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Medicine

Trabekelnetzwerk Reaktion auf den Druck in der Elevation Wohnzimmer Menschliches Auge

Published: June 20, 2015 doi: 10.3791/52611
Automatic Translation
1,2, 2, 1, 1,2, 1, 1,2,3, 1,4, 1,2,3
1Department of Ophthalmology, UPMC Eye Center, Eye and Ear Institute, Ophthalmology and Visual Science Research Center, University of Pittsburgh School of Medicine, 2Department of Bioengineering, Swanson School of Engineering, University of Pittsburgh, 3The McGowan Institute for Regenerative Medicine, University of Pittsburgh School of Medicine, 4Deptartment of Biostatistics, Graduate School of Public Health, University of Pittsburgh

Summary

Trabekelwerk (TM) Migration in den Schlemm-Kanal Raum kann durch akute Druckerhöhung durch Ophthalmodynamometer induziert werden, und durch Spektralbereich der optischen Kohärenztomographie beobachtet. Das Ziel dieser Methode ist die morphometrische Reaktion des lebenden Ausflusstrakt akuter Druckerhöhung in lebendem Gewebe in situ zu quantifizieren.

Abstract

Die mechanischen Eigenschaften des Trabekelnetzwerkes (TM) an Ausflusswiderstand und den Augeninnendruck (IOP) Regulierung verbunden. Das Grundprinzip hinter dieser Technik ist die direkte Beobachtung der mechanischen Reaktion des TM akuter IOP Elevation. Vor dem Scannen IOP wird zu Beginn und während des IOP Höhe gemessen. Der Limbus ist von Spectral-Domain-OCT bei Studienbeginn und während der IOP Höhen gescannt (Ophthalmodynamometer (ODM) angewendet bei 30 g Kraft). Abtastungen verarbeitet werden, um die Visualisierung des Wasserabflusses Wegs mit ImageJ verbessern. Vascular Wahrzeichen werden verwendet, um den entsprechenden Stellen in der Grundlinie und IOP Höhenabtastung Mengen zu identifizieren. Schlemmschen Kanal (SC) Querschnittsfläche (SC-CSA) und SC Länge von anterior nach entlang seiner langen Achse posterior werden manuell an 10 Stellen in einem 1 mm Segments SC gemessen. Bedeuten inneren zur äußeren Wandabstand (Länge der kurzen Achse) wird als die Fläche von SC geteilt durch eine Berechnung ihresLänge der langen Achse. Um den Beitrag der benachbarten Geweben zu den Auswirkungen IOP Erhebungen zu untersuchen, werden die Messungen ohne und mit Entspannung der glatten Muskulatur mit Instillation von Tropicamid wiederholt. TM Migration in SC wird von TM Steifigkeit widerstanden, sondern wird durch die Unterstützung ihrer Befestigung an benachbarten glatten Muskelzellen im Ziliarkörper erhöht. Diese Technik ist die erste, die lebende menschliche TM Reaktion auf Druckerhöhung in situ unter physiologischen Bedingungen im menschlichen Auge zu messen.

Introduction

Das Glaukom ist weltweit die zweithäufigste Ursache für irreversible Blindheit 1. Erhöhtem Augeninnendruck (IOP) ist ein Haupt kausalen Risikofaktor für das Vorhandensein und das Fortschreiten von Glaukom 2-7.   IOP durch Gleichgewicht zwischen der Bildung und Abfluss von Kammerwasser 8 geregelt. Die Orte der größten Abflußwiderstandes sind die juxtacanicular Gewebe und die innere Wand des Schlemmschen Kanals (SC), die Schnittstelle zwischen SC und dem Trabekelnetzwerk (TM) 9-11. Während TM Steifigkeit kann zur Verhinderung von SC Zusammenbruch angesichts der IOP Elevations beitragen Overby et al. 12 vor kurzem gezeigt, dass die Genexpression in Glaukom verändert wird, was zu einer erhöhten endothelialen SC Versteifung, behindern die Bildung von Poren, was zu einer Erhöhung in IOP Glaukomaugen 13. TM Morphologie und Steifigkeit korrelieren mit Abfluss Anlage 14,15, betont ter muss seine biomechanischen Eigenschaften zu messen.

Rasterkraftmikroskopie-Messungen des TM zeigen erhöhte Steifigkeit in den Augen von Glaukompatienten (81 kPa) gespendet, verglichen mit den Augen von Spendern ohne Glaukom (4,0 kPa) 16, aber diese Messungen wurden seziert ex vivo Gewebe hergestellt. Die hintere TM ist in die Ziliarmuskel über vordere Sehnen der Längsmuskel-Zellen, die in die Außensteggerichteter und cribiform TM 17 einfügen verankert. Ziliarmuskel (CM) Aktivität kann TM Straffheit zu erhöhen, imitiert erhöhter Steifigkeit TM 17. Die Fähigkeit, Veränderungen in der Widerstandsfähigkeit gegen SC Zusammenbruch durch Störungen der glatten Muskulatur induzierten beobachten konnte im Tiermodell 18 dargestellt. Wir haben die Fähigkeit, nicht-invasiv Bild der Primärkammerwasserabfluss-System in lebenden menschlichen Augen distal zu und einschließlich SC mit spektralen Bereich der optischen Kohärenztomographie (OCT) gezeigt <sup> 19-21. Unter Verwendung dieser Technik haben wir die Fähigkeit, die Reaktion der morphometrischen TM SC akuter IOP Erhebung 22 Quantifizierung demonstriert.

Das Gesamtziel des hierin beschriebenen Verfahrens war es, die morphometrischen Reaktion des lebenden Ausflusstrakt akuter IOP Erhebung im lebenden Gewebe in situ zu quantifizieren. Diese Technik hat den Vorteil, dass die Prüfung des TM unter physiologischen Bedingungen, die Beiträge von sowohl kontraktilen Faseraktivität innerhalb des TM und CM TM Steifigkeit umfasst, verglichen mit veröffentlichten Messungen sezierten Gewebe hergestellt. Das Grundprinzip hinter der Anwendung dieser Technik, um die Beobachtung des mechanischen TM Antwort ist, dass es uns sonst nicht Einsichten in das mechanische Verhalten des TM, die wir jetzt, um direkt zum Abflußwiderstandes und der IOP-Regelung 13 verbunden werden. Um den Beitrag der kontraktilen Gewebe, um die Gesamtsteifigkeit, eine kleine coho erkennenrt der Probanden wurde ohne und mit der Unterdrückung der glatten Muskelaktivität durch Verabreichung Tropicamid sucht.

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Protocol

Ethics Statement: Genehmigung wurde vom Institutional Review Board der University of Pittsburgh School of Medicine erhalten, bevor Thema Rekrutierung begann. Alle Probanden vorgesehen schriftliche Einverständniserklärung vor der Teilnahme an der Studie.

1. Datenerfassung

  1. Druckerhöhung
    1. Nehmen Sie Baseline-Messungen (IOP und Oktober Messungen) durch den einen Rückgang von 0,5% Proparacain in das Auge. 3 min warten auf ihre Wirksamkeit.
    2. Durch leichten Druck auf die zeitliche Lederhaut mit dem Ophthalmodynamometer, 30 g in Kohorte 1 und 5 und 10 g in Kohorte 2. Dann nehmen Sie die gewünschten (IOP und OCT) Messungen wie folgt
      1. IOP-Messungen
        1. Messen Sie Baseline-IOP. Elevate Druck, wie in Abschnitt 1.1 beschrieben.
        2. In Kohorte 1 vermitteln ein Tropfen von 0,5% Proparacain erlauben 3 min für die Wirksamkeit und Anwendung 30 g von Druck auf die Sklera. Während Druck ausgeübt wird, messen IOP mit dem Tonometer folgenden manufaAnweisungen cturer ist.
        3. In Kohorte 2, vermitteln einen Tropfen 0,5% Proparacain, erlauben 3 min zur Wirksamkeit und Anwendung 5 g scleral Druck unter Verwendung eines Ophthalmodynamometer. Messen Sie IOP bei Druckerhöhung mit der tonometer folgenden Anweisungen des Herstellers.
          1. Warten Sie 5 Minuten nach der 5 g Messung.
          2. Gelten 10 g scleral Druck Ophthalmodynamometer, und messen IOP bei Druckerhöhung mit dem Tonometer folgenden Anweisungen des Herstellers. Notieren Sie den IOP und Zustand (dh Basislinie oder 10 g) in der Studie Rekord.
      2. Oktober Scanning
        1. Setzen Sie das Motiv in der OCT-Scanners. Geben Sie demographischen Patientendaten für neue Themen, oder erinnern demografischen Daten aus der Oktober-Datenbank für bereits gescannte Themen.
        2. Wählen Sie das vordere Segment 512 x 128 Scan-Protokoll. Zentrieren Sie das Auge in der Videobildfenster. Verringern Sie den Abstand zwischen dem Scannerund Augenhornhaut, bis die Querschnittsbild in der Scan-Fenster wird angezeigt
        3. Verwendung verbale Befehle positionieren Sie den zeitlichen Limbus in die Mitte des Scanfensters, indem Patienten Blick in die Nasenrichtung
        4. Erwerben Sie die Baseline-Scan, und überprüfen Sie die Scan-Qualität. IF akzeptabel, zu retten, und wenn nicht akzeptabel ist, wiederholen Sie diesen Schritt.
          1. Accept-Scans, wenn es keine blinkt, und der Winkel wird durch das Volumen ohne Abdriften der Kante des Bildes oder Spiegeln an der Spitze sichtbar gemacht.
        5. Vermitteln einen Tropfen 0,5% Proparacain, erlauben 3 min zur Wirksamkeit und wiederholen Sie die Schritte 1.3.2 bis 1.3.5.
        6. Für Kohorte 1, gelten 30 g scleral Druck Ophthalmodynamometer, und erwerben die Scan während Druck ausgeübt wird. Entfernen Sie den Druck und überprüfen Sie die Scan-Qualität. IF akzeptabel, zu retten, und wenn nicht akzeptabel ist, wiederholen Sie diesen Schritt.
        7. Für Kohorte 2 gelten 5 g scleral Druck ophthalmodynamometer, und erwerben die Scan während Druck ausgeübt wird. Entfernen Sie den Druck und überprüfen Sie die Scan-Qualität. IF akzeptabel, zu retten, und wenn nicht akzeptabel ist, wiederholen Sie diesen Schritt.
        8. Warten Sie 5 Minuten damit das Auge von der 5 g Druckstörung zu erholen.
        9. Für Kohorte 2, gelten 10 g scleral Druck Ophthalmodynamometer, und erwerben die Scan während Druck ausgeübt wird. Entfernen Sie den Druck und überprüfen Sie die Scan-Qualität. IF akzeptabel, zu retten, und wenn nicht akzeptabel ist, wiederholen Sie diesen Schritt.
        10. Notieren Sie sich die Scanzeit, Zustand (dh Basislinie oder 10 g) und Lage im Studienbericht.

2. Datenverarbeitung

  1. Schließen Sie ein Hochleistungs-USB-Speichergerät in den Oktober Wählen Sie "Export" aus dem Menü Datensätze auf der Oktober Bestimmen Sie einen Speicherort für die exportierten Dateien auf dem USB-Laufwerk. Deaktivieren Sie die Option ".zip". Geben Sie den Namen des Patienten für scans exportiert werden soll, und wählen Sie die Scans, die exportiert werden. Starten Sie den Export.
  2. Wenn der Export abgeschlossen ist, hängen Sie den USB-Laufwerk und von der OCT zu entfernen. Stecken Sie das mit hoher Kapazität USB-Laufwerk, das die exportierten Bilder in die Bildverarbeitungsarbeitsstation.
  3. Starten Sie das Bildbearbeitungsprogramm in diesem Fall ImageJ.
  4. Importieren Sie die rohen Bilddaten; wählen Sie "Datei -> Importieren -> Raw" aus dem Dateimenü. Wählen Sie die Datei mit in "_cube_raw.img" endet, um vom USB-Laufwerk verarbeitet werden.
  5. Speichern Sie die importierte Datei unter einem neuen Namen, so dass die ursprünglichen Bilddaten unverändert gespeichert (http://www.ori.dhhs.gov/education/products/RIandImages).
  6. Geben Sie die Import-Parameter wie folgt, Bildtyp: 8 bit, Breite: 512, Höhe: 1.024, Offset: 0; Anzahl der Bilder: 128.
  7. Wählen Sie "Plugins -> R egistrierung -> STACKREG" aus dem Menü Plugins. Und wählen Sie dann die "Rigid Body"-Option. Dann wählen Sie "Datei -> Speichern unter -> TIFF", um die ausgerichteten Stapel zu speichern.
  8. Wählen Sie "Process -> Filter -> Mittlere 3D" aus dem Prozess-Menü. Geben Sie die Parameter X = 1, Y = 1 und Z = 1, wie die Filteroptionen. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.
  9. Wählen Sie "Datei -> Speichern unter -> TIFF", um den gemittelten Stack zu speichern. Drehen Sie das Mausrad, um im Bild 1 der aktiven Stapel.
  10. Wählen Sie "Process -> Erweitern Local Contrast (CLAHE)" aus dem Bearbeitungsmenü. Verwenden Sie den Parameter Blockgröße: 31, Histogramm-Bins: 256, maximale Steigung: 5, Maske: keine, und überprüfen Sie die "schnelle" option. Verwenden Sie die Pfeiltaste nach rechts, um zum nächsten Rahmen zu gelangen.
  11. Gehen Sie zu Bild 2 der aktiven Stapel und wiederholen Sie den Process-> Erweitern Local Contrast (CLAHE). Wiederholen, bis alle Frames Kontrast verbessert hatte.
  12. Wählen Sie "Datei -> Speichern unter -> TIFF"; die kontrastverstärkte Stack zu speichern. Dann wählen Sie "Bild -> Anpassen -> Size" aus dem Menü Bild. Deaktivieren Sie die Option "Beschränken Aspect Ratio" und geben Sie dann Breite: 2.048 und Höhe: 1.024 Werte.
  13. Wählen Sie "Bild -> Transform -> Vertikal spiegeln" aus dem Menü Bild. Wählen Sie dann "Analyze -> Set Scale" aus dem Menü Analysieren. Geben Entfernung in Pixel: 2048, bekannten Abstand: 4.000 und Pixel-Seitenverhältnis: 1, und klicken Sie auf OK. Wählen Sie "Datei -> Speichern unter -> TIFF", um die Kalibrierung zu speichern 1: 1 Seitenverhältnis Stack.
  14. Langsam drehen Sie das Mausrad, um visuell zu untersuchen die Scans zu einem unverwechselbaren Schiff Überfahrt als Bezugspunkt innerhalb Scans dienen zu identifizieren. Nehmen Sie das Bild-Nummer und Referenzrahmennummer in der Analyse-Tabelle.
  15. Drücken Sie die linke Pfeiltaste, um das 15-fache der ersten Messung Rahmen zu gehen. Wählen Sie die "Freehand SelectionsR21; Werkzeug aus der Werkzeugleiste.
  16. Platzieren Sie die Maus in der Mitte des SC und drücken Sie den Pfeil nach oben. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis SC füllt den Bildschirm.
  17. Manuell Segment SC durch Einkreisen der Grenze mit der Maus. Halten Sie die Steuerungstaste (Strg), und drücken Sie D für den aktuellen Bildrahmen. Halten Sie die Strg-Taste gedrückt, und drücken Sie M. Transkribieren die Messung der SC Querschnittsfläche und Messrahmennummer der Analyse-Tabelle. Deaktivieren Sie die beschriebenen Bereich. Drücken Sie die rechte Pfeiltaste 3 mal. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis SC hat in 10 Frames gemessen.
  18. Drücken Sie die linke Pfeiltaste, 30-mal, um zum ersten Messrahmen zurück.
  19. Wählen Sie das gerade Segment aus der Werkzeugleiste.
  20. Zeichnen einer geraden Linie von den anterior-posterior-am meisten zu den meisten Orten auf SC. Halten Sie die Strg-Taste und drücken Sie D nur für den aktuellen Rahmen. Halten Sie die Strg-Taste und drücken Sie M. Transcribe SC Länge und Rahmennummer der Analyse-Tabelle. Deaktivieren Sie die beschriebenen Bereich. Drücken Sie die rechte PfeiltasteDreimal. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis SC Länge wurde in den gleichen 10 Frames als SC Querschnittsfläche gemessen.
  21. Einfügen der Gleichung SC-IOWD = SC-CSA / axialen Länge in die Analysetabellen durchschnittlichen SC Innenwand zu Außenwand-Abstand (SC-IOWD) durch Teilen der Flächenmessungen von den Längenmessungen zu berechnen.
  22. Drücken Sie die linke Pfeiltaste, 30-mal, um zum ersten Messrahmen zurück.
  23. Wählen Sie das gerade Segment aus der Werkzeugleiste.
  24. Zeichnen einer geraden Linie von der anterior-SC auf die meisten an der Grenze der Trabekelwerk und Vorderkammer. Sicherzustellen, daß die Linie rechtwinklig zu der Grenze. Halten Sie Strg und drücken Sie D, dann M.
  25. Zeichnen Sie eine Linie von der hinteren äußersten Lage der SC und der Grenze des TM und der vorderen Augenkammer. Stellen Sie sicher, dass die Linie, die senkrecht zur Grenze. Hold Control, und drücken Sie D, dann M.
  26. Zeichnen Sie eine Linie von der Mitte der SC und der Grenze des TM und der vorderen Augenkammer. Stellen Sie sicher, dass die line senkrecht zu der Grenze. Halten Sie die Strg-Taste und drücken Sie D nur für den aktuellen Rahmen.
  27. Transkribieren die drei TM Dickenmessungen und Rahmennummer der Analyse-Tabelle. Drücken Sie hierzu die rechte Pfeiltaste 3 mal. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis TM Dicke wurde in den gleichen 10 Frames als SC Querschnittsfläche gemessen.

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Representative Results

Unter Verwendung dieser Datenerfassung und Bildanalysetechniken, werden die Wirkungen der kleinen und großen Änderungen in IOP auf Ausflusstrakt morphologischer Parameter wie SC Querschnittsfläche erhalten wird (Abbildung 1). Wir sehen, dass ein hohes Maß an IOP Anstieg produzieren eine beobachtbare Zusammenbruch des SC, wie durch eine starke Reduzierung der Querschnittsfläche vertreten. Das Auge scheint in der Lage zu einem geringen Anstieg des IOP zubringen, wie durch das Fehlen einer Änderung in SC-CSA (1) nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Technik in der Lage ist die Quantifizierung der morphometrischen Antwort des Ausflusstrakt zu einer akuten IOP Herausforderung ist. Keine andere Familie von Technologien oder Verfahren bietet sowohl visuelle und quantitative Informationen über Ausflusstrakt Biomechanik.

Im Laufe der Studie wurde keine signifikante Veränderung der TM Dicke beobachtet. In Reaktion auf einen 23 mmHg IOP Zunahme wurde SC inneren zur äußeren Wandabstand von 5,03 & mgr; m reduziert. Whne und mit der Unterdrückung der glatten Muskelaktivität, verursacht ein 6 mmHg Erhöhung der IOP SC innen nach außen Wandabstand von 0,18 & mgr; m und 2,34 & mgr; m bzw. zu verringern. Darüber hinaus sank Grundlinie SC-CSA von 4.597 ± 2.503 & mgr; m 2 bis 3.588 ± 1.198 & mgr; m 2 (Mittelwert ± Standardabweichung) mit glatten Muskelaktivität Unterdrückung. Zusammen mit dem Einsetzen der vorderen Spannglieder aus dem Ziliarmuskel, die in die Außensteggerichteter und cribiform TM 17 einfügen, bedeutet dies, ein Steuersystem zu SC Durchgängigkeit mit der glatten Muskulatur zu erhalten. Weitere Studien sind verdient.

Abbildung 1
Abbildung 1. Schlemm-Kanal-Bereich gegenüber den Augeninnendruck in lebendigen Augen. Schlemm-Kanal (SC) Querschnittsflächen von den beiden Kohorten von Themen zur Verfügung gestellt. Fehlerbalken vorhanden 1 Standardfehler in intraocular Druck (IOP) in der X-Achse und SC Bereich auf der Y-Achse.

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Discussion

Die vorliegende Technik nutzt nicht-invasive Beobachtung der mechanischen Reaktion von Weichgewebe zu SC Zusammenbruch zu quantifizieren. Zukünftige Arbeiten mit menschlichen kadaver Augen ist notwendig, um Gewebeverlagerungen nach der Sektion zu kalibrieren tatsächlichen Gewebesteifigkeit. Aber, werden solche Studien die gleichen Einschränkungen früherer Abfluss Modelle leiden; Insbesondere, dass die Beiträge von lebenden Muskel Gewebespannung nicht vorhanden sein wird. Weitere Kalibrierung in einem lebenden Säugetier-Augenmodell gestatten Kalibrierung der Bildverarbeitung und direkte Messungen der Steifigkeit des TM.

Es gibt mehrere Einschränkungen der Technik. Es hat noch nicht auf anderen Plattformen Oktober gezeigt werden. Die Literatur legt nahe, dass dieselben Strukturen können auf anderen Geräten Oktober visualisiert werden jedoch Empfindlichkeit gegenüber Veränderungen bei akuten IOP Erhebung zugeordnet auf diesen Geräten muss noch in das menschliche Auge nachgewiesen werden. Die vorliegende Gerät wurde aus Bequemlichkeit verwendet, da keine zusätzliche Optikzum vorderen Segment Scannen erforderlich. Die größte Herausforderung für diese Arbeit ist die Identifizierung SC innerhalb der Scans. Es ist unmöglich, auf jeden Fall zu identifizieren SC innerhalb einer einzigen Scheibe. Abfrage des Volumens gewünscht ist, zuerst den Bereich, die Gewebe SC finden. Seine Identität wird dann durch Beobachtung der Sammelkanal Ostia und Verbindung der verschiedenen Segmente des SC, die Scheibe erscheinen, in Scheiben schneiden bestätigt. Nach unserer Erfahrung wird SC zwischen 0 bis 4 Öffnungen innerhalb des Limbus, die in einzelnen großen Öffnungen in der Nähe eines Sammelkanal ostium zusammenführen kann, oder zu reduzieren, um eine Quetschung der vollständige Schließung zu präsentieren.

Die größte Bedeutung dieser Durchbruch Technik ist, dass es keine andere Möglichkeit zur Beurteilung der TM Steifigkeit in situ. Die Morphologie und Steifigkeit des TM korrelieren mit Abfluss Anlage 14,15, Betonung der Notwendigkeit, die biomechanischen Eigenschaften der Abfluss Weg zu messen. In der Zukunft,Solche Messungen können Einblicke in das Management von Glaukom derzeit nicht verfügbar.

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Disclosures

Dr. Schuman erhalten Lizenzgebühren für geistiges Eigentum von Massachusetts Institute of Technology und Massachusetts Eye and Ear Infirmary zu Zeiss, Inc. lizenziert

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Spectral Domain OCT Zeiss Cirrus
Imaging Workstation Apple iMac
Ophthalmodynamometer Baillairt Matalene Ophthalmodynamometer, Surgical instruments CO., Inc. New York, NY
Image Processing Program rsb.info.nih.gov/ij ImageJ, FIJI

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References

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Kagemann, L., Wang, B., Wollstein, G., Ishikawa, H., Mentley, B., Sigal, I., Bilonick, R. A., Schuman, J. S. Trabecular Meshwork Response to Pressure Elevation in the Living Human Eye. J. Vis. Exp. (100), e52611, doi:10.3791/52611 (2015).

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