekt.

Potentiella fallgropar:

Dissektion av näthinnan är ett kritiskt steg: I musen, separerar näthinnan från ögonmusslan vanligtvis mellan fotoreceptor yttre segment och pigmentepitelet. Därför är de ljuskänsliga fotoreceptor yttre segment av det isolerade näthinnan exponerade och extremt känslig för mekanisk skada. Stor försiktighet måste vidtas för att inte skada genom att röra vid fotoreceptorsidan med verktyg eller genom att flytta den vävnad i sidled på en vidhäftande yta (t.ex., ett filtermembran).

Högkvalitativa retinal skivor kan kännas igen under mikroskop genom sin rena skäryta ochgenom en välorganiserad fotoreceptor skikt med klart definierade yttre segment. Funktionell bedömning av skiva kvalitet kan snabbt göras genom att blinka starkt ljus stimuli och bestämma andelen responsiva koner (t.ex. i ett synfält med 10 - 20 strutar). Här bör svarskvaliteten utvärderas genom att beräkna signal-till-brusförhållande (S / N) (amplitud av baslinjen brus innan Ijusstimulus kontra amplituden hos ljus respons); en S / N av 2 - 3 bör betraktas som den lägsta tröskeln. Typiskt, vi kasta skivor med mindre än 50% som svarar kottar. Skär också med koner som visar alltför spontana tillsatta beteende (se figur 4 i 10) ska kasseras.

Skivor i inspelningen kammaren som uppfyller de ovan nämnda anatomiska och funktionella kriterier visar konsekventa svar för 1 - 2 tim (för mer information om svars konsistens, se 10). Eftersom skivor överleva hvår i mottagningskammaren, kan ett lyckat experiment pågå i upp till 6 timmar. Det är anmärkningsvärt att det finns vissa begränsningar med avseende på att studera länge gående rumsliga samspelet mellan koner och horisontella celler, som skivning klipper oundvikligen sido anslutningar i näthinnan nätverk. Att öka tjockleken på näthinnan skivor till 300 pm förbättrar denna fråga 22.

Användningen av vertikala retinala skivor undviker scanning av ljuskänslig cone yttre segment av excitation laser och sålunda till stor del förhindrar opsin blekning (för omfattande diskussion, se 10,21). Trots de inspelade Ca 2 + -signaler inte enbart beroende på ljusstimuli, men också få påverkas av en bakgrundsbelysning komponent som alstras av scanning excitation laser. I själva verket är den effektiva bakgrundsbelysning i sådana två-photon imaging experiment en kombination av spritt laserljus, fluorescerande ljus som emitteras av den inspelade ceLLS, och varje LED stimulans bakgrund komponent. Därför bör koner tillåtas anpassa sig under åtminstone 20 - 30 s till laserskanning (med bakgrunden komponenten av Ijusstimulus påslagen) före inspelningen.

Fördelar och applikationer:

Medan vissa program för kon Ca2 + -imaging protokoll har beskrivits ovan 10,21,22, kan andra program förutses: Farmakologiska studier i kombination med kon Ca2 + avbildning kan validera Ca2 + signalvägar i kottar och kan vara används för att testa effektiviteten och potensen av läkemedel inriktade på olika aktörer i Ca2 + -signaling 10. Dock kan en nyckel ansökan vara att studera sjukdomar som drabbar kon funktion. Många retinala modeller degeneration mus härma mänskliga sjukdomar finns. Till exempel är kon fotoreceptor förlust 1 (CPFL 1) mus en primär kon degeneration modell lidandefrån en Pde6c mutation 29. Omvänt, lider stången degeneration 1 (rd 1) mus från en Pde6b mutation. Även om detta orsakar primära spö ljusmätare degeneration 30, när rd 1 spö förlust avslutade, sekundära kon degeneration sätter in 1. Korsa dessa djur med HR2.1: TN-XL linje gör det möjligt att studera och jämföra Ca2 + dynamiken i både primära och sekundära kon degeneration och kommer sannolikt att ge värdefulla insikter i rollen av Ca2 + under kon celldöd. Även farmakologiskt inducerad kon degeneration - till exempel med hjälp av selektiva PDE6 hämmare - kan användas för att identifiera nedströms mekanismer för kon degeneration 10,29,31.

Sammanfattningsvis beskrev protokollet här tillåter mätning Ca2 + i subcellulära fack av mus kon fotoreceptorer och presenterar fantastiska möjligheter att avslöja kon fysiologi under ett brett spektrumav fysiologiska och patofysiologiska tillstånd. Dessutom kan detta protokoll användas för screening av farmakologiska medel som är avsedda att störa kon Ca2 + -signaling och därmed bidra till att skapa nya terapier för kon sjukdomar.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
High vacuum grease Dow Corning 1018817 http://www.dowcorning.com
Cover slips R. Langenbrinck 24 x 60 mm; http://www.langenbrinck.com
Glass slides R. Langenbrinck 76 x 26 mm; http://www.langenbrinck.com
Blades for tissue chopper MARTOR KG ARGENTAX No. 1044 0.25 mm; http://www.martor.de
Tissue chopper Custom-build Based on a design by F. Werblin23, adapted by T. Schubert
Nitrocellulose filter membrane gridded Merck Millipore AABG01300 Filter type: 0.8 µm; http://www.emdmillipore.com
Isoflurane CP CP pharma AP/DRUGS/220/96 http://www.cp-pharma.de
UV/green LED-based full-field stimulator Custom-build for details, see10
Open source microprocessor board Arduino http://www.arduino.cc
Imaging software CfNT Custom-written developed by Michael Müller, MPI for Medical Research, Heidelberg, Germany
IgorPro Wavemetrics http://www.wavemetrics.com
VC3-4 System focal perfusion system ALA Scientific Instrument with 100 μm-diameter tip manifold; http://www.alascience.com/
Mai Tai HP DeepSee (Ti:Sapphire laser) Newport Spectra-Physics http://www.spectra-physics.com
Movable objective microscope (MOM),
Designed by W. Denk, MPImF, Heidelberg, Germany
Sutter Instruments http://www.sutter.com/MICROSCOPES/index.html
Name Company Catalog Number Comments
XLUMPlanFL 20X/0.95w objective Olympus http://www.olympusamerica.com
Vaporizer 100 series Surgivet http://www.surgivet.com
Ionomycin, Calcium salt Life technologies I24222 http://www.lifetechnologies.com
EGTA Sigma-Aldrich E3889 https://www.sigmaaldrich.com
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich 101191250 http://www.sigmaaldrich.com
Leica MZ95 leica microsystems http://www.leica-microsystems.com/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Trifunovic, D., et al. Neuroprotective strategies for the treatment of inherited photoreceptor degeneration. Current Molecular Medicine. 12, 598-612 (2012).
  2. Paquet-Durand, F., et al. Calpain is activated in degenerating photoreceptors in the rd1 mouse. Journal of Neurochemistry. 96, 802-814 (2006).
  3. Paquet-Durand, F., et al. A key role for cyclic nucleotide gated (CNG) channels in cGMP-related retinitis pigmentosa. Human Molecular Genetics. 20, 941-947 (2011).
  4. Frasson, M., et al. Retinitis pigmentosa: rod photoreceptor rescue by a calcium-channel blocker in the rd mouse. Nature Medicine. 5, 1183-1187 (1999).
  5. Bush, R. A., Kononen, L., Machida, S., Sieving, P. A. The effect of calcium channel blocker diltiazem on photoreceptor degeneration in the rhodopsin Pro213His rat. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41, 2697-2701 (2000).
  6. Pawlyk, B. S., Li, T., Scimeca, M. S., Sandberg, M. A., Berson, E. L. Absence of photoreceptor rescue with D-cis-diltiazem in the rd mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 43, 1912-1915 (2002).
  7. Sampath, A. P., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Bandarchi, J., Fain, G. L. Light-dependent changes in outer segment free-Ca2+ concentration in salamander cone photoreceptors. The Journal of General Physiology. 113, 267-277 (1999).
  8. Choi, S. Y., et al. Encoding light intensity by the cone photoreceptor synapse. Neuron. 48, 555-562 (2005).
  9. Krizaj, D. Calcium stores in vertebrate photoreceptors. Advances in Experimental Medicine and Biology. 740, 873-889 (2012).
  10. Wei, T., et al. Light-driven calcium signals in mouse cone photoreceptors. The Journal of Neuroscience. 32, 6981-6994 (2012).
  11. Johnson, J. E. Jr, et al. Spatiotemporal regulation of ATP and Ca2+ dynamics in vertebrate rod and cone ribbon synapses. Molecular Vision. 13, 887-919 (2007).
  12. Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. The major cell populations of the mouse retina. The Journal of Neuroscience. 18, 8936-8946 (1998).
  13. Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators. Nature Protocols. 1, 1057-1065 (2006).
  14. Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. Chemical calcium indicators. Methods. 46, 143-151 (2008).
  15. Tsien, R. Y. A non-disruptive technique for loading calcium buffers and indicators into cells. Nature. 290, 527-528 (1981).
  16. Hendel, T., et al. Fluorescence changes of genetic calcium indicators and OGB-1 correlated with neural activity and calcium in vivo and in vitro. The Journal of Neuroscience. 28, 7399-7411 (2008).
  17. Dreosti, E., Odermatt, B., Dorostkar, M. M., Lagnado, L. A genetically encoded reporter of synaptic activity in vivo. Nature Methods. 6, 883-889 (2009).
  18. Mank, M., et al. A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change. Biophysical Journal. 90, 1790-1796 (2006).
  19. Wang, Y., et al. A locus control region adjacent to the human red and green visual pigment genes. Neuron. 9, 429-440 (1992).
  20. Connaughton, V. P. Zebrafish retinal slice preparation. Methods in Cell Science. 25, 49-58 (2003).
  21. Baden, T., et al. A tale of two retinal domains: near-optimal sampling of achromatic contrasts in natural scenes through asymmetric photoreceptor distribution. Neuron. 80, 1206-1217 (2013).
  22. Kemmler, R., Schultz, k, Dedek, K., Euler, T., Schubert, T. Differential regulation of cone calcium signals by different horizontal cell feedback mechanisms in the mouse retina. The Journal of Neuroscience. 34, 11826-11843 (2014).
  23. Werblin, F. S. Transmission along and between rods in the tiger salamander retina. The Journal of Physiology. 280, 449-470 (1978).
  24. Euler, T., et al. Eyecup scope--optical recordings of light stimulus-evoked fluorescence signals in the retina. Pflugers Archive. European Journal of Physiology. 457, 1393-1414 (2009).
  25. Baden, T., Berens, P., Bethge, M., Euler, T. Spikes in mammalian bipolar cells support temporal layering of the inner retina. Current Biology. 23, 48-52 (2013).
  26. Breuninger, T., Puller, C., Haverkamp, S., Euler, T. Chromatic bipolar cell pathways in the mouse retina. The Journal of Neuroscience. 31, 6504-6517 (2011).
  27. Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. The Journal of Biological Chemistry. 260, 3440-3450 (1985).
  28. Thoreson, W. B., Mangel, S. C. Lateral interactions in the outer retina. Progress in Retinal and Eye Research. 31, 407-441 (2012).
  29. Trifunovic, D., et al. cGMP-dependent cone photoreceptor degeneration in the cpfl1 mouse retina. The Journal of Comparative Neurology. 518, 3604-3617 (2010).
  30. Sahaboglu, A., et al. Retinitis pigmentosa: rapid neurodegeneration is governed by slow cell death mechanisms. Cell Death & Disease. 4, e488 (2013).
  31. Sahaboglu, A., et al. PARP1 gene knock-out increases resistance to retinal degeneration without affecting retinal function. PloS One. 5, e15495 (2010).
Imaging Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamik i Cone ljusmätare Axon terminaler i Mouse Retina
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kulkarni, M., Schubert, T., Baden, T., Wissinger, B., Euler, T., Paquet-Durand, F. Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina. J. Vis. Exp. (99), e52588, doi:10.3791/52588 (2015).More

Kulkarni, M., Schubert, T., Baden, T., Wissinger, B., Euler, T., Paquet-Durand, F. Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina. J. Vis. Exp. (99), e52588, doi:10.3791/52588 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter