Abstract
Cellefrie systemer giver en fleksibel platform til sondering specifikke netværk af biologiske reaktioner isoleret fra den komplekse ressourcedeling (f.eks global genekspression, celledeling) stødt i levende celler. Sådanne systemer, som anvendes i konventionelle makro-skala bulk-reaktorer, ofte undlader at udstille de dynamiske adfærd og effektivitetsgevinster er karakteristiske for deres levende mikro-skala modstykker. Forståelse af virkningen af interne cellestruktur og skala på reaktionsdynamik er afgørende for at forstå komplekse gen-netværk. Her rapporterer vi en mikrofabrikeret enhed, der begrænser cellefrie reaktioner i cellulære skala mængder samtidig med at fleksibel karakterisering af den medfølgende molekylære system. Denne flerlaget poly (dimethylsiloxan) (PDMS) anordning indeholder femtoliter skala reaktionskamre på en elastomer membran, som kan aktiveres (åben og lukket). Når aktiveret, kamrene begrænse cellefrie proteinsyntese (CFPS) reaktionerekspression af et fluorescerende protein, der giver mulighed for visualisering af reaktionskinetikken over tid med tidsforskudt fluorescensmikroskopi. Her viser vi, hvordan denne anordning kan anvendes til at måle støjen struktur CFPS reaktioner på en måde, der er direkte analog med dem, der anvendes til at karakterisere cellulære systemer, hvorved anvendelsen af støj biologi teknikker, der anvendes i cellulære systemer til at karakterisere CFPS gen kredsløb og deres samspil med den celle-frit miljø.
Introduction
Cellefrie systemer tilbyder en forenklet og fleksibel platform til visning biologiske reaktioner fri komplicerende faktorer som fitness, division, og mutation, som er uundgåelige i studiet af levende celler. Sådanne fremgangsmåder er blevet anvendt til at studere cellulære systemer, herunder karakterisering af membranproteiner 1, tast af proteininteraktioner 2, og udforskning af grundlæggende aspekter af oversættelse 3-7. For nylig cellefrie systemer er begyndt at vinde fodfæste som levedygtige platforme til syntetisk biologi 8-10. Appellen af sådanne metoder er, at de fri syntetisk biologi fra ressourcedeling og "ydre støj ', der påvirker reaktion dynamik i levende celler. Men spørgsmål forbliver, hvordan det fysiske miljø, hvor cellefrie reaktioner er indlejret påvirker progression og resultatet af reaktionen. Cellefrie reaktion miljøer - især begrænset environments der nærmer celle-relevant mængder - forbliver dårligt karakteriseret. Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) er konventionelt opfattes som værende "skala-fri," udviser tilsvarende kinetik tværs af en række mikroliter til liter-skala reaktionsvolumener 11. Begrænsende reaktioner på cellulære skala mængder har vist desto mindre at have stor indflydelse protein ekspressionshastigheder 12.
Den stokastiske natur cellefrie reaktioner - især da disse systemer tilgang eller endda gå under femtoliter mængder - kan være af særlig betydning. Støj i genekspression er en egenskab i høj grad påvirket af indespærring som små celle volumen og høje tætheder af komponenter tvinger mange af de vigtige molekyler til meget lave befolkningstal - f.eks Escherichia coli begrænser inden for en 1 fl volumen så mange som 4.300 forskellige polypeptider under den inducerbare kontrol af flere hundrede forskellige promotorer 13.. Denne iboende støj har været impliceret som en central drivkraft i mange biologiske processer, herunder kemotaksi 14, HIV afgørelse mellem aktiv replikation og latency 15, at beslutningen λ fag mellem lyse og lysogeni 16,17, og beslutningen Bacillus subtillus mellem kompetence og sporedannelse 17. Celle-fri syntetisk biologi giver så både en mulighed for at udforske de stokastiske egenskaber cellulære gen kredsløb og netværk, og manipulere disse adfærdsmønstre til at nå specifikke teknologiske mål. Mens støj adfærd cellulære systemer er blevet godt undersøgt 18-27, har der været meget udforskning af den grundlæggende støj adfærd cellefrie systemer 8, især på det cellulære niveau.
Her præsenterer vi en platform til undersøgelse af stokastiske virkninger i cellefri syntetisk biologi. Denne mikrofabrikeret platform indeholder femtoliter skala reaktion cHambers som kan hurtigt skiftet mellem åbne (fri diffusion ind og ud af kammeret) og lukkede (reaktanter begrænset i kammeret) stater. I den lukkede tilstand, vi begrænser cellefrie Protein Synthesis (CFPS) reaktanter udtrykker et grønt fluorescerende protein (GFP) og følge genekspression ved hjælp af time-lapse fluorescensmikroskopi 28 (figur 1). Vi karakteriserer denne celle-frit miljø ved at måle strukturen af stokastiske udsving i genekspression på en måde direkte analog med dem, der anvendes til at karakterisere celler 25. Ikke-microfabrication metoder til at begrænse cellefrie reaktioner omfatter vesikler og liposomer 29-32, vand-i-olie-emulsioner 12 og porøse medier 33. Men mens disse metoder kan give kontrol over størrelsesfordelingen af indelukkede bind 34, microfabrication metoder skabe meget reproducerbare funktioner med stramt angivne dimensioner, selv på nanoskala.Desuden kan disse stive strukturer let spores over tid uden at være modtagelige for fordampning eller ændringer i det eksterne miljø. Mikrofabrikerede container design, der anvendes i tidligere arbejde 8,35 kan ikke hurtigt forsegle reaktionskamrene følgende reaktionsskema indledningen, komplicerer klart tildeling af det tidspunkt, hvor reaktionen blev initieret (tid nul). Brug af metoden præsenteres her, er der behov for kun 4-5 minutter mellem indledning og visualisering af reaktionen på enheden, hvilket giver en veldefineret "tid nul". Følgende protokoller beskriver metoderne til fremstilling og afprøvning denne enhed, herunder optisk litografi, anordning samling, enhed test og metoder til billedanalyse.
Protocol
1. Optisk Litografi af Device Masters
- Dehydrer rene siliciumskiver på en varm plade ved ~ 250 ° C i mindst 1 time.
BEMÆRK: Det er god praksis at bruge mere end én wafer ved udarbejdelsen af en mester, i tilfælde af brugerfejl. - Forbered fotoresistbelagte portioner. Forbered alikvoter af både SU-8 2015 fotoresist og en fortynding af SU-8 2015 fotoresist i forholdet 2: 1 ved anvendelse af SU-8 tyndere som fortyndingsmiddel.
BEMÆRK: Ca. 1 ml af fotoresist er nødvendig for spin-coating en wafer. - Forbered tre maske mønstre til fremstilling af disse mestre. For Membrane Master, forberede to masker: én mønster membranen kanal og den anden mønster reaktionskamrene. For reguleringsventilen mester, forberede én maske mønster.
BEMÆRK: For yderligere oplysninger om litografiske teknikker, herunder maske mønster, se Ito og Okazaki, 2000. 36 Jf Fowlkes og Collier, 2013 for en mere detaljeret beskrivelse af enheden design 37. - Forbered Membrane Master
- Spin-coat 2: 1 SU-8 2015 fotoresist fortynding på wafers ved 1.000 rpm i 45 sek.
- Bløde bage wafers ved 95 ° C i 2 min. Ved hjælp af en kontakt aligner udsætter vafler med membran kanal mønster for 10 sek, og udføre en post-eksponering bage i 2 minutter ved 95 ° C.
- Develop wafers i SU-8 udvikler for 1 min, eller indtil fotoresist rest fjernes. Skyl wafer med isopropanol, flytter fra top til bund. Tør wafer med nitrogen, igen bevæger sig fra top til bund. Bake wafers ved 180 ° C i 4 min.
- Spin-coat mønstrede skiver igen med 2: 1 SU-8 fortynding ved 2.000 rpm i 45 sek.
- Soft bage mønstrede skiver i 2 minutter ved 95 ° C. Ved hjælp af kontakt aligner, tilslutter mønstrede vafler med reaktionskammeret mønster, og udsætte i 10 sek. Udfør efter eksponering bage i 2 minutter ved 95 ° C.
- Udvikle wafers som beskrevet i trin 1.4.3. Efter udvikling og tørring wafers, bage wafers ved 180 ° C i 4 min.
BEMÆRK: De vafler kan udvikles i samme udvikler, der blev anvendt i det foregående trin.
- Forbered Control Valve Master
- Spin-coat ufortyndet SU-8 fotoresist på ren wafers ved 2.000 rpm i 45 sek.
- Soft bage wafer ved 95 ° C i 6 min. Ved hjælp af en kontakt aligner, udsætte vafler med reguleringsventil mønster i 10 sek. Udfør en post-eksponering bages ved 95 ° C i 6 min.
- Develop wafers i SU-8 Developer i 2 minutter, eller indtil remanensen er fjernet. Skyl med isopropanol, bevæger sig fra top til bund. Tør wafer med nitrogen og bages ved 180 ° C i 4 min.
2. PDMS Device Fabrication
- Silanize alle mestre med ~ 0,2 ml trimethylchlorsilan via dampaflejring.
- Hurtigt vedlægge master i en lufttæt beholder ved stuetemperatur med et par dråber af silanizing agent.
BEMÆRK:. Andre silanizing protokoller kan være acceptable 38 Hvis udført properlY vil PDMS være let at fjerne.
- Hurtigt vedlægge master i en lufttæt beholder ved stuetemperatur med et par dråber af silanizing agent.
- Bland en kommerciel poly (dimethylsiloxan) (PDMS) base og hærder i forskellige forhold for både membran og reguleringsventil lag af enheden, som er blevet påvist i lignende flerlags ventil designs 39. Brug 20: 1 og 5: 1 forhold mellem basen: hærder for membranen og kontrol ventil forme hhv.
- For skimmel membranen, bland 10 g base med 0,5 g hærder.
BEMÆRK: Denne volumen bliver spin-belagt på membranen master. - For styreventilen formen, blandes base og hærder i en 5: 1-forhold. Mængden af PDMS er nødvendige for at forme reguleringsventilen vil afhænge af den beholder, der anvendes til at holde styreventilen Master; fylde beholderen, således at masteren er belagt med ~ 1 cm PDMS.
- For skimmel membranen, bland 10 g base med 0,5 g hærder.
- Bland grundigt begge PDMS præparater og afgasses dem i et vakuumkammer, indtil der ikke er luftbobler er synlige. Placer reguleringsventilen mester i en varmebestandigbeholder, såsom en glasskål. Hæld forsigtigt 5: 1-forhold PDMS over skibsføreren, og afgasses den container en anden gang.
- Mens reguleringsventilen PDMS container bliver afgasset, spin-coate 20: 1 forhold PDMS på membranen mester ved omhyggeligt at hælde PDMS blandingen på membranen mester for at minimere luftboble dannelse, så spin-coating master ved 1.000 rpm 45 sek.
- Delvist helbrede begge mestre i en ovn ved 80 ° C i 6 min for membranen master og 15 min for reguleringsventilen master.
BEMÆRK: Når delvist hærdet, bør PDMS holde sin form, men materialet vil være lidt klistret. Hvis PDMS endnu ikke er hærdet, bage igen i intervaller på et par minutter ad gangen, indtil materialet holder sin form, når der trykkes. - Skær rektangulære PDMS forme fra reguleringsventil mester, skrælning formene let væk. Punch indløb huller gennem den støbte komponent ved hjælp af en 0,75 mm hul punch.
BEMÆRK: Hullet kan rengøres ved at indsætte en 23 gauge blunt spids nål, og formen ydre kan rengøres med cellofantape, hvis det er nødvendigt. - Brug af et optisk mikroskop for at finde reaktionskamrene på membranen master justere styreventilen formkomponent med trækkene af reaktionskammeret membranen og placere styreventilen komponent direkte på toppen af membranen master. Vend reguleringsventilen indløb til det nederste venstre hjørne af enheden, og sikre, at reaktionskamrene og kanal af membranen mester er synlige inde i rektangulære reguleringsventil.
- Bag aligned formkomponenterne ved 80 ° C i 2 timer.
BEMÆRK: membran og reguleringsventil forme vil nu blive forseglet sammen, og manipuleres som en støbeform. - Skær den lagdelte PDMS skimmel væk fra membranen mester, skrælning formen væk fra master meget forsigtigt for ikke at perforere membranen.
- Punch indløb og udløb huller til celleekstrakten input ved hjælp af en 0,75 mm hul punch. Punch huller gennem begge lag,og rense dem på samme måde som beskrevet i trin 2.6.
- Ved hjælp af en induktivt koblet plasma renere, plasma behandler både formen (membran opad) og en nr 0 dækglas på 10,5 W i 20 sekunder. Fjern straks dækglasset og mug fra plasmaet renere og lag komponenterne, membran side mod glasset, forsøger at minimere luftlommer mellem glasset og formen. Tryk ikke direkte på membranen indgangskanal, eller membranen kan anneale til glasset, hvilket gør det vanskeligt at fylde kanalen med reaktanter.
- Vær særlig forsigtig ved håndtering af forsamlede enheder for at undgå at knuse glasset lag. Brug tynde dækglas som enheden skal afbildes gennem dækglas ved hjælp af høj forstørrelse olie-nedsænkning mål - hvis glasset er for tyk, kan enhedens funktioner ikke være synlige.
- Endelig helbrede de udfyldte enheder ved 80 ° C i 2 timer.
3. forsøgsopstilling FOr Cell-free protein syntesereaktionen
- Hydrat en enhed ved kogning i demineraliseret vand i 1 time.
BEMÆRK: Enhed skal have en uklar udseende, når helt hydreret. Enheden kan også efterlades O / N i sterilt vand ved stuetemperatur for at fugte det. - Anvendelse af et omvendt mikroskop med en inkubation kammer, indstille den omgivende temperatur til 30 ° C.
BEMÆRK: Denne temperatur blev valgt for at optimere ekspression af GFP med en T7-promotor, så optimale temperaturer for andre reaktioner kan variere 40. - Mount enhed til mikroskopbordet holder med cellofan tape og wrap kanter enhed med vådt silkepapir for at opretholde den lokale hydrering.
- Brug to høj præcision lukket kredsløb spænding-tryktransducere at modulere nitrogengastryk for reguleringsventil aktivering og reagens input.
BEMÆRK: Denne protokol er kun blevet testet med lav renhed kvælstof, selv om andre inerte gasser kan anvendes.- Tilslut den første transducer ved24-gauge PTFE rør til et vandreservoir holdes i 4 ml hætteglas med en skillevæg låg. Slut reservoir til styreventilen indløb ved hjælp af en anden rør afsluttes med en 23 gauge stump spids nål.
BEMÆRK: Begge rør trænge ind i reservoiret skillevæg med to skarpe 23 gauge nåle. - Tilslut den anden transducer med 24-gauge PTFE slange forbundet til en han-til-han-Luer-Lok stik. Vedhæft dette til en Luer-Lok 23 gauge nål forbundet med slanger med en anden 23 gauge stump spids nål, der er samlet for hver enkelt enhed. Denne nål forbindelse til membranen reaktion kanal; bruge det til at tømme vand fra reaktionen kanal og input reagenser.
- Tilslut den første transducer ved24-gauge PTFE rør til et vandreservoir holdes i 4 ml hætteglas med en skillevæg låg. Slut reservoir til styreventilen indløb ved hjælp af en anden rør afsluttes med en 23 gauge stump spids nål.
- Ved hjælp af en cellefri proteinekspressionssystem, samle komponenter til CFPS reaktion på is, i henhold til producentens anvisninger. Minimere den tid brugt holder CFPS reagenser på is, og reaktionen i indretningen sted umiddelbart efter samling.
BEMÆRK: Denne enhed har væretbruges med en kommerciel E. coli ekstrakt proteinekspression kit og et plasmid konstitutivt udtrykker GFP. Det totale reaktionsvolumen blev skaleret til 25 pi - det kan være muligt at anvende en endnu lavere volumen for reaktanter, hvis det ønskes. Som CFPS reagenser tendens til at være følsomme over for fryse-tø cyklusser, kan det være nyttigt at gøre alikvoter af reagenser på et passende volumen før eksperimentet. Andre reagenser kan tilsættes til reaktionsblandingen, men reaktionen skal helt samlet, før anvendes til enheden.- Saml reaktionen, tilføjer DNA input sidst.
BEMÆRK: Når samlet i et Eppendorf-rør, vil CFPS reaktionen påbegyndes hvis ikke holdt på is. Da den tid, det tager at anvende reagenserne til enheden og begynde eksperimentet kan variere, er det nyttigt at starte en timer, når reaktionen er samlet og blandet - dette vil holde tidsplanen mellem forsøgene konsistente, og hjælp til fejlfinding.
- Saml reaktionen, tilføjer DNA input sidst.
- Brug afslange og nål stik beskrevet i trin 3.4.2, trække den samlede reaktion i røret ved hjælp af en 1 ml sprøjte. Sæt stump spids nål i reaktionskammeret indløbet. Fjern nålen stikket fra sprøjten og fastgør den til den mandlige-til-han stik, der bruges til reaktionskammeret transducer.
- Anvend tryk (<10 psi) til CFPS reaktanterne at fylde kanalen. Fjern kanylen, når reaktionen er fyldt.
- Sæt stumpe rør fra den anden transducer til kontrol ventilindløbet. Du må ikke presse reguleringsventilen endnu.
- Placer monteret enhed på scenen. Ved hjælp brightfield billedbehandling, find reaktionskamrene med en 100X olieimmersionsobjektiv.
- Aktivering styreventilen ved tryk styreventilen transduceren til 20 psi; en synlig ændring i membranen vil være indlysende, når styreventilen aktiveres. Fokus på bundene af reaktionskamrene.
- Begynd erhvervelse billedet; vækst i fluorescens wsyg være synligt i det indre og omkring det ydre af reaktionskamrene, selv om det sandsynligvis ikke vil være indlysende i de tidlige stadier af reaktionen. Capture billeder hver 1-3 min, indtil reaktionen når en steady state fluorescens. Hvis et automatisk fokusering stadium ikke er tilgængelig, kortvarigt koncentrere hvert billede, inden billederne bliver taget.
BEMÆRK: Mens nogle fotoblegning vil forekomme, kan virkningerne på relativ fluorescens på grund af fotoblegning regnskabsmæssigt, så længe hastigheden af fotoblegning er kendt. Dette fotoblegning sats kan estimeres ved at udsætte en fluorescerende standard, såsom en kendt koncentration af GFP eller en fluorofor blanding til konstant fotoblegning over en tidsperiode. - Optag den forløbne tid fra reaktionen forsamling til det første billede er erhvervet.
BEMÆRK: Det tager typisk 4-5 min.
4. billedanalyse og databehandling
- Ved hjælp af en billedanalyse software som ImageJ, skal du vælgeindre af reaktionskamrene som en ROI. Anskaf den gennemsnitlige fluorescensintensitet værdien af ROI for alle billeder.
BEMÆRK: Dette er den rå fluorescensintensitet spor.- Udfør denne opgave i ImageJ hjælp af Time Series Analyzer og ROI udlejer plugins - Brug Time Series Analyzer til at vælge områder af interesse omkring det indre af hver reaktion kammer. Indstil "AutoROIProperties" til et område, der svarer til det indre af hver reaktion kammer, check "Add On Klik på", og vælg hvert kammer.
BEMÆRK: Dette trin kan også gøres ved hjælp af ellipse til at tegne en ROI omkring fluorescerende kammer. Denne størrelse ROI sædvanligvis svarer til en 30 x 30 pixel ellipse for en 10 um diameter kammer ses med en 100X mål. - Fremhæv alle ROI'er i ROI Manager. Brug "Multi Measure" -funktionen til at bestemme fluorescensintensiteten gennemsnit af hver ROI gennem hele billedstak.
BEMÆRK: Et plugin ved navn StackReg kan anvendes til at tilpasse billedstak, hvis det er nødvendigt.
- Udfør denne opgave i ImageJ hjælp af Time Series Analyzer og ROI udlejer plugins - Brug Time Series Analyzer til at vælge områder af interesse omkring det indre af hver reaktion kammer. Indstil "AutoROIProperties" til et område, der svarer til det indre af hver reaktion kammer, check "Add On Klik på", og vælg hvert kammer.
- Efter at erhverve de rå fluorescens intensitet spor for alle kamre i et eksperiment, fastlægge deterministiske del af reaktionen ved at tage en inter-eksperimentel gennemsnit for samtlige spor, og trække gennemsnittet af individuelle rå spor. Brug dataanalyse software som IGOR eller MS Excel for denne analyse.
BEMÆRK: Dette giver støj spor for hver reaktion kammer. - Analyser genekspression støj fra disse reaktionskamrene med de samme metoder, der anvendes til at analysere genekspression støj stammer fra celler 25.
Representative Results
Den tydelige fordel ved denne mikrofabrikeret platformen er i anvendelsen af den styrbare elastomere "reguleringsventil", som er uafhængigt aktiveres med henblik på at begrænse CFPS reaktioner (figur 2A). Når indretningen aktiveres, er membranen kamre presses mod objektglasset at begrænse fluorescerende reagenser i en række reaktionskamre (figur 2C). For at kontrollere, at kamrene pålideligt begrænse reaktionen gennem hele forsøget, var en grundlæggende FRAP (Fluorescence Recovery Efter Fotoblegning) test udført 37. En fluorofor (AF 555) blev anvendt på enheden, og reguleringsventilen blev aktiveret; ved hjælp af udløserknappen åbning af mikroskopet, en enkelt brønd indeslutte fluoroforen blev isoleret og Lysblegede individuelt (figur 2D). Den valgte godt blev mørkt og ikke komme i lysstyrken, indtil reguleringsventilen trykaflastes 20 min60, senere frigiver kammeret fra glasset. Denne test bekræfter, at disse reaktionskamrene forbliver godt forseglet under hele forsøget.
Under optimale betingelser, en CFPS reaktion udtrykker en let visualiseres protein (såsom GFP eller Luciferase) udtrykker påviselige protein inden for et par minutter for at blive anvendt på denne enhed. Over levetid reaktionen proteinsyntese i det indre og ydre af reaktionskamrene afbildes og kvantificeres ved måling af enheder af fluorescensintensitet i hvert kammer (figur 3A). Fluorescensintensitet svarende til proteinkoncentration, kan kortlægges over tid for hver reaktionskammer (figur 3D).
Genekspression er en iboende stokastiske proces, der introducerer udsving (støj) ved hver molekylær trin (syntese, nedbrydning, protein-DNA binding, etc.) 20. En gren af støj biologi fokuserer påbevisværdien af gen kredsløb støj 41. Ekspression i cellefrie systemer vil have ydre støj, der opstår fra vekselvirkninger mellem molekylære maskineri udtryk og overfladerne, der definerer grænserne for de reaktionsbeholdere. Disse ydre effekter vil sandsynligvis blive mere udtalt som cellefrie reaktioner er begrænset i endnu mindre reaktionskamre. Evnen til at udføre time-lapse billeddannelse af flere lukkede CFPS reaktioner derpå muliggør omhyggelig analyse af støj struktur (størrelse og dynamik) i lukkede cellefrie systemer på en måde, direkte analog med metoder, der er blevet rapporteret for cellulære systemer 25. Figur 3C og 3D viser tidsforløbene af konstitutiv GFP-ekspression fra en T7-promotor i en standard 384-brønds mikroplade med et godt volumen på 15 pi i forhold til i PDMS reaktionskamre 10 um i diameter, der svarer til mængden af kun omkring 300 fl ca. syv ordres størrelsesorden mindre. Variabiliteten proteinekspression satser i de 10 um reaktionskamre er meget højere end i de godt plade målinger nærmer dem, der ses i celler.
Multipleksede reaktioner udført på enheden udviser lignende kinetik til CFPS reaktioner udført i bulk på en mikropladelæser (figur 3B), hvor der er en hurtig stigning i fluorescens, som plateauer, ofte antages at være forårsaget af begrænsning ressource i reaktionsvolumenet 42,43 . Denne deterministiske vækstadfærd, selvom svingende, er generelt overensstemmelse mellem alle reaktionskamrene og mellem eksperimenter - som gennemsnittet spor mellem kamrene tværs forsøg må deterministiske trend trækkes fra sporingsværdierne, så kun de støj komponenter i reaktionen (figur 4A) . Figur 4B viser GFP-ekspression støj efter fjernelse af den deterministiske, forbigående komponent (top) Og autokorrelationen af støjen (nederst), mens Figur 4A viser de tilsvarende spor i 10 um reaktionskamre. Fordelingen i halve tidspunkter af autokorrelationen spor giver frekvens afhængighed af støj, mens nul tidsforsinkelse af autokorrelationen spor giver størrelserne af støjen, som variansen.
Figur 1. Cell-Free Protein Synthesis reaktanter er begrænset i femtoliter skala reaktionskamre med henblik på måling af genekspression støj. Reaktanter fra en kommerciel cellefrit proteinekspressionssystem anvendes til konstitutivt udtrykker GFP inde begrænset PDMS reaktionskamre. En række af disse kamre kan visualiseres med tidsforskudt fluorescensmikroskopi for at karakterisere proteinekspression og genekspression støj. Fluorescensintensiteten of hver reaktion kammer over tid kan afbildes som en individuel spor. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 2. Fremstilling af tolags mikrovæskeanordning med forsegles femtoliter målestok kamre. (A) Layout og eksploderet afbildning af enhedens lag. Anordningen består af to PDMS lag og et dækglas. PDMS membran forsegles mellem glas og reguleringsventil lag besidder reaktionskamrene. (B) SEM-billede af PDMS reaktionskammeret. Interiøret diameter er 10 um. (C) Skematisk af input kanaler i enheden. Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) reagenser er strømmet gennem reaktionen kanal. Vand under tryk i kontrolgruppenventil til at komprimere reaktionskamrene mod objektglasset, forsegling kamrene 37. Gengivet fra ref. 37 med tilladelse fra Royal Society of Chemistry. (D) Fluorescens Recovery Efter Fotoblegning (FRAP) test på en enkelt brønd med FITC indikerer kammer er godt forseglet mod eksterne miljø. Fluoroforen blev fanget i kamrene (øverste billede) og en enkelt brønd blev Lysblegede (nederste billede). Ingen fluorescens opsving blev set i Lysblegede kammer indtil reguleringsventilen blev frigivet. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 3. EGFP Expression i lukkede cellefrit Reaction. (A) Fluorescens billeder af forseglede reaktion c Hambers på udvalgte tidspunkter i reaktionen. Protein produktion kan ses både inde reaktionskamrene og uden kamrene i de vigtigste kanal. (B) EGFP blev klonet ind i en pET3a-vektor, der giver en T7-polymerase-promotor og terminator og en stærk ribosombindingssted (RBS). (C) Normaliserede fluorescensmålinger af konstitutiv ekspression af EGFP i en bulk cellefri reaktion udført i en mikropladelæser. CFPS reaktioner normalt producerer protein hurtigt før den aftager til en "steady state" fluorescens - dette er forbundet med ressource begrænsning 43. Sorte streger angiver gennemsnittet spor. (D) Normalized fluorescens af 51 rå fluorescensintensitet spor læst fra 51 reaktionskamre over flere eksperimenter. Sorte streger angiver gennemsnittet spor over flere forsøg, som illustrerer den deterministiske del af proteinekspression./52616/52616fig3large.jpg "Target =" _ blank "> Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 4. Individuelle Noise Traces og støj Autokorrelation af et cellulært og cellefrit system. (A) fra Austin et al., 2006. Støj i GFP-ekspression (øverst) og normaliserede autokorrelationsfunktioner (nederst) erhvervet fra sporing GFP produktion i levende bakterier 25. Gengivet med tilladelse fra Macmillan Publishers Ltd: [Nature] 25 (Vol. 439), ophavsret (2006). (B) Støj i GFP-ekspression (øverst) og normaliserede autokorrelationsfunktioner (nederst) erhvervet fra GFP produktion i celle-fri system spores i mikrofluide enhed reaktionskamre. Klik herfor at se en større udgave af dette tal.
Discussion
Genekspression i celler er i sagens natur støjende grundet små cellulære mængder og lavt antal kopi af vigtige reaktanter. Støj biologi ofte fokuserer på de kilder, forarbejdning og biologiske konsekvenser af udsving i bestandene, koncentrationer, holdninger eller tilstande af molekyler, der styrer gen kredsløb og netværk 44. Langt størstedelen af dette arbejde er udført i cellulære systemer, som har den fordel, at du ser støjen fra et gen kredsløb inden for naturlig sammenhæng med de genetiske netværk i cellen. Dog tillader cellefrie systemer karakteriseringen af de iboende udsving i en enkelt gen kredsløb uden forstyrrende ydre effekter 18, der ikke kan undgås i cellulære systemer. Analyse af støj kan tilbyde vigtige fysiske indsigt i, hvordan genetiske kredsløb er opbygget, og hvordan de fungerer, og har været anvendt i cellulære systemer til at karakterisere negativ 25 og positiv
Nøglen muliggør træk ved udformningen er integrationen af arrays af femtoliter volumen (micron skala) reaktionskamre anvendes til at indeslutte reaktanterne i et cellefrit proteinekspression system med en elastomer "reguleringsventil" membran i PDMS, der fælder reaktanter ved en veldefineret, "tid nul" for reaktion initiering (figur 1). Denne kontrol tillader kinetik er involveret i proteinsyntese reaktioner skal Follskyldte i realtid med høj præcision. Som sådan er det vigtigt at styre cellefrie reaktanter således at inter-eksperimentel variabilitet minimeres så meget som muligt. Denne styring tillader os at vurdere støj struktur cellefrie genetiske kredsløb på en måde, der er analog med teknikker tidligere er anvendt til at vurdere genekspression i levende celler.
Som reaktanter anvendes i CFPS systemer kan være følsomme over for fryse-tø-cykler, er det vigtigt at holde reaktanterne koldt og minimere den tid reaktanterne bruger på optøning på is. Det er god praksis til periodisk at teste ekspressionen af CFPS systemet i bulk for at identificere ændringer i ekspressionsniveauer over tid - dette kan gøres i en 10-15 pi reaktion i et Eppendorf-rør eller i en enhed som en mikropladelæser , der udfører multiple læser over tid til at fange reaktionskinetik. Noterer sig de alder og tø tidspunkter af reaktanterne til hver eksperiment vil hjælpe ved fejlfinding lav ekspression levels. Endvidere, når montage CFPS reagenser, er det vigtigt at bemærke, at reaktionen vil begynde, når det er fuldt samlet og fjernes fra isen. For at opretholde en konsistent "tid nul", er det nyttigt at registrere den tid, efter indledningen af CFPS reaktion efter den endelige tilsætning af DNA input og anvende reaktionen så hurtigt som muligt til den inkuberede enhed. Denne proces skal tage ca. 4-5 min, og fluorescens bør endnu ikke være synlig i reaktionskamrene. Denne styring sikrer, at den tid til rådighed til at visualisere væksten del af reaktionskurven maksimeres.
Før du kører CFPS reaktioner på enheden, er det tilrådeligt at køre kvalitetskontrol test for at kontrollere at der ikke er nogen lækage fra kamrene. En FRAP test kan udføres (som i figur 2D) ved at anvende en fluorofor til enheden og udsætte en individuel brønd, indtil brønden er fuldstændigt bleget. Hvis kamre ergodt forseglet, ingen tilbagebetaling skal være synlig inden for godt - der bør være en stærk kontrast mellem væggene i rummet, og de indvendige og udvendige rum. Hvis fluorescens opsving fremgår eller væggene i reaktionskammeret er ikke veldefineret, bør presset på reguleringsventilen øges eller enheden skal kontrolleres for lækage eller delaminering fra objektglasset.
Denne protokol er blevet testet med CFPS reagenser fra et kommercielt E. coli cellefri proteinekspression kit (skaleret til 25 pi), selv om andre robust CFPS systemer kan anvendes. Det er muligt at anvende mængder er meget lavere end 25 pi ved anvendelse reaktioner på anordningen, der kan være nyttige, når reagens omkostninger er en begrænsende faktor i eksperimenter. Når reaktanterne tilsættes til anordningen og reaktionskamrene er forseglet, er det ikke muligt at tilføje reaktanter til opløsningen uden de-aktivering af styreventilen - således dette apparat ikke Velegnle for reaktioner, som kræver tilsætning af reagenser under reaktionen. Denne enhed er også ikke optimeret til at observere CFPS bivirkninger, der kan køre længere end 3 timer - virkningerne af dehydrering og tørring af enheden efter denne periode er ikke blevet evalueret. Hvis der ønskes længere reaktionstider, kan disse virkninger afbødes ved forsegling af enheden for at undgå fordampning, ændrer den inkubationstemperatur, eller ved hjælp af et fugtighedskammer. Ændringer på apparatet design, såsom nanoporøse strukturer i kammervæggene 49,50 eller indføjelse af en porøs membran lag, udgør et par metoder, der kan gøre det muligt reagens udveksling og dermed forlænge reaktion tidshorisonter.
Mikrofabrikerede reaktionsbetingelser rum i ensartet volumen er værdifulde for at opretholde ensartede dimensioner på tværs af eksperimenter og særdeles velegnet til undersøgelse "sidereaktioner" med rumvæggene. I modsætning til fremgangsmåder, der anvender ikken-mikrofabrikerede teknikker, disse reaktioner skal evalueres i mindre mængder, og ikke giver dimensional fleksibilitet ved forsøg. Men den styrbare design for disse reaktionskamrene er særdeles velegnet til time-lapse mikroskopi, og kan være en lysende supplement til en high-throughput metode til fødslen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SU-8 2015 | Microchem | SU-8 2000 series | Toxic. Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing. |
| SU-8 Thinner | Microchem | SU-8 2000 series | Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing. |
| SU-8 Developer | Microchem | SU-8 2000 series | Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing. |
| Chlorotrimethylsilane | Sigma Aldrich | 92360 FLUKA | Hazardous. Corrosive to the respiratory tract., Reacts violently with water. |
| Sylgard 184 PDMS | Dow Corning | SYLGARD 184 | |
| 0.75 mm hole-puncher | Ted Pella Inc. | 15072 | Harris Uni-Core |
| 23 gauge needles blunt tip | Component Supply Co. | /NE-231PL-25 | |
| #0 glass coverslip | Ted Pella Inc. | 260366 | Gold Seal |
| Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | |
| Microscope | Nikon Instruments | Eclipse TE 300 | |
| CCD camera | Roper Scientific | CoolSNAP-HQ | |
| Shutter | Shutter Insturment | Lambda SC | |
| Light Source | Nikon | Intensilight C-HGFI | |
| Color Filters | Chroma Technology Corp. | ZET 532/106 excitation, ZT 532rdc dichroic, ET 595/50m emission | |
| 100X oil-immersion objective | Nikon | N.A. 1.4 | |
| Temperature Regulator | Oko Lab | H201-T | |
| Metamorph | Universal Imaging Corp. | Version 7.8.3.0 | |
| Marsh Bellofram transducers | Marsh Bellofram | T2000 | |
| 24 gauge PTFE tubing | Component Supply Co. | /SWTT-24-C | |
| Septum vials | National Scientific | C4015- 17W | |
| Power Supply | Hewlett Packard | 6205B Dual DC Power Supply | |
| Sharp 23 gauge needles | Precision Glide | 305129 | |
| Male-to-male luer lock adapters | Qosina | 20024 | Polycarbonate |
| Stainless Steel Blunt Needle 23 gauge | Component Supply Co. | /NE-232PL-5C | Polypropylene |
| S30 E. coli protein expression system | Promega | L1110 | |
| Pet3a-GFP vector/protein | Novagen | 69418-3 | Assembled in-house. Inserted EGFP gene in Pet3a. |
| Quantum Prep Plasmid Midiprep Kit | Biorad | #732-6120 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Alexa Fluor 555 | Molecular Probes | AF555 | http://www.lifetechnologies.com |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.46r | |
| Plugin: Time Series Analyzer | Balaji J Dept. of Neurobiology, UCLA | Version 3.0 | |
| Plugin: StackReg/TurboReg | Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne Biomedical Imaging Group | Distribution is dated July 7, 2011 | |
| Plugin: ROI Manager Tools | Tiago Ferreira | 12/15/2013 Version |
References
- Klammt, C., et al. High level cell-free expression and specific labeling of integral membrane proteins. European Journal of Biochemistry. 271, 568-580 (2004).
- Wong, R. W., Blobel, G. Cohesin subunit SMC1 associates with mitotic microtubules at the spindle pole. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 15441-15445 (2008).
- Niederholtmeyer, H., Stepanova, V., Maerkl, S. J. Implementation of cell-free biological networks at steady state. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, 15985-15990 (2013).
- Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. Genome replication, synthesis, and assembly of the bacteriophage T7 in a single cell-free reaction. ACS synthetic biology. 1, 408-413 (2012).
- Algire, M. A., et al. Development and characterization of a reconstituted yeast translation initiation system. RNA. 8, 382-397 (2002).
- Iizuka, N., Najita, L., Franzusoff, A., Sarnow, P. Cap-dependent and cap-independent translation by internal initiation of mRNAs in cell extracts prepared from Saccharomyces cerevisiae. Molecular and cellular biology. 14, 7322-7330 (1994).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of visualized experiments: JoVE. (79), e50762 (2013).
- Karig, D. K., Jung, S. -Y., Srijanto, B., Collier, C. P., Simpson, M. L. Probing cell-free gene expression noise in femtoliter volumes. ACS synthetic biology. 2, 497-505 (2013).
- Shin, J., Noireaux, V. An E. coli cell-free expression toolbox: application to synthetic gene circuits and artificial cells. ACS synthetic biology. 1, 29-41 (2012).
- Karzbrun, E., Tayar, A. M., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. Programmable on-chip DNA compartments as artificial cells. Science. 345, 829-832 (2014).
- Zawada, J. F., et al. Microscale to manufacturing scale-up of cell-free cytokine production - a new approach for shortening protein production development timelines. Biotechnology and bioengineering. 108, 1570-1578 (2011).
- Kato, A., Yanagisawa, M., Sato, Y. T., Fujiwara, K., Yoshikawa, K. Cell-Sized confinement in microspheres accelerates the reaction of gene expression. Scientific reports. 2, 283 (2012).
- Simpson, M. L., Sayler, G. S., Fleming, J. T., Applegate, B. Whole-cell biocomputing. Trends in biotechnology. 19, 317-323 (2001).
- Korobkova, E., Emonet, T., Vilar, J. M., Shimizu, T. S., Cluzel, P. From molecular noise to behavioural variability in a single bacterium. Nature. 428, 574-578 (2004).
- Weinberger, L. S., Burnett, J. C., Toettcher, J. E., Arkin, A. P., Schaffer, D. V. Stochastic gene expression in a lentiviral positive-feedback loop: HIV-1 Tat fluctuations drive phenotypic diversity. Cell. 122, 169-182 (2005).
- Arkin, A., Ross, J., McAdams, H. H. Stochastic kinetic analysis of developmental pathway bifurcation in phage λ-infected Escherichia coli cells. Genetics. 149, 1633-1648 (1998).
- Kulkarni, R. P., Dworkin, J., Garcia-Ojalvo, J., Elowitz, M. B. Tunability and noise dependence in differentiation dynamics. Science. 315, 1716-1719 (2007).
- Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. Stochastic gene expression in a single cell. Science. 297, 1183-1186 (2002).
- McAdams, H. H., Arkin, A. Stochastic mechanisms in gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 814-819 (1997).
- Elston, T. C., Blake, W. J., Collins, J. J. Stochasticity in gene expression: from theories to phenotypes. Nature Reviews Genetics. 6, 451-464 (2005).
- Blake, W. J., Kærn, M., Cantor, C. R., Collins, J. J. Noise in eukaryotic gene expression. Nature. 422, 633-637 (2003).
- Rao, C. V., Wolf, D. M., Arkin, A. P. Control, exploitation and tolerance of intracellular noise. Nature. 420, 231-237 (2002).
- Raj, A., van Oudenaarden, A. Nature, nurture, or chance: stochastic gene expression and its consequences. Cell. 135, 216-226 (2008).
- Pedraza, J. M., van Oudenaarden, A. Noise propagation in gene networks. Science. 307, 1965-1969 (2005).
- Austin, D., et al. Gene network shaping of inherent noise spectra. Nature. 439, 608-611 (2006).
- Simpson, M. L., Cox, C. D., Sayler, G. S. Frequency domain analysis of noise in autoregulated gene circuits. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 4551-4556 (2003).
- Weinberger, L. S., Dar, R. D., Simpson, M. L. Transient-mediated fate determination in a transcriptional circuit of HIV. Nature genetics. 40, 466-470 (2008).
- Locke, J. C., Elowitz, M. B. Using movies to analyse gene circuit dynamics in single cells. Nature Reviews Microbiology. 7, 383-392 (2009).
- Nourian, Z., Danelon, C. Linking genotype and phenotype in protein synthesizing liposomes with external supply of resources. ACS synthetic biology. 2, 186-193 (2013).
- Pereira de Souza, T., Stano, P., Luisi, P. L. The minimal size of liposome-based model cells brings about a remarkably enhanced entrapment and protein synthesis. ChemBioChem. 10, 1056-1063 (2009).
- Nomura, S. iM., et al. Gene expression within cell-sized lipid vesicles. ChemBioChem. 4, 1172-1175 (2003).
- Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proceedings of the national academy of sciences of the United States of America. 101, 17669-17674 (2004).
- Park, N., Um, S. H., Funabashi, H., Xu, J., Luo, D. A cell-free protein-producing gel. Nature. 8, 432-437 (2009).
- Swaay, D., deMello, A. Microfluidic methods for forming liposomes. Lab on a Chip. 13, 752-767 (2013).
- Okano, T., Matsuura, T., Kazuta, Y., Suzuki, H., Yomo, T. Cell-free protein synthesis from a single copy of DNA in a glass microchamber. Lab on a Chip. 12, 2704-2711 (2012).
- Ito, T., Okazaki, S. Pushing the limits of lithography. Nature. 406, 1027-1031 (2000).
- Fowlkes, J. D., Collier, C. P. Single-molecule mobility in confined and crowded femtolitre chambers. Lab on a Chip. 13, 877-885 (2013).
- Herold, K. E., Rasooly, A. Lab on a Chip Technology: Biomolecular separation and analysis. 2, Horizon Scientific Press. (2009).
- Unger, M. A., Chou, H. -P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288, 113-116 (2000).
- Karig, D. K., Iyer, S., Simpson, M. L., Doktycz, M. J. Expression optimization and synthetic gene networks in cell-free systems. Nucleic acids research. 40, 3763-3774 (2012).
- Cox, C. D., McCollum, J. M., Allen, M. S., Dar, R. D., Simpson, M. L. Using noise to probe and characterize gene circuits. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 10809-10814 (2008).
- Siegal-Gaskins, D., Noireaux, V., Murray, R. M. American Control Conference (ACC), 2013. , 1531-1536 (2013).
- Jewett, M. C., Swartz, J. R. Substrate replenishment extends protein synthesis with an in vitro translation system designed to mimic the cytoplasm). Biotechnology and bioengineering. 87, 465-471 (2004).
- Simpson, M. L., et al. Noise in biological circuits. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 1, 214-225 (2009).
- Dar, R. D., et al. Transcriptional burst frequency and burst size are equally modulated across the human genome. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 17454-17459 (2012).
- So, L. -h, et al. General properties of transcriptional time series in Escherichia coli. Nature genetics. 43, 554-560 (2011).
- Tan, C., Saurabh, S., Bruchez, M. P., Schwartz, R., LeDuc, P. Molecular crowding shapes gene expression in synthetic cellular nanosystems. Nat Nano. 8, 602-608 (2013).
- Sokolova, E., et al. Enhanced transcription rates in membrane-free protocells formed by coacervation of cell lysate. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, 11692-11697 (2013).
- Retterer, S. T., Siuti, P., Choi, C. -K., Thomas, D. K., Doktycz, M. J. Development and fabrication of nanoporous silicon-based bioreactors within a microfluidic chip. Lab on a Chip. 10, 1174-1181 (2010).
- Siuti, P., Retterer, S. T., Doktycz, M. J. Continuous protein production in nanoporous, picolitre volume containers. Lab Chip. 11, 3523-3529 (2011).
