Introduction
Ratos são dependentes olfato para navegar novos ambientes, encontrar comida, para o reconhecimento de outras pessoas, e comportamento sexual 1-3. É essencial que os investigadores determinar se ou não os animais experimentais têm um sentido de cheiro funcionamento antes de administrar testes comportamentais que envolvem a comida, a interacção social, ou quaisquer odores destinados a induzir uma resposta a partir do ratinho. A anosmia ou a incapacidade de distinguir entre diferentes odores, poderia resultar em falsos positivos ou negativos em uma ampla variedade de paradigmas de comportamento, de modo a capacidade de um rato para detectar e distinguir os odores deve ser estabelecida antes de outros tipos de testes comportamentais são efectuadas.
O teste de habituação / dishabituation olfativo foi descrita pela primeira vez na década de 1980 4. O ensaio foi adaptado para utilização em ratinhos pelos Drs. Mu Yang e Jacqueline Crawley 5. Este é um teste simples e barato, que permite ao investigador ESTABlish que um rato pode detectar e diferenciar entre odores. Além de testar olfacto, este teste permite ao investigador observar o comportamento geral do rato e deve ser feita no início de um regime de testes. Observações qualitativas sobre a locomoção do rato, sinais de ansiedade, nível de atividade, e resposta a odores sociais contra os odores dos alimentos pode sinalizar novas áreas em que os testes poderiam ser realizados.
Neste teste, compressas de algodão embebido em vários odores são apresentados a um mouse três vezes em uma fileira. Com cada apresentação repetida de um odor, o rato vai habituar ao cotonete, gastando menos tempo investigando-o com cada apresentação subsequente. Quando um novo odor é apresentado, dishabituation ocorre, e um mouse típico vai gastar mais tempo a investigar o cotonete, indicando que ele pode discriminar entre os actuais e anteriores odores 5. Este teste é administrado a um rato de cada vez e inclui um 45 min acclimation período seguido de 45 minutos de teste.
Embora este teste é fácil de transportar para fora, pode ser utilizado para investigar perguntas sofisticadas sobre o sistema olfactivo do rato. Outros testes populares de olfacto, tais como o teste de alimentos enterrado, simplesmente determinar a presença ou ausência de anosmia. No entanto, o teste de discriminação e habituação olfactiva permite ao investigador para determinar que um mouse não só tem a capacidade de detectar odores, mas pode discriminar entre diferentes odores. O padrão de habituação e dishabituation foi usado para estabelecer novos mutantes que podem discriminar entre os odores 6,7. Em um estudo surpreendente, Fadool e seus colegas usaram misturas complexas de odores para mostrar que os ratos com supressão segmentadas gene do canal Kv1.3 são "super smellers" que podem discriminar odores muito similares melhor do que ratos normais 8.
Ao examinar um novo modelo de nocaute do mouse é útil Establish na presença de um comportamento normal para tarefas sensoriais básicos. Quando feito no início de um regime de testes, a discriminação odor e teste de habituação dá um investigador a oportunidade de observar quaisquer comportamentos incomuns. Estas observações podem evitar resultados falsos positivos ou negativos em testes posteriores que são atribuíveis ao confundindo características do mutante. Como os investigadores continuam a investigar o comportamento social a necessidade de verificar a função olfativa básico torna-se cada vez mais importante. Além de examinar o olfato em linhas mutantes, este teste pode ser usado para tratar de questões específicas, como se um tratamento farmacológico aumenta especificamente a resposta de um animal a estímulos odor sociais ou se os seus aumentos de resposta a todos os estímulos odor.
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Protocol
Os ratos machos adultos utilizados na experiência seguinte foram gerados e alojado na Universidade de Baylor a uma temperatura ambiente de 22 ° C, com uma luz de 14 h e 10 h escuro (20:00-06:00 h) ciclo diurno. Os ratos tiveram acesso ad libitum a comida e água. Todos os procedimentos para os ratos estavam em conformidade com os Institutos Nacionais de Saúde Diretrizes para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório eo protocolo animal foi aprovado pela Universidade de Baylor Animal Care e do Comitê Use. Os ratinhos foram testados no final da manhã / tarde. Para todos os procedimentos abaixo o pesquisador deve usar luvas para eliminar odores e evitar a contaminação.
1. Preparação de Odores não-sociais
- Prepare odores não sociais frescos cada dia de testes.
Nota: O investigador deve usar luvas para preparar os odores.- Encha três tubos de centrífuga com 10 ml de água cada.
- Pipetar 100 mL de extrato de banana em um 15 ml & #160; tubo cónico e 100 ul de extracto de amêndoa para um segundo tubo de 15 ml de uma diluição de 1: 100.
Nota: O terceiro tubo de 15 ml conterá somente água.
2. Preparação de Odores Sociais
- Prepare odores sociais frescos na manhã de testes irá ocorrer. Obter odores sociais de duas gaiolas que não tenham sido limpos durante pelo menos três dias, e contêm um número igual de ratinhos. Obter odores sociais de ratos do mesmo sexo como o sujeito de teste.
Nota: Estes estão a ser armazenados a temperatura ambiente e deve ser usada dentro de 4-6 horas para manter o odor forte e consistente.- Determine quantas odor sociais cotonetes precisam ser criados: cada rato que está sendo testado será apresentado com três swabs de odor Social 1, e três de odor sociais 2.
- Prepare odores sociais limpando um cotonete de uma forma em zigue-zague através da parte inferior de uma gaiola suja. Sacudir qualquer excesso cama agarrado à ponta.
- Loja swabs em grandes frascos de vidro com tampas ou em copos cobertos com parafilme. Designar um recipiente para um odor sociais e um segundo para o odor sociais 2.
- Manter gaiolas de origem odor fora da sala de ensaio experimental.
3. A aclimatação do mouse Teste
- Calçar luvas e pesar o mouse para ser testado e coloque individualmente em uma gaiola limpa com uma tampa de arame em cima e garrafa de água removida.
- Permitir que o mouse para se aclimatar à nova gaiola por 45 min em uma sala diferente de sala de ensaios. Certifique-se de que não existem odores ou ruídos no quarto.
- Como teste leva cerca de 45 min, escalonar os tempos de aclimatação, colocando a próxima mouse para ser testado em uma gaiola limpa para se aclimatar à direita antes de testar o mouse atual.
4. Preparação da sala de teste
- Coloque compressas de algodão frescos, fita de laboratório, os frascos contendo swabs odor sociais, os tubos de nsobre-sociais odores, uma micropipeta, dois temporizadores, e um frasco de resíduos com uma tampa na sala de testes.
- Certifique-se de que a sala de ensaios é razoavelmente livre de odores, ruídos altos e luz brilhante. Não use perfumes ou loções perfumadas.
Nota: O observador não deve ser mascar chicletes ou balas durante o período de testes e deve tentar limitar a sua exposição a fortes alimentos de odor.
5. Procedimento de Teste
- Traga o mouse aclimatados em sua gaiola na sala de ensaio e colocar a gaiola em cima do balcão, a uma altura que seja confortável para visualização enquanto estiver sentado.
- Apresente cada odor 3 vezes em uma fila para 2 min cada vez. Utilizar a ordem de apresentação que pode ser encontrada na Tabela 1.
- Pipetar 50 ul de odorante no perfume a ser testado para a ponta da mecha de algodão e volte a fechar a fonte de odor. Levante a parte superior da gaiola de arame e insira a extremidade sem cheiro, de madeira do swab na abertura da garrafa de água, empurrandog o comprimento através do lado de baixo do fio para o topo. Evite tocar a ponta de algodão para nada, incluindo dedos, de modo que a contaminação odor é evitado.
- Continue a puxar o cotonete com a abertura da garrafa de água até cerca de 1 polegada do fim algodão trava para baixo na gaiola. Apor o fim da haste de madeira para o lado da gaiola usando fita laboratório.
Nota: Tenha cuidado para não deixar a tampa cair de volta para a jaula, fazendo um ruído alto que iria perturbar o mouse teste. - Começar imediatamente temporização para 2 min. Use um temporizador para cronometrar o 2 min de apresentação. Grave o tempo acumulado gasto cheirando o odor durante 2 min julgamento. Contagem comportamento sniffing do animal usando um cronômetro separado. Sniffing ativo é definido quando o nariz do animal é orientada para a ponta de algodão com seu nariz ~ 2 centímetros ou mais perto da ponta.
- Após a conclusão de cada julgamento, levantar a tampa do fio e retire o cotonete, puxando-a para baixo através da ONUderside da tampa (o que evita a contaminação de odores, impedindo que a ponta de algodão de tocar o fio). Selar o swab usado em uma garrafa de 500 ml de resíduos.
- Preparar e inserir o próximo swab e começar a cronometragem. Permitir que cerca de 1 min entre cada intervalo inter-julgamento. Continue até que cada perfume tem sido apresentado três vezes seguidas, durante 2 minutos de cada vez.
- Uma vez que o rato tenha completado todos os ensaios, esvaziar o frasco de resíduos contendo as cotonetes utilizadas em uma lata de lixo do lado de fora da sala de teste. Devolver o mouse para sua gaiola.
6. Análise
- Analisar os dados para cada grupo por condição odor usando ANOVA two-way seguido por Newman-Keuls ou um teste similar post hoc para determinar habituação significativa (menos tempo farejando sucessivas mesmos cheiros), e dishabitutation (mais tempo farejando um novo cheiro).
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Representative Results
Seguindo o protocolo descrito, os resultados foram registados utilizando dez adultos (dia pós-natal 90-120) ratos machos C57BL / 6J e oito macho estirpe FVB mista-fundo (dia pós-natal 50-70). O teste foi realizado por um único investigador ao longo de vários dias. Cada ponto nos gráficos representa a média de tempo gasto a investigar um odor.
Quando o cotonete embebido em água é introduzido pela primeira vez, os ratos gastar uma grande quantidade de tempo a investigar este romance objeto (Figura 1: primeiros três pontos de dados). Com cada apresentação sucessiva, menos tempo é gasto investigando o cotonete, indicando habituação. Quando um novo odor é introduzido, há um ligeiro aumento no tempo gasto investigar o cotonete, indicando que os ratos podem discriminar entre o novo o odor e o anterior (Figura 1: Os pontos de dados de amêndoa). Mais uma vez, com cada sucessiva apresentação, menos tempo gasto investigar o odor. Os ratos mostram uma significativa decrease em tempo farejando o swab de água sobre a três ensaios F (2,18) = 3,8, p <0,05. Eles apresentam um padrão semelhante quando repetidamente apresentados com o odor amêndoa F (2,18) = 3,6, p <0,05. No terceiro odor eles ainda estão demonstrando habituação, mas por este ensaio os animais estão a atingir um efeito andar (Figura 1: pontos de dados Banana). O efeito chão é quando o comportamento é tão baixa que a capacidade de medir o comportamento mais baixo não é fiável. Eles não mostram uma mudança ao longo dos três ensaios quando se apresenta com o odor de banana F (2,18) = 2,5, p <0,1. No entanto, uma ANOVA de duas vias para todas as nove apresentações de odor mostram um efeito significativo ao longo do tempo F (8,72) = 3,8, p <0,001.
O mesmo padrão de habituação e discriminação pode ser visto com odores sociais como com os odores não-sociais. No entanto, os ratinhos gastam mais tempo a investigar os odores sociais (Figura 2). Há uma diminuição significativa do tempo gasto cheirando tele odores sociais quando todos os 6 ensaios foram combinadas F (2,18) = 6,1, p <0,01. No entanto, houve um efeito marginal sobre o primeiro de três ensaios F (2,18) = 3,0, p = 0,076. Isso sugere que houve alguma habituação, mas não uma quantidade significativa de redução no tempo farejando o primeiro odor social. Houve uma redução significativa na quantidade de tempo que o animal investigado o odor social, F (2,18) = 6,1, p <0,01, durante a segunda apresentação de um odor social.
Repetimos o método em um macho FVB mixed-fundo estirpe. Quando o cotonete embebido em água é introduzido pela primeira vez, os ratos gastar uma grande quantidade de tempo a investigar este romance objeto (Figura 3: primeiros três pontos de dados). Com cada apresentação sucessiva, menos tempo é gasto investigando o cotonete, indicando habituação. Quando um novo odor é introduzido, há um ligeiro aumento no tempo gasto investigar o cotonete, indicando que os ratos podem discriminar entre o novo um odornd a anterior (Figura 3: pontos de dados de amêndoa). Mais uma vez, com cada sucessiva apresentação, menos tempo gasto investigar o odor. Os ratos mostram um decréscimo significativo no tempo aspirando o cotonete de água durante os três ensaios F (2,14) = 13,3, p <0,001. Eles apresentam um padrão semelhante quando repetidamente apresentados com o odor amêndoa F (2, 14) = 12,7, p <0,001. Nesta estirpe ainda havia uma diferença significativa entre os três ensaios. Na terceira odor ainda estão demonstrando habituação (Figura 3: pontos de dados da banana), mas devido ao efeito de chão que não mostram uma alteração ao longo dos três ensaios, quando apresentados com o odor de banana F (2,14) = 3,04, p = 0.08. No entanto, uma ANOVA de duas vias para todas as nove apresentações de odor mostram um efeito significativo ao longo do tempo F (8,56) = 9,6, p <0,001.
O mesmo padrão de habituação ea discriminação não foi visto com odores sociais como com os odores não-sociais. Não houve uma significativadiminuição no tempo gasto cheirando os odores sociais quando todos os 6 ensaios foram combinadas F (5,35) = 0,16, p = 0,97. Os dados sugerem que os ratinhos não se habituem aos repetidos duas apresentações de odores sociais.
Figura 1: Tempo médio gasto a investigar odores não-sociais para machos C57BL / 6J Cada ponto de dados representa o tempo médio do animal passou a investigar o odor não-social particular.. As barras de erro representam o erro padrão da média. Os asteriscos (*) indicam uma diferença significativa quando o grupo está exibindo habituação (p <0,05).
Figura 2:. Tempo médio gasto a investigar odores sociais para machos C57BL / 6J Cada ponto de dados representa o tempo médio dos animais spent investigar o odor social particular. As barras de erro representam o erro padrão da média. Os asteriscos (*) indicam uma diferença significativa quando o grupo está exibindo habituação (p <0,05).
Figura 3: Tempo médio gasto a investigar odores não-sociais para o sexo masculino FVB mixed-fundo estirpe Cada ponto de dados representa o tempo médio do animal passou a investigar o odor não-social particular.. As barras de erro representam o erro padrão da média. Os asteriscos (*) indicam uma diferença significativa quando o grupo está exibindo habituação (p <0,05).
Figura 4: Tempo médio gasto a investigar odores sociais para o sexo masculino FVB mixed-fundo estirpe cada ponto de dados represen.ts meio tempo o animal passou a investigar o odor social particular. As barras de erro representam o erro padrão da média.
| Odor |
| Água |
| Água |
| Água |
| Amêndoa |
| Amêndoa |
| Amêndoa |
| Banana |
| Banana |
| Odor sociais Unfamiliar 1 |
| Odor sociais Unfamiliar 1 |
| Odor sociais Unfamiliar 1 |
| Odor sociais desconhecida 2 |
| Odor sociais desconhecida 2 |
| Odor sociais desconhecida 2 |
Tabela 1
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Discussion
Os resultados apresentados neste artigo são ideais para camundongos. Os ratinhos demonstram uma forte resposta a um odor de novo, em seguida, rapidamente habituar. Um dos passos chave no presente método é a preparação dos odores. O investigador deve tomar muito cuidado para isolar os odores um do outro para evitar a contaminação. Outro aspecto importante é a apresentação do cotonete. O investigador precisa solucionar a melhor localização da ponta de algodão para que o rato pode investigar a ponta, mas não rasga na ponta. Um componente importante do ensaio é a selecção de odores. Apresentamos três odores não-sociais, mas não seria difícil incluir odores adicionais. Uma limitação é a de escolher os odores que são visivelmente diferentes uns dos outros. Pode-se observar um "efeito solo" se odores semelhantes são apresentados sequencialmente. Além disso, os ratinhos podem começar a reduzir a sua resposta quando apresentados com muitos novos odores. Se o investigador pretende incluir umodores ADICIONAIS então ele / ela pode querer incluir dias adicionais de testes. Demora cerca de uma hora, para testar cada ratinho. Além disso, deve-se solucionar a selecção de odores em ratinhos de controlo antes de os incluir como uma condição experimental.
A habituação olfactiva / dishabituation é um teste importante incluir na investigação de comportamento social. O teste de comportamento social de três câmaras é comumente usado para examinar os déficits de comportamento social em camundongos. Este teste inclui uma condição onde o animal experimental investiga um objeto novo e um novo rato que são submetidos a um copo em diferentes extremidades da câmara. O teste também pode incluir uma condição em que uma novela mouse é colocado sob um copo e outro mouse (mouse familiares) é colocado sob o outro copo. O investigador então examina se o rato experimental pode diferenciar entre os dois. Desde o olfato é o principal ratos modalidade sensorial usar para identificar outros ratos 11/9, Olfato prejudicado pudesse prejudicar a sua capacidade nesta tarefa. Olfato prejudicado pode resultar em erros de interpretação dos dados. Por exemplo, o pesquisador pode observar que o rato não passar mais tempo com o romance do mouse em comparação com o mouse familiar. Isso pode parecer demonstrar evidência de déficits sociais ou memória social prejudicada nos camundongos que está sendo testado. No entanto, uma interpretação mais simples pode ser que o animal não consegue detectar correctamente o animal.
O teste de habituação / dishabituation olfativa tem sido útil para esclarecer modelos do rato do autismo. Um modelo de rato usado frequentemente do autismo é o T + tf / J (BTBR) estirpe de ratinhos BTBR. Esta é uma estirpe consanguínea que tem forte validade de face às três características comportamentais nucleares do autismo. No entanto, uma preocupação tem sido se os seus défices de comportamento sociais são devido a um sistema olfativo prejudicada. Yang e colegas investigaram se a estirpe BTBR prejudicou olfacto através da utilização do habitução test / dishabituation 12. Eles usaram três apresentações de água, odor de amêndoas, e odor de banana para os seus odores não-sociais. Eles então usaram um odor sociais preparados a partir de 129 / SvlmJ e B6 do mouse estirpes. A estirpe BTBR exibida habituação e dishabituation para os odores não sociais. Os ratos demonstraram habitação com o primeiro odor social, mas não mostrou dishabituation à segunda odor social. Uma possibilidade é que eles não podem ser capazes de se diferenciar entre diferentes odores sociais. Isso pode prejudicar a sua capacidade em um teste de comportamento social quando dois estímulos sociais são apresentados. Esta é uma consideração importante ao explorar diferentes modelos de ratos com autismo e poderia fornecer novos insights sobre o que é alterada nestes ratos.
Habituação e dishabituation são mecanismos não-associativas básicas de aprendizagem. Estes princípios de aprendizagem têm sido demonstrada em numerosos tipos de organismos complexos e simples 13,14. No entanto, esses mecanismosde aprendizagem têm sido investigados com pouca freqüência no comportamento olfativo mouse, mas este sistema é importante para medir como parte de uma bateria maior de testes comportamentais. Este teste é barato para a instalação e funcionamento, requer apenas um dia de testes, e vários ratos podem ser testados no prazo de um dia. O principal objetivo deste teste é examinar função olfativa. Os resultados do teste pode ajudar a reduzir a má interpretação dos testes de comportamento sociais e outros testes que incluem uma componente odor.
Ao examinar o comportamento do mouse em qualquer tarefa há várias considerações. A estirpe de rato, o sexo dos animais, e hora do dia são todos os factores que devem ser examinadas. Se o investigador utiliza uma estirpe misturada, então pode haver uma menor variabilidade no comportamento investigação de odores. Nós apresentou dados de uma estirpe FVB misto. Eles tiveram um bom desempenho nos testes de odor não-sociais (Figura 3). Embora, eles investigaram o odor social para uma quantidade elevada of tempo, eles não demonstraram habituação a repetidas apresentações de odores sociais (Figura 4). Os ratos podem precisar se submeter a mais testes para demonstrar habituação. Nós fornecemos um método geral que deve ser útil para a maioria das cepas. No entanto, os factores acima referidos devem ser considerados quando se examina o comportamento de qualquer estirpe, pela primeira vez. Ao examinar o desempenho dos animais de controlo o investigador pode ser necessário ajustar os odores seleccionadas, o número de vezes que o odor é apresentada, as condições de iluminação, a hora do dia para o teste, e o sexo do animal. Isto é verdadeiro para qualquer outro comportamento do rato, e deverá ser considerado neste tipo de teste. Nós incluímos odores que estão facilmente disponíveis para compra. Se o investigador está preocupado que eles não estão usando odores puros em seguida, eles podem considerar encomendar a partir de Sigma-Aldrich. Eles têm uma base de dados de mais de 1600 aroma de matérias-primas. Isso permitirá que o investigador usar um odor puro mas o custo pode serproibitivo para alguns laboratórios.
Existem algumas condições de teste o experimentador pode querer considerar. Em muitos testes o animal é aclimatados ao ambiente que vai ser testado em. Neste protocolo, o animal experimental aclimatados em um quarto e testado no outro. Isto fará com que alguns excitação quando se mudou para o novo quarto. Foi realizada o procedimento desta forma porque se todos os ratos são alojados na mesma sala que os ratinhos de teste, em seguida, todos os ratos serão expostos aos novos odores. Existem duas opções que o experimentador pode querer considerar. O primeiro é o que foi descrito acima. O outro é para mover o animal para o quarto para deixá-lo aclimatar para o quarto, em seguida, iniciar o teste. Após a conclusão do teste, então, o próximo animal colocado na sala, depois deixou-se aclimatar. Isto é possível mas quase o dobro do tempo da experiência. A opção que usamos foi para mover o animal de teste para a sala de ensaios apenas durante o experimento. Isto resultaria em ltempo de teste ess. Há um equilíbrio em termos de eficiência de testes e preocupação com a excitação induzida novidade. O experimentador deve determinar qual é o melhor para a sua experiência.
Em que este protocolo, uma pessoa pontuação o comportamento em tempo real, tornou-se cada vez mais popular para estudar o comportamento animal com câmeras para gravar seu comportamento. Existem várias vantagens para a utilização de gravações em vídeo do comportamento animal. Uma delas é que um investigador humano na sala pode influenciar o comportamento do rato. De fato, um estudo descobriu que ter um experimentador masculinos podem influenciar a sensibilidade à dor de ratos sendo testado 15. Outra preocupação é que os resultados são apenas a partir de um investigador. Através do uso de gravações de vídeo múltiplos observadores pode marcar comportamento. Em seguida, pode-se medir o grau de confiabilidade da pontuação é entre os observadores, o que resultará em uma medição mais consistentes. Uma outra vantagem é que a velocidade de quadro de vídeo pode ser reduzido e pode provide uma medição mais precisa do comportamento. O uso de câmaras pode ser facilmente introduzida neste método. A configuração vai depender da configuração do espaço de laboratório. A desvantagem do uso de câmaras é que o tempo de pontuação vai aumentar significativamente. A exigência de dois ou mais observadores para marcar o comportamento vai aumentar o tempo necessário para produzir os resultados. Isto irá aumentar a carga de trabalho para o laboratório e em algumas situações pode ser proibitivo se o rastreio muitas linhas de mata-mata. Outra desvantagem é que mais do que uma câmara podem ser necessários. A câmara irá estar numa posição fixa. Se o rato investiga o odor de uma forma que proíbe o observador para ver o animal, em seguida, o ensaio pode necessitar de ser eliminado. Esta é uma preocupação menor com um indivíduo que pode facilmente ajustar a sua visão do animal ajustando a sua linha de visão. No entanto, o método descrito neste protocolo pode ser facilmente ajustado para incluir gravações de vídeo, sem alteração significativa com o protocolo que describe.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse cage | Allentown | Standard mouse cage | |
| Wire lid | Allentown | BCU Mouse WBL 2500 | |
| Bedding | Harlan | 7090 Sani-Chips | |
| Cotton swabs | VWR | 89031-270 | 6” wooden handle |
| Banana extract | McCormick | ||
| Almond extract | McCormick | ||
| Laboratory tape | VWR | 89098-062 | |
| Stop watch | VWR | 62374-000 | |
| Nitrile gloves | VWR | 82026 | |
| Timing device | VWR | 61161-350 | |
| 15 ml conical tubes | VWR | 89003-294 | |
| 2 L beakers | Pyrex | 1003 | |
| Parafilm | Parafilm | PM-992 | 4” x 250’ |
| 1 L bottle with cap | VWR | 89000-240 |
References
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