Protocol
すべてのマウスの実験は医学のLSU学校の制度的動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されたプロトコルに従って行われました。すべての機器は、切開の前にオートクレーブ処理されなければなりません。
マウス乳腫瘍からの一次細胞の作製
- 遺伝的に、以前に6に記載されているように自然に腫瘍を発症マウス乳癌ウイルスポリオーマミドルT抗原（MMTV-PyMTトランスジェニックマウス）を用いて操作したマウスモデルを使用してください。
- イソフルラン（99.9％）でマウスを屠殺し、無菌環境（ 図1A）を確保するために75％エタノールをスプレー。
- はさみで首に尿道口の領域から肌を開きます。臓器（ 図1B）への容易なアクセスを可能にするために、皮膚を突き止めます。
- 乳腺乳房腫瘍を分離し、冷滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）（pH7.4）で（ 図1C）で洗浄しました。
- に腫瘍を転送滅菌10センチメートル組織培養プレートと約1mm 3個に滅菌カミソリの刃やはさみでそれを切ります。その後の工程は、無菌層流フード内で行われるべきです。
- 37℃で2時間、ロッカー上に1mg / mlの最終濃度で、無血清DMEM培地に溶解したコラゲナーゼで細断腫瘍組織をインキュベートします。遠心200×gで3分間、腫瘍組織懸濁液。
注：コラゲナーゼインキュベーションは、組織の酵素的解離のために必須です。 - 上清を捨て、200×gで3分間遠心分離することによってPBS（pH7.4）で沈殿物を3回洗浄します。最終洗浄後、上清をデカント。
- 章動しながら37℃で5分間トリプシンEDTA 2mlで組織を再懸濁します。 200×gで3分間、懸濁液を遠心および洗浄を繰り返します。
- 10センチメートルプレート上に通常の増殖培地（DMEM、10％FBS、2Xペニシリン/ストレプトマイシン）中で組織ペレットを再懸濁します。変更メディア次の3日間毎日。所望の細胞数になるまで培養細胞が得られます。
注：約1×10 7個の細胞は、この手順から単離されます。 MMTV-PyMTと比較した場合、このようなMMTV-ノイのような他のマウス乳腺腫瘍形成モデルは、細胞のより低い収率を与えます。低い収量を生成モデルを使用する場合には、より長く、より大きな腫瘍および培養細胞で始めることが有益です。
2.マウスの肺抽出は肺転移を可視化します
- 肺抽出の前に、肝臓とダイヤフラムを取り外します。肺に影響を与えずにリブを取り除きます。
- はさみの罰金ペアで、頸静脈に近い気管の上部を開きます。
- カテーテルを用いて、肺（ 図2A）を満たすために、気管を介して、このようなZ-修正や墨汁の1ミリリットルのような薬剤を注入します。パラフィンにZ-修正肺を埋め込みます。
- Feketeの溶液に墨汁を注入した肺を脱染色（100ミリリットルの70％アルコールを10％緩衝ホルマリン10mlを、氷酢酸5ml）で5分間。直径≥0.5ミリメートルとセカンダリサイトで腫瘍結節を定義し、転移として結節を決定します。
注：これにより腫瘍による気管支および細気管支閉塞に、腫瘍結節は15％、インドのインクを吸収できず、正常な肺組織は黒になり、腫瘍結節を白色7になります。これは、個々の腫瘍結節（ 図2B）の可視化を可能にします。
マウス胚からマウス胚線維芽細胞（MEFのを）準備3。
- イソフルラン（99.9％）で妊娠マウスを犠牲にし、無菌環境を確保するために75％エタノールを噴霧。
- はさみで首に尿道口の領域から皮膚を開き、子宮から胚を単離します。
- 肌を開くときに、胚を乱さないように注意してください。
- 子宮角を除去し、冷STEでそれらをすすぎますPBS（pH7.4）で波立たせます。
- 非常に慎重にその胎盤から胚を分離し、氷冷PBS（pHは7.4）を含む10センチメートルプレート内の場所の胚。
- 胚から頭部、肝臓や腸を削除し、PBS（pHは7.4）を含む12ウェル組織培養プレートに残りの部分を配置します。
- トリプシンEDTAを含む別の12ウェルプレートに胚体を移し、滅菌カミソリの刃やはさみを使用して小片（〜1ミリメートル3）にカット。 37℃で5分間トリプシンEDTA 5mLで細断物質をインキュベートします。
- チョップ胚に1ミリリットルウシ胎児血清（FBS）を添加することによってトリプシンを不活性化します。遠心分離機10分間200×gでの速度で懸濁液、慎重に、上清を除去し、暖かいDMEM培地1mlでペレットを再懸濁し、20％FBSおよび2Xペニシリン/ストレプトマイシンを含むDMEMの10ミリリットルを（含む10 cmディッシュにすべての内容を転送）。
- 二日間、毎日培地を変更します。文化所望の細胞までの細胞数が達成されます。
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Representative Results
動物を犠牲にするで腫瘍の進行段階は、特定の研究とIACUCガイドラインに依存します。 図1（a）、マウス乳癌ウイルスポリオーマミドルT抗原（MMTV-PyMT）と100日齢のC57BL / 6マウスでは3ヶ月で屠殺しました。皮膚ははさみで首に尿道口の領域から開放し、皮膚は、図1（b）に示すような器官への容易なアクセスを可能にするために釘付けにしました。これは、 図1（c）で得られた腫瘍への容易なアクセスを可能にしました。腫瘍から得られた一次細胞は、図1Dに可視化されます。多くの遺伝子が肺1に乳癌転移を媒介するので、我々は、転移のプロセスを研究するために、肺（ 図2A）で抽出しました。肺は、Z-修正で膨張し、腫瘍結節を視覚化するために墨汁（ 図2B）で染色した。 図3は、マウス胚性fibrを示しています FVB系統マウス胚から単離されたoblasts。
乳腫瘍からの一次細胞の調製図。 （A）ポリオーマミドルT抗原（PyMT）と100日齢の雌マウスを屠殺した。（B）皮膚は乳腺腫瘍への容易なアクセスを可能にするために釘付けにした。（C）乳房腫瘍を動物から切り出しました（D）単離された初代細胞を、10％ウシ胎児血清および抗生物質（100μMスケールバー）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中で培養しました。画像は3日目の細胞を表示するこの図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
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図2マウスの肺抽出は肺転移を可視化します。 （スケールバー：500μM）（A）肺をZ-修正および腫瘍結節を視覚化するために墨汁で染色した（B）で膨張した。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
。マウス胚からのマウス胚繊維芽細胞（MEF）の準備図3. MEF細胞は、FVBマウス胚（スケールバー：100μM）から抽出した。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルは、新鮮なマウス腫瘍からの一次細胞を単離するためのものです。この方法から調製された溶解物は、タンパク質、DNA及びRNA分析のために有用です。原発性乳房腫瘍由来の癌細胞は、多くの場合、脳、肺および骨1に転移します。転移の検出のために肺を抽出する技術が含まれます。 図2Bに見られるようにインクの染みと肺を染色は腫瘍結節の可視化を可能にします。 Z定着液で肺を固定することは、私たちが肺のセクションを作成し、転移性のメカニズムを研究するのに適切な抗体で染色することができます。また、マウス胚線維芽細胞を単離するためのプロトコルも含まれています。これは、同じ動物のタイプの胚線維芽細胞に一次腫瘍細胞の遺伝子発現を比較するために有用です。
初代細胞とMEFのの製造において、最も重要なステップは、材料のミンチです。適切な内訳は、なしLOW細胞数が達成されます。低細胞数が達成されている場合は、プロトコルがまだ続くことができるが、細胞はより長い期間のために培養する必要があります..肺抽出、適切な染色および脱色に腫瘍結節の可視化を可能にするために不可欠です。肺からRNA /タンパク質を抽出するためには、無染色および非固定である肺を使用することが良いでしょう。しかし、RNAは、ウェル8のように、固定組織から抽出することができます。
乳がんの転移段階は、影響を受けた個人2への最大の脅威となっているので、それは、乳房腫瘍形成のすべてのコンポーネントを可視化することが重要です。乳癌の進行のメカニズムを理解する上での主要な課題は、疾患9の進行を再現モデルの利用可能性です。乳癌腫瘍形成および転移の分子機構の解明は、マウス9,10として、動物モデルを使用することによって達成される。覚書を誘導するための最も一般的な方法を電子乳腺腫瘍は、遺伝的に、癌遺伝子または腫瘍抑制の変異を事前に配置する発がん性物質を導入し、高浸潤性癌細胞10〜12を注入すると、マウスを操作しています。得られた腫瘍は、さらなる遺伝子の発現について分析することができます。それは、患者13の臨床転帰を予測するため、乳癌研究のために、遺伝子発現プロファイリングは、重要です。
いくつかの制限は、乳腺腫瘍形成を研究するマウスモデルが存在します。マウスはヒトとの分子および生理学的類似性を共有するが、彼 らは常にヒト疾患5のすべての側面を再現しません。特定の遺伝子操作されたマウスを使用する場合に考慮されるべきです。全体的に、マウスモデルは、組織培養および単離されたヒト腫瘍のような他の本モデルの上にマウス乳腺腫瘍形成を分析するためのより現実的な方法を提供します。まとめると、このプロトコルは、異なる局面のさらなる調査を可能にします乳房腫瘍形成の。
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Disclosures
著者は全く開示がありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | HyClone | SH30243.01 | Store at 4 °C |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life technologies | 25300-062 | Store at – 20 °C |
| Collagenase Type IV | Sigma-Aldrich | C5138 | Store at – 20 °C |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3506 | Store at – 20 °C |
| Pen Strep | Life technologies | 15140-122 | Store at 4 °C |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-106 | Store at – 80 °C |
| Z-fix | ANATECH | #174 | Store at RT |
| India Ink | Yasutomo | Store at RT | |
| AERRANE (Isoflurane) | Baxter | NDC 10019-773-60 | Store at RT |
| Ethanol | EMD | AX0441-3 | Store at RT |
References
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