Abstract
Systèmes exempts de cellules fournissent une plate-forme flexible pour sonder des réseaux spécifiques de réactions biologiques isolés du partage des ressources complexe (par exemple, l'expression globale des gènes, la division cellulaire) rencontré dans les cellules vivantes. Cependant, de tels systèmes, utilisés dans les réacteurs classiques en vrac macro-échelle, omettent souvent de présenter les comportements dynamiques et efficacité caractéristiques de leurs homologues de vie micro-échelle. Comprendre l'impact de la structure interne de la cellule et l'échelle sur la dynamique de réaction est cruciale pour comprendre les réseaux complexes de gènes. Nous rapportons ici un dispositif microfabriqué qui confine réactions acellulaires des volumes à l'échelle cellulaire tout en permettant la caractérisation flexible du système moléculaire clos. Ce poly multi-couche (diméthylsiloxane) (PDMS) contient dispositif chambres de réaction femtolitre échelle sur une membrane élastomère pouvant être actionné (ouverte et fermée). Lorsqu'il est actionné, les chambres confinent protéine cellulaire sans synthèse (CFPS) réactionsexprimant une protéine fluorescente, ce qui permet la visualisation de la cinétique de réaction au cours du temps en utilisant la microscopie time-lapse fluorescente. Ici, nous montrons comment ce dispositif peut être utilisé pour mesurer la structure de bruit de réactions CFPS d'une manière qui est directement analogue à ceux utilisés pour caractériser des systèmes cellulaires, ce qui permet l'utilisation de techniques bruit de biologie utilisés dans les systèmes cellulaires de caractériser circuits de gènes CFPS et leurs interactions avec l'environnement exempt de cellules.
Introduction
Systèmes exempts de cellules offrent une plate-forme simplifiée et flexible pour la visualisation des réactions biologiques exempt de facteurs de complication tels que le fitness, la division, et la mutation qui sont inévitables dans l'étude des cellules vivantes. Ces approches ont été utilisées pour étudier des systèmes cellulaires, y compris la caractérisation de protéines de la membrane 1, le palpage de deux interactions de protéines, et l'exploration des aspects fondamentaux de la traduction 7.3. Récemment systèmes exempts de cellules ont commencé à se implanter comme plates-formes viables pour la biologie synthétique 8-10. L'appel de ces approches est qu'elles libèrent la biologie synthétique du partage des ressources et «bruit extrinsèque» qui affecte la dynamique des réactions dans les cellules vivantes. Cependant des questions subsistent quant à la façon dont l'environnement physique dans lequel les réactions sans cellules sont intégrées affecte la progression et les résultats de la réaction. Environnements de réaction sans cellules - environnem particulièrement limitéeparents qui se approchent volumes cellulaires pertinents - restent mal caractérisés. protéine cellulaire sans Synthèse (CFPS) est pensée conventionnelle comme étant 'échelle libre,' présentant une cinétique équivalentes à travers une gamme de microlitre à des volumes de réaction litre échelle 11. Néanmoins, il a été démontré réactions de confinement à des volumes de l'échelle cellulaire à affecter de manière significative les taux d'expression de protéines 12.
La nature stochastique de réactions sans cellules - d'autant plus que ceux-ci approche systémique ou même aller au-dessous femtolitre volumes - peuvent être d'une importance particulière. Le bruit dans l'expression des gènes est un établissement fortement influencé par confinement que les volumes de petites cellules et de fortes densités de composants forcer un grand nombre de molécules importantes à des niveaux de population très faibles - par exemple, Escherichia coli limites dans un volume de 1 fl jusqu'à 4300 polypeptides différents sous le contrôle inductible de plusieurs centaines de promoteurs différents 13. Ce bruit inhérent a été impliquée en tant que force d'entraînement central dans de nombreux processus biologiques, y compris la chimiotaxie 14, la décision du VIH entre réplication active et la latence 15, la décision λ de phages entre la lyse et la lysogénie 16,17, et la décision de Bacillus subtillus entre compétence 17 et la sporulation. La biologie synthétique acellulaire fournit alors à la fois l'occasion d'explorer les propriétés stochastiques de circuits et de réseaux de gènes cellulaires, et manipuler ces comportements pour atteindre les objectifs technologiques spécifiques. Bien que le comportement de bruit des systèmes cellulaires a été bien étudié 18-27, il ya eu peu d'exploration du comportement de bruit fondamentale des systèmes sans cellules 8, en particulier à l'échelle cellulaire.
Ici, nous présentons une plate-forme pour l'étude des effets stochastiques dans la biologie synthétique acellulaire. Cette plate-forme contient microfabriquée réaction femtolitre échelle chambers qui peut être rapidement effectué la transition entre ouverte (diffusion libre dans et hors de la chambre) et fermées (réactifs confinés dans la chambre) états. Dans l'état fermé, nous limitons la synthèse des protéines (CFPS) réactifs cellulaires sans exprimant une protéine fluorescente verte (GFP), et de suivre l'expression des gènes en utilisant time-lapse microscopie de fluorescence 28 (Figure 1). Nous caractérisons cette environnement exempt de cellules en mesurant la structure des fluctuations stochastiques de l'expression génique d'une manière directement analogue à ceux utilisés pour caractériser des cellules 25. Les méthodes non-microfabrication pour confiner réactions acellulaires comprennent des vésicules et des liposomes 29-32, émulsions eau-dans-huile, 12 et 33 milieux poreux. Cependant, alors que ces méthodes peuvent fournir un contrôle sur la distribution de la taille des volumes confinés 34, les méthodes de microfabrication créent fonctionnalités très reproductibles avec des dimensions étroitement définis, même à l'échelle nanométrique.En outre, ces structures rigides peuvent être facilement suivis dans le temps sans être sensibles à l'évaporation ou des changements dans l'environnement externe. Conceptions de conteneurs utilisés dans microfabriqués précédente 8,35 de travail ne peut pas sceller rapidement les chambres de réaction suite à l'initiation de la réaction, ce qui complique l'attribution claire de l'époque où la réaction a été lancé (temps zéro). Utilisation de la méthode présentée ici, seulement 4 à 5 min est nécessaire entre le début et la visualisation de la réaction de l'appareil, fournissant ainsi un «temps zéro» bien définie. Les protocoles suivants décrivent les procédés de fabrication et de tester cet appareil, y compris la lithographie optique, l'assemblage de l'appareil, les tests de l'appareil, et les méthodes pour l'analyse d'image.
Protocol
1. lithographie optique de maîtrise de l'appareil
- Déshydrater plaquettes de silicium propres sur une plaque chaude à ~ 250 ° C pendant au moins 1 h.
NOTE: Il est recommandé d'utiliser plus d'une plaquette lors de la préparation d'un maître, en cas d'erreur de l'utilisateur. - Préparer des aliquots de photoresist. Préparer des aliquotes de deux SU-8 2015 photorésist et une dilution de SU-8 2015 photorésist en rapport 2: 1 en utilisant SU-8 diluant comme diluant.
REMARQUE: Environ 1 ml de résine photosensible est nécessaire pour spin-coating une plaquette. - Préparer trois motifs de masque pour produire ces maîtres. Pour la membrane principale, deux masques: préparer une structuration des canaux de membrane et l'autre motif des chambres de réaction. Pour le maître Control Valve, préparer un seul motif de masque.
NOTE: Pour plus de détails sur les techniques lithographiques, y compris les motifs masque, voir Ito et Okazaki, 2000. 36 Voir Fowlkes et Collier, 2013 pour une description plus détaillée de la conception de l'appareil 37. - Préparer le Maître Membrane
- Spin-coat 2: 1 SU-8 2015 résine photosensible dilution sur des plaquettes à 1000 tours par minute pendant 45 secondes.
- Plaquettes de cuisson douce à 95 ° C pendant 2 min. L'utilisation d'un dispositif d'alignement de contact, d'exposer plaquettes avec motif de canal de la membrane pendant 10 sec, et d'effectuer une cuisson post-exposition pendant 2 min à 95 ° C.
- Développer plaquettes dans SU-8 développeur pendant 1 min, ou jusqu'à ce que les résidus de photorésist est enlevé. Rincer plaquette avec de l'isopropanol, se déplaçant de haut en bas. Plaquette à sec avec de l'azote, se déplaçant à nouveau de haut en bas. Plaquettes Cuire au four à 180 ° C pendant 4 min.
- Spin-manteau à motifs plaquettes nouveau avec 2: 1 SU-8 dilution à 2000 tours par minute pendant 45 secondes.
- Cuisson douce modelé plaquettes pendant 2 min à 95 ° C. Par contact d'alignement, alignez plaquettes à motifs avec motif de la chambre de réaction, et d'exposer pendant 10 sec. Effectuer post-exposition cuire pendant 2 min à 95 ° C.
- Développer plaquettes comme décrit à l'étape 1.4.3. Après le développement et séchage des plaquettes, plaquettes Cuire au four à 180 ° C pendant 4 min.
REMARQUE: Les plaquettes peuvent être développés dans le même promoteur qui a été utilisé dans l'étape précédente.
- Préparer le contrôle vanne principale
- Spin-couche non diluée SU-8 sur des plaquettes propres à 2000 tpm pendant 45 sec.
- Doux tranche de cuire au four à 95 ° C pendant 6 min. L'utilisation d'un dispositif d'alignement de contact, d'exposer plaquettes avec motif de soupape de commande pendant 10 sec. Effectuez une cuisson post-exposition à 95 ° C pendant 6 min.
- Développer plaquettes dans SU-8 Developer pendant 2 minutes, ou jusqu'à ce que les résidus soient retirés. Rincez avec de l'isopropanol, se déplaçant de haut en bas. Plaquette à sec avec de l'azote et cuire au four à 180 ° C pendant 4 min.
2. PDMS de fabrication de périphériques
- Silaniser tous les maîtres avec ~ 0,2 ml triméthylchlorosilane par dépôt en phase vapeur.
- Joindre rapidement le maître dans un récipient hermétique à température ambiante avec quelques gouttes de l'agent de silanisation.
NOTE:. Autres protocoles silanisants peuvent être acceptables 38 Si properl effectuéy, le PDMS sera facile à enlever.
- Joindre rapidement le maître dans un récipient hermétique à température ambiante avec quelques gouttes de l'agent de silanisation.
- Mélanger un poly commerciale (diméthylsiloxane) (PDMS) de base et le durcisseur dans des proportions différentes pour les deux couches de membrane de soupape et de contrôle de l'appareil, comme cela a été démontré dans la vanne 39 multicouche semblable dessins. Utilisez 20: 1 et 5: 1 ratios de la base: agent de durcissement pour les moules membrane et la vanne de contrôle, respectivement.
- Pour le moule à membrane, mélanger 10 g de base avec 0,5 g d'agent de durcissement.
NOTE: Ce volume sera spin-enduite sur le maître de la membrane. - Pour le moule de soupape de commande, mélanger la base et l'agent de durcissement dans un rapport de 5: 1. La quantité de PDMS nécessaires pour mouler la vanne de régulation dépend du récipient utilisé pour contenir le maître de soupape de commande; remplir le récipient tels que le capitaine est revêtue d'~ 1 cm de PDMS.
- Pour le moule à membrane, mélanger 10 g de base avec 0,5 g d'agent de durcissement.
- Bien mélanger les deux préparations, PDMS et dégazer les dans une chambre à vide jusqu'à ce qu'aucune bulle d'air sont visibles. Placez le maître de la vanne de commande dans un résistant à la chaleur-récipient, tel qu'un récipient en verre. Versez délicatement Ratio 5: 1 PDMS plus le maître, et dégazer le récipient un deuxième temps.
- Alors que le conteneur contrôle de PDMS de soupape est dégazé, spin-enrober les 20: 1 PDMS sur le maître de la membrane en versant avec précaution le mélange PDMS sur le maître de la membrane pour minimiser la formation de bulles d'air, puis spin-coating le maître à 1000 rpm 45 sec.
- Durcir partiellement les deux maîtres dans un four à 80 ° C pendant 6 min pour le maître de la membrane et 15 min pour le maître de la vanne de commande.
REMARQUE: Lorsque partiellement durci, les PDMS devrait tenir sa forme, mais le matériel sera légèrement collante. Si PDMS ne est pas encore guéri, cuire à nouveau par incréments de quelques minutes à la fois jusqu'à ce que le matériau conserve sa forme lorsqu'il est pressé. - Couper PDMS rectangulaires moules de maître de soupape de commande, le pelage des moules éloigner doucement. Percez des trous d'entrée à travers la pièce moulée en utilisant une perforatrice de 0,75 mm.
REMARQUE: Le trou peut être nettoyé en insérant un Blun de calibre 23aiguille de pointe de t, et l'extérieur du moule peuvent être nettoyées avec du ruban adhésif, si nécessaire. - Utilisation d'un microscope optique à localiser les chambres de réaction sur le maître de la membrane, aligner le composant de moule de soupape de commande avec les caractéristiques de la membrane de la chambre de réaction et placer le composant de soupape de commande directement au-dessus du maître de la membrane. Orientez l'entrée de la vanne de commande dans le coin inférieur gauche de l'appareil, et de veiller à ce que les chambres de réaction et le canal du maître de la membrane sont visibles à l'intérieur de la vanne de commande rectangulaire.
- Faire cuire au four les composants de moule alignées à 80 ° C pendant 2 heures.
REMARQUE: Les membranes et de contrôle des moules de soupape vont maintenant être scellées ensemble, et manipulés comme une moule. - Couper le moule PDMS couches loin de le maître de la membrane, peeling le moule loin de maître très doucement afin de ne pas perforer la membrane.
- Percez entrée et de sortie des trous pour l'entrée de l'extrait de cellule en utilisant une perforatrice de 0,75 mm. Percez des trous à travers les deux couches,et les nettoyer de la même manière que celle décrite dans l'étape 2.6.
- En utilisant un nettoyeur plasma à couplage inductif, régal de plasma à la fois le moule (côté membrane vers le haut) et un verre lamelle n ° 0 à 10,5 W pendant 20 sec. Retirer immédiatement la lamelle et le moule de la nettoyeur à plasma et la couche des composants, côté de la membrane vers le verre, en essayant de réduire les poches d'air entre le verre et le moule. Ne pas appuyer directement sur le canal d'entrée de la membrane, ou la membrane peut se anneler à la vitre, ce qui rend difficile de remplir le canal avec des réactifs.
- Faites attention lorsque vous manipulez les dispositifs assemblés pour éviter de casser la couche de verre. Utilisez minces lamelles de verre que l'appareil doit être imagé par la lamelle de verre à l'aide fort grossissement objectifs huile immersion - si le verre est trop épaisse, les fonctions de l'appareil peuvent ne pas être visible.
- Enfin, guérir les appareils remplis à 80 ° C pendant 2 heures.
3. Installation expérimentale for protéines acellulaire réaction de synthèse
- Hydrater un dispositif en le faisant bouillir dans de l'eau déminéralisée pendant 1 heure.
REMARQUE: périphérique devrait avoir un aspect trouble quand il est complètement hydraté. Dispositif peut également être laissé O / N dans l'eau stérile à température ambiante afin d'hydrater. - En utilisant un microscope inversé avec une chambre d'incubation, régler la température ambiante à 30 ° C.
REMARQUE: Cette température a été choisie pour optimiser l'expression de la GFP avec un promoteur de T7, si les températures optimales pour d'autres réactions 40 peuvent varier. - Monter l'appareil au microscope titulaire de scène avec du ruban adhésif et envelopper bords du dispositif avec du papier absorbant humide pour maintenir l'hydratation locale.
- Utiliser deux transducteurs en boucle fermée de tension de pression de haute précision pour moduler la pression du gaz d'azote pendant l'actionnement de soupape de commande et l'entrée de réactif.
NOTE: Ce protocole a été testé uniquement avec une faible pureté azote, bien que d'autres gaz inertes peuvent être utilisés.- Connectez le premier transducteur parCalibre 24 PTFE tube à un réservoir d'eau contenue dans un flacon en verre de 4 ml muni d'un couvercle de septum. Connectez le réservoir à l'entrée de la vanne de commande en utilisant un second tube terminé par une aiguille de pointe émoussée de calibre 23.
REMARQUE: Les deux tubes pénètrent le septum du réservoir avec deux tranchants 23 aiguilles de calibre. - Branchez le second transducteur par calibre 24 tubes de PTFE connecté à un male male-to-luer-lok connecteur. Attachez ce à une aiguille de calibre 23 Luer-lok relié par un tube avec une autre aiguille pointe émoussée de calibre 23, qui est assemblé individuellement pour chaque appareil. Cette aiguille se connecte au canal de réaction de la membrane; l'utiliser pour vidanger l'eau du canal de réaction et les réactifs d'entrée.
- Connectez le premier transducteur parCalibre 24 PTFE tube à un réservoir d'eau contenue dans un flacon en verre de 4 ml muni d'un couvercle de septum. Connectez le réservoir à l'entrée de la vanne de commande en utilisant un second tube terminé par une aiguille de pointe émoussée de calibre 23.
- En utilisant un système d'expression de protéine sans cellule, assembler les composants pour la réaction de CFPS sur de la glace, selon les instructions du fabricant. Minimisez le temps passé contenir des réactifs de CFPS sur la glace et placez la réaction dans le dispositif immédiatement après assemblage.
REMARQUE: Cet appareil a étéutilisé avec un E. commerciale coli extraire kit d'expression de protéine et un plasmide exprimant de manière constitutive la GFP. Le volume réactionnel total a été réduit à 25 ul - il peut être possible d'utiliser un volume encore plus faible pour les réactifs, si on le souhaite. Comme réactifs CFPS ont tendance à être sensibles aux cycles gel-dégel, il peut être utile de faire des aliquotes des réactifs au volume approprié avant l'expérience. D'autres réactifs peuvent être ajoutés au mélange de réaction, mais la réaction doit être entièrement assemblé avant d'être appliqué au dispositif.- Assemblez la réaction, en ajoutant l'entrée d'ADN dernière.
NOTE: Une fois assemblé dans un tube Eppendorf, la réaction de CFPS commencera sinon tenue sur la glace. Depuis le temps nécessaire pour appliquer les réactifs à l'appareil et commencer l'expérience peut varier, il est utile de commencer une minuterie une fois la réaction est assemblé et mélangé - cela permet de garder le délai entre les expériences cohérentes, et de l'aide au dépannage.
- Assemblez la réaction, en ajoutant l'entrée d'ADN dernière.
- Utilisation de laConnecteur de tube et l'aiguille décrit dans l'étape 3.4.2, retirer la réaction assemblé dans le tube en utilisant une seringue de 1 ml. Insérez l'aiguille de pointe émoussée dans l'entrée de la chambre de réaction. Détachez le connecteur de l'aiguille de la seringue et l'attacher au connecteur mâle-mâle utilisé pour le capteur de la chambre de réaction.
- Appliquer une pression (<10 psi) pour les réactifs CFPS pour remplir le canal. Retirer l'aiguille lorsque la réaction est rempli.
- Insérer le tube émoussée de l'autre transducteur dans l'entrée de la vanne de commande. Ne pas pressuriser encore la vanne de commande.
- Placez le dispositif monté sur la scène. En utilisant l'imagerie en fond clair, localiser les chambres de réaction avec un objectif à immersion 100X.
- Actionner la soupape de commande de mise sous pression par le transducteur de soupape de commande à 20 psi; un changement visible dans la membrane sera évident lorsque la soupape de commande est actionnée. Focus sur les fonds des chambres de réaction.
- Commencez l'acquisition d'image; la croissance de la fluorescence wmal visible à l'intérieur et autour de l'extérieur des chambres de réaction, mais il ne sera probablement pas évidente dans les premiers stades de la réaction. Capturez des images toutes les 1-3 min jusqu'à ce que la réaction atteint une fluorescence d'état stable. Si une étape mettant automatiquement ne est pas disponible, recentrer brièvement chaque image avant de les images prises.
REMARQUE: Alors que certains photoblanchiment se produira, les effets sur la fluorescence relative en raison de photoblanchiment peuvent être comptabilisées pour aussi longtemps que le taux de photoblanchiment est connue. Ce taux de photoblanchiment peut être estimée par l'exposition d'un étalon fluorescent, par exemple une concentration connue de la GFP ou un mélange de fluorophore, de photoblanchiment constante sur une période de temps. - Enregistrer le temps écoulé à partir de l'ensemble de réaction pour la première image acquise.
NOTE: Cela prend généralement 4-5 min.
Analyse 4. Image et traitement de données
- En utilisant un logiciel d'analyse d'image tels que ImageJ, sélectionnez leintérieur des chambres de réaction comme un retour sur investissement. Acquérir la valeur moyenne de la ROI pour toutes les images d'intensité de fluorescence.
NOTE: Ce est la trace d'intensité de fluorescence brute.- Effectuer cette tâche dans ImageJ utilisant les plugins Time Series Analyzer et ROI Manager - Utilisation Time Series Analyzer de choisir des régions d'intérêt autour de l'intérieur de chaque chambre de réaction. Réglez "AutoROIProperties" à une zone qui correspond à l'intérieur de chaque chambre de réaction, cochez la case "Add On Cliquez", et sélectionnez chaque chambre.
NOTE: Cette étape peut également être fait en utilisant l'outil d'ellipse de tirer un retour sur investissement autour de la chambre fluorescent. Cette taille de ROI correspond habituellement à une ellipse de 30 x 30 pixels pour une chambre de 10 um de diamètre vu avec un objectif 100X. - Mettez en surbrillance toutes les régions d'intérêt dans le Gestionnaire de ROI. Utilisez la fonction "Multi Mesure" pour déterminer la moyenne de l'intensité de fluorescence de chaque ROI à travers toute la pile d'images.
REMARQUE: Un plugin nom de StackReg peut être utilisé pour aligner la pile d'images, si nécessaire.
- Effectuer cette tâche dans ImageJ utilisant les plugins Time Series Analyzer et ROI Manager - Utilisation Time Series Analyzer de choisir des régions d'intérêt autour de l'intérieur de chaque chambre de réaction. Réglez "AutoROIProperties" à une zone qui correspond à l'intérieur de chaque chambre de réaction, cochez la case "Add On Cliquez", et sélectionnez chaque chambre.
- Après avoir acquis les traces d'intensité de fluorescence pour tous les premières chambres dans une expérience, déterminer la composante déterministe de la réaction en prenant une moyenne inter-expérimental à travers toutes les traces, et en soustrayant la moyenne de premières traces individuelles. Utiliser un logiciel d'analyse de données telles que IGOR ou MS Excel pour cette analyse.
NOTE: Cette offre bruit retrace pour chaque chambre de réaction. - Analyser le bruit de l'expression des gènes de ces chambres de réaction en utilisant les mêmes méthodes utilisées pour analyser le bruit de l'expression des gènes provenant de cellules 25.
Representative Results
L'avantage de cette plate-forme est microfabriqué à l'application commandée de l'élastomère "soupape de commande" qui est actionné de manière indépendante afin de limiter les réactions CFPS (Figure 2A). Lorsque le dispositif est actionné, les chambres à membrane sont pressées contre la lame de verre pour confiner réactifs fluorescents dans un réseau de chambres de réaction (figure 2C). Afin de vérifier que les chambres limitent de manière fiable la réaction pendant toute la durée de l'expérience, une base FRAP (Fluorescence Recovery après photoblanchiment) test a été effectué 37. Un fluorophore (AF 555) a été appliqué au dispositif, et la soupape de commande a été actionné; en utilisant l'ouverture de l'obturateur du microscope, un seul puits confiner le fluorophore a été isolé et décolorées individuellement (figure 2D). Le bien choisi est devenu sombre et ne pas récupérer la luminosité jusqu'à ce que la vanne de commande a été dépressurisé 20 min60, plus tard, libérant la chambre de la vitre. Ce test vérifie que ces chambres de réaction restent bien fermés pendant la durée de l'expérience.
Dans des conditions optimales, une réaction de CFPS exprimant une protéine facile à visualiser (comme la GFP ou luciférase) exprime la protéine détectable en quelques minutes après avoir été appliqué à ce dispositif. Pendant la durée de la réaction, la synthèse des protéines à l'intérieur et l'extérieur des chambres de réaction est imagée et quantifiée par des unités de mesure de l'intensité de fluorescence à l'intérieur de chaque chambre (Figure 3A). L'intensité de fluorescence, correspondant à la concentration en protéine, peut être mise en correspondance avec le temps de chaque chambre de réaction (figure 3D).
L'expression des gènes est un processus intrinsèquement stochastique qui introduit fluctuations (bruit) à chaque étape moléculaire (synthèse, la dégradation, la protéine de liaison ADN, etc.) 20. Une branche de la biologie se concentre sur le bruitla valeur probante de gène bruit de circuit 41. L'expression dans des systèmes exempts de cellule aura des effets de bruit extrinsèques qui découlent des interactions entre le mécanisme moléculaire d'expression et les surfaces qui définissent les limites des récipients de réaction. Ces effets extrinsèques deviendront probablement plus prononcé que les réactions sans cellules sont confinées en plus petits chambres de réaction. La possibilité d'effectuer imagerie time-lapse de multiples réactions de CFPS confinés permet ensuite l'analyse minutieuse de la structure de bruit (ampleur et la dynamique) dans les systèmes exempts de cellules confinés d'une manière directement analogue à des méthodes qui ont été rapportés pour les systèmes cellulaires 25. Figure 3C et 3D montrent les cours à temps de l'expression de GFP constitutive d'un promoteur T7 dans une microplaque 384 puits standard avec un volume de puits de 15 ul, par rapport au PDMS chambres de réaction 10 um de diamètre, correspondant à des volumes de seulement environ 300 fl, à propos de sept pours de grandeur moins. La variabilité des taux d'expression de protéines dans les 10 um chambres de réaction est beaucoup plus élevé que dans les mesures de plaques à puits, se approchant de celles observées dans les cellules.
Réactions multiplexées effectuées sur le dispositif présentent une cinétique similaire de réactions CFPS effectuées en vrac sur un lecteur de microplaques (figure 3B), où il ya une augmentation rapide de la fluorescence qui plateaux, souvent supposés être causée par la limitation des ressources dans le volume de réaction 42,43 . Ce comportement de croissance déterministe, bien que fluctuant, est généralement uniforme chambres de réaction, et entre les expériences - en faisant la moyenne des traces entre les chambres à travers des expériences, la tendance déterministe peut être soustrait les valeurs de trace, ne laissant que les composantes de bruit de la réaction (figure 4A) . La figure 4B montre le bruit de l'expression de GFP après élimination du composant transitoire déterministe (en haut), Et l'autocorrélation du bruit (en bas), tandis que la figure 4A montre les traces correspondantes dans les 10 chambres de réaction um. La distribution dans les demi-vies des traces d'autocorrélation donne la dépendance de fréquence du bruit de zéro alors que le temps de latence des traces d'autocorrélation donne les amplitudes du bruit, comme la variance.
Figure 1. réactifs synthèse des protéines cellulaires-gratuit sont confinés dans femtolitre chambres de réaction à grande échelle dans le but de mesurer le bruit de l'expression des gènes. Réactifs à partir d'un système d'expression de protéines sans cellule commerciale sont utilisés pour expriment constitutivement GFP intérieur confiné PDMS chambres de réaction. Un tableau de ces chambres peut être visualisée avec time-lapse microscopie à fluorescence pour caractériser l'expression des protéines et le bruit de l'expression des gènes. L'intensité de fluorescence of chaque chambre de réaction dans le temps peut être tracé comme une trace individuelle. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Fabrication de deux couches dispositif microfluidique avec les chambres femtolitre échelle refermable. (A) Mise en page et vue éclatée de couches de dispositif. Le dispositif est composé de deux couches de PDMS et d'une lamelle de verre. La membrane PDMS, scellée entre les couches de verre et de vanne de contrôle, contenant les chambres de réaction. (B) image MEB de la chambre de réaction PDMS. Le diamètre intérieur est de 10 um. (C) Schéma de canaux d'entrée dans l'appareil. protéine cellulaire sans Synthèse (CFPS) réactifs sont transportés à travers le canal de réaction. L'eau est sous pression dans le contrôlevanne pour comprimer les chambres de réaction contre la lame de verre, l'étanchéité des chambres 37. Reproduit de Réf. 37 avec la permission du Royal Society of Chemistry. (D) Récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) test sur un seul puits en utilisant FITC indique chambre est bien scellé contre l'environnement externe. Le fluorophore a été capturé dans les chambres (image supérieure) et un seul puits a été décolorées (image du bas). Aucune récupération de fluorescence a été observée dans la chambre décolorées jusqu'à la vanne de commande a été libéré. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. EGFP expression dans confiné Reaction Cell-gratuit. (A) des images de fluorescence de réaction scellée c HAMBERS à des moments choisis dans la réaction. La production de protéines peut être considérée à la fois à l'intérieur des chambres de réaction et à l'extérieur des chambres dans le canal principal. (B) de l'EGFP a été clone dans un vecteur pET3a, fournissant un promoteur de polymerase de T7 et le terminateur et un site de liaison forte de ribosome (RBS). (C) des mesures de fluorescence normalisée de l'expression constitutive de la EGFP dans une réaction acellulaire vrac effectuée dans un lecteur de microplaques. CFPS réactions produisent habituellement des protéines rapidement avant de ralentir à une fluorescence 'état stable' - ceci est associé à la limitation des ressources 43. Tirets noirs indiquent la trace moyenne. (D) de fluorescence normalisée de traces 51 d'intensité de fluorescence brutes lues à partir de 51 chambres de réaction au cours de plusieurs expériences. Tirets noirs indiquent la trace moyenne sur plusieurs expériences qui illustrent la composante déterministe de l'expression de la protéine./52616/52616fig3large.jpg "Target =" _ blank "> Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Traces individuelles de bruit et le bruit Autocorrelation d'un système cellulaire et cellulaire gratuit. (A) From Austin et al., 2006. bruit dans l'expression de la GFP (en haut) et les fonctions d'auto-corrélation normalisés (en bas) acquis auprès de suivi de la production de la GFP dans les bactéries 25 vivre. Reproduit avec la permission de Macmillan Publishers Ltd: [Nature] 25 (Vol. 439), le droit d'auteur (2006). (B) Le bruit dans l'expression de la GFP (en haut) et les fonctions d'auto-corrélation normalisés (en bas) acquises de la production de la GFP dans le système acellulaire, suivi dans microfluidiques chambres de réaction de l'appareil. Se il vous plaît, cliquez icipour voir une version plus grande de cette figure.
Discussion
L'expression des gènes dans les cellules est intrinsèquement bruyant à cause de petits volumes cellulaires et faible nombre de copies de réactifs importants. Bruit biologie se concentre souvent sur les sources, le traitement, et les conséquences biologiques des fluctuations dans les populations, les concentrations, les positions, ou des états de molécules qui contrôlent les circuits et les réseaux 44 gènes. La grande majorité de ce travail a été effectué dans les systèmes cellulaires, ce qui a l'avantage de voir le bruit d'un circuit de gène dans le contexte naturel des réseaux génétiques dans la cellule. Cependant, les systèmes exempts de cellules permettent la caractérisation des fluctuations intrinsèques d'un circuit de gène individuel sans les effets extrinsèques de confusion 18 qui ne peuvent pas être évités dans les systèmes cellulaires. Analyse du bruit peut donner des indications physiques importantes sur la façon dont sont structurés génétique circuits et comment ils fonctionnent, et a été utilisé dans les systèmes cellulaires pour caractériser négative et positive 25
La caractéristique essentielle de la conception favorable est l'intégration de réseaux de femtolitre-volume (échelle du micron) des chambres de réaction utilisées pour confiner les réactifs d'un système d'expression de protéine sans cellule, avec une «soupape de commande» membrane élastomère dans PDMS qui emprisonne le réactifs à une, "temps zéro" bien définie pour l'initiation de réaction (figure 1). Ce contrôle permet la cinétique des réactions mises en jeu dans la synthèse des protéines à SSdû en temps réel avec une grande précision. En tant que tel, il est important de gérer réactifs exempts de cellules de sorte que la variabilité inter-expérimental est minimisée autant que possible. Ce contrôle permet d'évaluer le bruit de structure de circuits génétiques exempts de cellules d'une manière qui est analogue aux techniques précédemment utilisées pour évaluer l'expression du gène dans des cellules vivantes.
Comme réactifs utilisés dans les systèmes de CFPS peuvent être sensibles à cycles gel-dégel, il est important de garder les réactifs froid et minimiser le temps les réactifs passent décongélation sur de la glace. Il est recommandé de tester périodiquement l'expression du système CFPS en vrac afin d'identifier les changements dans les niveaux d'expression au fil du temps - cela peut être fait dans une réaction de 10 à 15 pi dans un tube Eppendorf, ou dans un appareil comme un lecteur de microplaques , qui effectue plusieurs lectures au fil du temps pour capturer cinétique de réaction. Notant les temps de l'âge et dégel des réactifs pour chaque expérience aidera lors du dépannage faible expression lNIVEAUXATTEINTSPARLEP ASSE. En outre, lors de l'assemblage des réactifs de CFPS, il est important de noter que la réaction commence une fois qu'il est complètement monté et retiré de la glace. Afin de maintenir un "temps zéro" compatibles, il est utile d'enregistrer le temps suivant l'initiation de la réaction de CFPS après l'addition finale de l'entrée de l'ADN, et la réaction d'appliquer le plus rapidement possible pour le dispositif incubé. Ce processus devrait prendre environ 4-5 min, et la fluorescence ne doit pas encore être visible dans les chambres de réaction. Ce contrôle assure que le temps disponible pour visualiser la partie de croissance de la courbe de réaction est maximisée.
Avant d'exécuter des réactions de CFPS sur l'appareil, il est conseillé d'effectuer des tests de contrôle de qualité afin de vérifier l'absence de fuite dans les chambres. Un test peut être effectué FRAP (comme sur la figure 2D) par application d'un fluorophore à l'appareil et l'exposition d'un puits individuel jusqu'à ce que le puits est entièrement blanchie. Si les chambres sontbien scellé, pas de reprise devrait être visible à l'intérieur du puits - il devrait y avoir un contraste frappant entre les parois du compartiment et les espaces intérieurs et extérieurs. Si la récupération de fluorescence ressort ou les parois de la chambre de réaction ne est pas bien définie, la pression sur la vanne de commande doit être augmentée ou le dispositif doit être vérifiée pour les fuites ou la délamination de la lame de verre.
Ce protocole a été testé avec des réactifs de CFPS d'un E. commerciale Kit coli acellulaire expression de la protéine (à l'échelle de 25 ul), bien que d'autres systèmes de CFPS solide peuvent être utilisés. Il est possible d'utiliser des volumes beaucoup plus bas que 25 pi lors de l'application des réactions à l'appareil, ce qui peut être utile lorsque le coût de réactif est un facteur limitant dans les expériences. Une fois que les réactifs sont ajoutés dans le dispositif et les chambres de réaction sont scellées, il ne est pas possible d'ajouter des réactifs à la solution sans actionnement de la soupape de commande - par conséquent ce dispositif ne est pas suitable pour les réactions qui nécessitent l'addition de réactifs au cours de la réaction. Ce dispositif est également pas optimisé pour l'observation des réactions CFPS qui peut exécuter plus de trois heures - les effets de la déshydratation et le séchage de l'appareil après cette période ne ont pas été évalués. Si de plus longues durées de réaction sont souhaités, ces effets peuvent être atténués par le dispositif d'étanchéité pour éviter l'évaporation, à modifier la température d'incubation, ou en utilisant une chambre d'humidité. Les modifications apportées à la conception de l'appareil, telles que les structures nanoporeux dans les parois de la chambre 49,50 ou l'inclusion d'une couche de membrane poreuse, représentent quelques méthodes qui pourraient permettre l'échange de réactifs et donc allonger les délais de réaction.
Compartiments de réaction microfabriqués volume uniforme sont précieux pour le maintien des dimensions cohérentes à l'échelle des expériences et très approprié pour enquête sur "les réactions secondaires" avec les parois du compartiment. Contrairement aux méthodes qui ne utilisent pastechniques n-usinée, ces réactions doivent être évalués en petit nombre, et ne fournissent pas la souplesse dimensionnelle lors des expériences. Cependant, la conception contrôlable pour ces chambres de réaction est très approprié pour la microscopie time-lapse, et peut être un complément d'éclairage à une méthode à haut débit de l'accouchement.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SU-8 2015 | Microchem | SU-8 2000 series | Toxic. Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing. |
| SU-8 Thinner | Microchem | SU-8 2000 series | Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing. |
| SU-8 Developer | Microchem | SU-8 2000 series | Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing. |
| Chlorotrimethylsilane | Sigma Aldrich | 92360 FLUKA | Hazardous. Corrosive to the respiratory tract., Reacts violently with water. |
| Sylgard 184 PDMS | Dow Corning | SYLGARD 184 | |
| 0.75 mm hole-puncher | Ted Pella Inc. | 15072 | Harris Uni-Core |
| 23 gauge needles blunt tip | Component Supply Co. | /NE-231PL-25 | |
| #0 glass coverslip | Ted Pella Inc. | 260366 | Gold Seal |
| Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | |
| Microscope | Nikon Instruments | Eclipse TE 300 | |
| CCD camera | Roper Scientific | CoolSNAP-HQ | |
| Shutter | Shutter Insturment | Lambda SC | |
| Light Source | Nikon | Intensilight C-HGFI | |
| Color Filters | Chroma Technology Corp. | ZET 532/106 excitation, ZT 532rdc dichroic, ET 595/50m emission | |
| 100X oil-immersion objective | Nikon | N.A. 1.4 | |
| Temperature Regulator | Oko Lab | H201-T | |
| Metamorph | Universal Imaging Corp. | Version 7.8.3.0 | |
| Marsh Bellofram transducers | Marsh Bellofram | T2000 | |
| 24 gauge PTFE tubing | Component Supply Co. | /SWTT-24-C | |
| Septum vials | National Scientific | C4015- 17W | |
| Power Supply | Hewlett Packard | 6205B Dual DC Power Supply | |
| Sharp 23 gauge needles | Precision Glide | 305129 | |
| Male-to-male luer lock adapters | Qosina | 20024 | Polycarbonate |
| Stainless Steel Blunt Needle 23 gauge | Component Supply Co. | /NE-232PL-5C | Polypropylene |
| S30 E. coli protein expression system | Promega | L1110 | |
| Pet3a-GFP vector/protein | Novagen | 69418-3 | Assembled in-house. Inserted EGFP gene in Pet3a. |
| Quantum Prep Plasmid Midiprep Kit | Biorad | #732-6120 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Alexa Fluor 555 | Molecular Probes | AF555 | http://www.lifetechnologies.com |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.46r | |
| Plugin: Time Series Analyzer | Balaji J Dept. of Neurobiology, UCLA | Version 3.0 | |
| Plugin: StackReg/TurboReg | Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne Biomedical Imaging Group | Distribution is dated July 7, 2011 | |
| Plugin: ROI Manager Tools | Tiago Ferreira | 12/15/2013 Version |
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