Abstract
Cellfria system ger en flexibel plattform för att sondera särskilda nätverk av biologiska reaktioner som isolerats från komplexet resursdelning (t.ex. globalt genuttryck, celldelning) påträffas i levande celler. Men sådana system, som används i konventionella makroskala bulk reaktorer, ofta misslyckas med att ställa ut de dynamiska beteenden och effektivitetsvinster som är karakteristiska för sina levande mikroskala motsvarigheter. Förstå effekterna av interna cellstruktur och skalan på reaktionsdynamik är avgörande för att förstå komplexa gennätverk. Här rapporterar vi en mikro enhet som begränsar cellfria reaktioner i cellulära skala volymer samtidigt flexibel karakterisering av den bifogade molekylära systemet. Denna flerskiktade poly (dimetylsiloxan) (PDMS) enheten innehåller femtoliter skala reaktionskamrar på en elastomermembran som kan påverkas (öppen och sluten). Vid påverkan kamrarna begränsa cellfri proteinsyntes (CFPS) reaktioneruttrycker ett fluorescerande protein, vilket möjliggör visualisering av reaktionskinetik över tid med hjälp av tidsförlopp fluorescensmikroskopi. Här kan vi visa hur denna anordning kan användas för att mäta brusstruktur CFPS reaktioner på ett sätt som är direkt analoga med de som används för att karakterisera cellulära system, vilket möjliggör användningen av bullerbiologiska tekniker som används i cellulära system för att karaktärisera CFPS gen kretsar och deras interaktioner med cellfria miljö.
Introduction
Cellfria system erbjuder en förenklad och flexibel plattform för visning biologiska reaktioner fria från komplicerande faktorer såsom kondition, division, och mutation som är oundvikliga i studiet av levande celler. Sådana metoder har använts för att studera cellulära system inklusive karakterisering av membranproteiner en, den sondering av proteininteraktioner 2, och utforskandet av grundläggande aspekter av översättnings 3-7. Nyligen cellfria system har börjat få fotfäste som livskraftiga plattformar för syntetisk biologi 8-10. Överklagandet av sådana metoder är att de fria syntetisk biologi från resursdelning och "yttre brus" som påverkar reaktionsdynamik i levande celler. Men frågorna kvarstår om hur den fysiska miljön där cellfria reaktioner är inbäddade påverkar progression och resultatet av reaktionen. Cellfria reaktionsmiljöer - särskilt begränsad miljöäldrar som närmar cell relevanta volymer - förblir dåligt karaktäriseras. Cellfritt proteinsyntes (CFPS) är konventionellt tanken på att vara "skalfria," uppvisar likvärdiga kinetik i en rad mikroliter till liter skala reaktionsvolym 11. Ändå har begränsande reaktioner på cellulära skala volymer visats signifikant påverka proteinuttryckshastigheter 12.
Den stokastiska natur cellfria reaktioner - särskilt som dessa systemtänkande eller ens gå under femtoliter volymer - kan vara av särskild betydelse. Buller i genuttryck är en egenskap starkt präglat av instängdhet som små cellvolymer och höga tätheter av komponenter tvingar många av de viktiga molekyler till mycket låga befolkningsnivåer - till exempel Escherichia coli gränserna inom en 1 fl volym så många som 4.300 olika polypeptider enligt den inducerbara kontroll över flera hundra olika promotorer 13. Denna egenbullret har varit inblandad som en central drivkraft i många biologiska processer inklusive kemotaxi 14, HIV beslut mellan aktiv replikering och latens 15, beslutet om λ fag mellan lys och lysogeni 16,17, och beslutet Bacillus subtillus mellan kompetens och sporulering 17. Cellfritt syntetisk biologi ger då både en möjlighet att utforska de stokastiska egenskaper cellulära gen kretsar och nätverk, och manipulera dessa beteenden för att uppnå specifika tekniska mål. Medan buller beteende cellulära system har väl studerade 18-27, har det funnits lite utforskning av den grundläggande brus beteende cellfria system 8, särskilt vid den cellulära skalan.
Här presenterar vi en plattform för studier av stokastiska effekter i cellfritt syntetisk biologi. Denna mikrofabricerad plattform innehåller femtoliter skala reaktions cHambers vilka kan snabbt övergått mellan öppna (fri diffusion in och ut ur kammaren) och stängda (reaktanter tillstängda inuti kammaren) stater. I det stängda tillståndet, vi begränsar cellfri protein Syntes (CFPS) reaktanter som uttrycker ett grönt fluorescerande protein (GFP), och följa genuttryck med time-lapse fluorescensmikroskopi 28 (figur 1). Vi karakteriserar denna cellfri miljö genom att mäta strukturen hos de stokastiska variationer i genuttryck på ett sätt direkt analogt med de som används för att karakterisera celler 25. Icke-mikrofabrikationsmetoder för innestängcellfria reaktioner innefattar vesiklar och liposomer 29-32, vatten-i-olja-emulsioner 12 och porösa medier 33. Men även om dessa metoder kan ge kontroll över storleksfördelningen av de trånga volymerna 34, mikrofabrikationsmetoder skapa mycket reproducerbara funktioner med tätt angivna mått, även på nanonivå.Dessutom kan dessa stela strukturer lätt spåras över tid utan att vara känslig för avdunstning eller förändringar i den yttre miljön. Mikrofabricerad container designer som används i tidigare arbete 8,35 kan inte snabbt täta reaktionskammare följande reaktion initiering, komplicerar tydligt uppdrag av tiden när reaktionen initierades (tiden noll). Med användning av metoden som presenteras här, behövs endast 4-5 min mellan initiering och visualisering av reaktionen på enheten, varigenom en väl definierad "tiden noll". Följande protokoll beskriver metoder för att tillverka och testa den här enheten, inklusive optisk litografi, enhet montering, enhet testning och metoder för bildanalys.
Protocol
1. Optisk Litografi av Enhets Masters
- Dehydrera rena kiselskivor på en varm platta vid ~ 250 ° C under minst en timme.
OBS: Det är god praxis att använda mer än en wafer när de förbereder en mästare, i händelse av användarfel. - Förbered fotoresist portioner. Förbered alikvoter av både SU-8 2015 fotoresist och en utspädning av SU-8 2015 fotoresist i 2: 1-förhållande med användning av SU-8 tunnare som utspädningsmedel.
OBS: Ungefär behövs 1 ml fotoresist för spin-beläggning en wafer. - Förbered tre maskmönster för att producera dessa mästare. För Membrane Mästare, förbereda två masker: en mönstring membrankanalen och den andra mönstringen reaktionskammare. För styrventilen herre, förbereda en enda maskmönster.
OBS: För mer information om litografiska tekniker, inklusive mask mönstring, se Ito och Okazaki, 2000. 36 Se Fowlkes och Collier, 2013 för en mer detaljerad beskrivning av anordningen utformning 37. - Förbered Membrane Mästare
- Spin-coat 2: 1 SU-8 2015 fotoresist utspädning på wafers vid 1000 rpm under 45 sekunder.
- Mjuka baka wafers vid 95 ° C under 2 min. Med hjälp av en kontaktriktanordning, exponera wafers med membrankanalmönstret för 10 sek, och utföra en efterexponerings grädda i 2 min vid 95 ° C.
- Utveckla wafers i SU-8 framkallare under 1 min, eller tills fotoresist rester avlägsnas. Skölj wafer med isopropanol, flyttar från topp till botten. Torr wafer med kväve, återigen rör sig från topp till botten. Baka wafers vid 180 ° C under 4 min.
- Spin-coat mönstrade wafers igen med 2: 1 SU-8 utspädning vid 2000 rpm i 45 sek.
- Mjuk baka mönstrad skivor för 2 min vid 95 ° C. Använda kontakt Aligner, rikta mönstrade wafers med reaktionskammaren mönster, och exponera i 10 sek. Utför efterexponerings grädda i 2 min vid 95 ° C.
- Utveckla wafers som beskrivs i steg 1.4.3. Efter framkallning och torkning wafers, baka wafers vid 180 ° C under 4 min.
OBS: Skivorna kan utvecklas i samma utvecklare som användes i föregående steg.
- Förbered kontrollventilen Mästare
- Spin-coat outspätt SU-8 fotoresist på rena rån vid 2000 rpm i 45 sek.
- Mjuk baka rånet vid 95 ° C under 6 minuter. Med hjälp av en kontakt Aligner, exponera wafers med ventilmönsterkontroll för 10 sek. Utför en efterexponerings grädda vid 95 ° C under 6 minuter.
- Utveckla wafers i SU-8 Developer för 2 minuter, eller tills återstoden avlägsnas. Skölj med isopropanol, rör sig från topp till botten. Torr wafer med kväve och grädda vid 180 ° C under 4 min.
2. PDMS Device Fabrication
- Silaniseras alla mästare med ~ 0,2 ml trimetylklorosilan via ångavsättning.
- Snabbt bifoga befälhavaren i en lufttät behållare vid RT med några droppar av silaniseringsmedel.
OBS:. Andra silanisering protokoll kan vara acceptabelt 38 Om det utförs properly, kommer PDMS vara enkelt att avlägsna.
- Snabbt bifoga befälhavaren i en lufttät behållare vid RT med några droppar av silaniseringsmedel.
- Blanda en kommersiell poly (dimetylsiloxan) (PDMS) bas och härdare i olika förhållanden för både membranet och styrventil skikten i anordningen, såsom har visats i liknande flerskiktsventilkonstruktioner 39. Använd 20: 1 och 5: 1 förhållanden av bas: härdare för formar de membran och reglerventil, respektive.
- För membran mögel, blanda 10 g av basen med 0,5 g av härdare.
OBS: Denna volym kommer att spinnbeläggs på membranet mastern. - För ventilformkontroll, blanda basen och vulkmedel i en 5: 1-förhållande. Mängden av PDMS som är nödvändiga för att forma styrventilen kommer att bero på det kärl som används för att hålla styrventilen mästare; fylla behållaren på sådant sätt att befälhavaren är belagd med ~ 1 cm av PDMS.
- För membran mögel, blanda 10 g av basen med 0,5 g av härdare.
- Blanda båda PDMS förberedelser och avgasa dem i en vakuumkammare tills inga luftbubblor är synliga. Placera styrventilen mästare i ett värmebeständigtbehållare, såsom en glasskål. Häll försiktigt 5: 1 ratio PDMS över master och avgasa den container en andra gång.
- Medan styrventilen PDMS behållaren är avgasade spin-coat de 20: 1 förhållande PDMS på membran mästare genom noggrant hälla PDMS blandningen på membranet befälhavaren att minimera luftbubbelbildning, sedan snurra-beläggning befälhavaren vid 1000 rpm för 45 sek.
- Delvis härda båda mästare i en ugn vid 80 ° C under 6 min för membran master och 15 min för styrventilen mastern.
NOTERA: När partiellt härdade, bör PDMS hålla sin form, men materialet blir något klibbig. Om PDMS ännu inte botas, baka igen i steg om några minuter åt gången tills materialet håller sin form när man trycker. - Skär rektangulära PDMS formar från styrventilen herre, skalar formarna bort försiktigt. Punch inlopps hål genom gjutna komponenten med hjälp av en 0,75 mm hålslag.
OBS: Hålet kan rengöras genom att sätta in en 23 gauge blunt spets nål, och formens utsida kan rengöras med cellofantejp, om så är nödvändigt. - Med användning av ett optiskt mikroskop för att lokalisera reaktionskamrarna på membranet befälhavaren, rikta styrventilformkomponent med särdragen i reaktionskammaren membranet och placera ventilkomponenten kontrollen direkt ovanpå membranet mastern. Orientera styrventilen inloppet till det nedre vänstra hörnet på enheten, och se till att reaktionskammare och kanal av membran befälhavaren är synliga inne i rektangulära styrventilen.
- Baka de inriktade formkomponenter vid 80 ° C under 2 h.
OBS: Formarna membran och reglerventil kommer nu att beseglas, och manipuleras som en gjutform. - Skär den skiktade PDMS formen bort från membranet befälhavaren, peeling formen bort från master mycket försiktigt för att inte perforera membranet.
- Stansa inlopp och utlopp hål för cellextraktet ingången med en 0,75 mm hålslag. Slå hål genom båda lagren,och rengör dem på samma sätt som beskrivs i steg 2.6.
- Med användning av en induktivt kopplad plasma renare, plasma behandla både formen (membransidan uppåt) och en nr 0 täckglas vid 10,5 W under 20 sek. Omedelbart avlägsna täckglaset och mögel från plasma renare och lager komponenterna, membransidan mot glas, försöker att minimera luftfickor mellan glaset och formen. Tryck inte direkt på membraningångskanal, eller membranet kan para till glas, vilket gör det svårt att fylla kanalen med reaktanterna.
- Var särskilt försiktig när du hanterar de församlade enheter för att undvika att krossa glaset lagret. Använd tunna glastäck som enheten måste avbildas genom glastäck använder hög förstoringsoljeimmersions mål - om glaset är för tjock, kan enhetens funktioner inte vara synlig.
- Slutligen, bota de ifyllda enheter vid 80 ° C under 2 h.
3. Experimentell Setup for Cellfri Proteinsyntes Reaktion
- Hydrat en enhet genom att koka den i avjoniserat vatten under 1 timme.
OBS: Enhet bör ha en grumlig utseende när helt hydrerad. Anordning kan även lämnas O / N i sterilt vatten vid RT för att hydratisera det. - Med användning av ett inverterat mikroskop med en inkubation skåp, inställt omgivningstemperaturen till 30 ° C.
OBS: Denna temperatur valdes för att optimera uttryck av GFP med en T7-promotor, så optimala temperaturer för andra reaktioner kan variera 40. - Montera enheten till mikroskop scenen hållare med tejp och linda kanter enhet med våt mjukpapper för att behålla lokal hydrering.
- Använd två hög precision slutna kretslopp spänningstryckgivare för att modulera kvävgas tryck för styrventil aktivering och reagens ingång.
OBS: Detta protokoll har endast testats med låg renhet kväve, även om andra inerta gaser kan användas.- Anslut den första Givare24-gauge PTFE-rör med en vattenbehållare som hölls i en 4 ml glasflaska med ett septum lock. Anslut reservoaren till styrventilinloppet med användning av ett andra rör avslutas med en 23 gauge trubbig spets nål.
OBS: Båda rören penetrera reservoar septum med två vassa 23 gauge nålar. - Anslut den andra givaren med 24-gauge PTFE slang kopplad till en hane till hane Luer-lok kontakt. Bifoga detta till en Luer-lok 23 gauge nål ansluten med slang med en annan 23 gauge trubbig spets nål, som monteras individuellt för varje enhet. Denna nål ansluter till membranreaktionskanalen; använda den för att spola vatten från reaktionskanalen och ingångs reagens.
- Anslut den första Givare24-gauge PTFE-rör med en vattenbehållare som hölls i en 4 ml glasflaska med ett septum lock. Anslut reservoaren till styrventilinloppet med användning av ett andra rör avslutas med en 23 gauge trubbig spets nål.
- Med användning av en cellfri proteinexpressionssystem, montera komponenterna för CFPS reaktionen på is, enligt tillverkarens instruktioner. Minimera tiden hålla CFPS reagenser på is och placera reaktionen i enheten direkt efter montering.
OBS: Denna enhet har varitanvänds med en kommersiell E. coli extrakt proteinuttryck kit och en plasmid konstitutivt uttrycker GFP. Den totala reaktionsvolymen reducerades till 25 | il - det kan vara möjligt att använda ett ännu lägre volymen för reaktanter, om så önskas. Som CFPS reagenser tenderar att vara känsliga för frysupptiningscykler, kan det vara bra att göra portioner av reagenserna på lämplig volym före experimentet. Andra reagens kan tillsättas till reaktionsblandningen, men reaktionen måste vara helt ihopsatt innan den appliceras på anordningen.- Montera reaktionen, lägga DNA ingång sist.
OBS: När monteras i ett Eppendorf-rör, kommer CFPS reaktionen påbörjas om inte hålls på is. Eftersom den tid det tar att tillämpa de reagenser till enheten och börja experimentet kan variera, är det bra att starta en timer när reaktionen monteras och blandas - detta kommer att hålla tidsplanen mellan experimenten konsekventa, och stöd felsökning.
- Montera reaktionen, lägga DNA ingång sist.
- Användaslang och nål kontakt beskrivs i steg 3.4.2, återkalla monterade reaktionen i röret med hjälp av en 1 ml spruta. För in den trubbiga spetsen nålen in i reaktionskammaren inlopp. Lossa nålen kontakten från sprutan och fäst den på man till hankontakt används för reaktionskammaren givaren.
- Applicera tryck (<10 psi) till de CFPS reaktanterna för att fylla kanalen. Ta bort nålen när reaktionen är fylld.
- Sätt den trubbiga röret från den andra omvandlaren till styrventilinloppet. Utsätt inte för tryck reglerventilen än.
- Placera den monterade enheten på scenen. Använda bright imaging, lokalisera reaktionskammare med 100X oljeimmersionsobjektiv.
- Manövrera styrventilen genom att tryckreglerventilen givaren till 20 psi; en synlig förändring i membranet kommer att vara uppenbart när styrventilen manövreras. Fokus på bottnarna av reaktionskamrarna.
- Börja bilden förvärvet; tillväxt i fluorescens wsjuka vara synliga i det inre och runt det yttre av reaktionskamrarna, men det kommer sannolikt inte att vara uppenbar i de tidiga stadierna av reaktionen. Fånga bilder varje 1-3 min tills reaktionen når ett stationärt tillstånd fluorescens. Om en automatiskt fokusera stadium inte är tillgänglig, kort omfokusera varje bild innan bilderna tas.
OBS: Medan vissa fotoblekning kommer att inträffa, kan effekterna på relativ fluorescens på grund av fotoblekning redovisas så länge graden av fotoblekning är känd. Denna fotoblekning hastigheten kan uppskattas genom att exponera en fluorescerande standard, till exempel en känd koncentration av GFP eller en fluorofor blandning, till konstant fotoblekning under en tidsperiod. - Anteckna tiden förflutit från reaktionsenheten till den första bilden som förvärvats.
OBS: Detta tar vanligtvis 4-5 min.
4. Bildanalys och databehandling
- Använda en bildanalys programvara såsom ImageJ, väljinre av reaktionskammare som en ROI. Förvärva medelvärdet fluorescensintensiteten värdet på ROI för alla bilder.
OBS: Detta är den råa fluorescensintensitet spår.- Utför denna uppgift i ImageJ använder tidsserierna Analyzer och ROI Fastighets plugins - Använd Time Series Analyzer för att välja områden av intresse runt det inre av varje reaktionskammare. Ställ "AutoROIProperties" till ett område som motsvarar det inre av varje reaktionskammare, kolla "Add On Klicka", och välj varje kammare.
OBS: Detta steg kan också göras med ellipsen verktyget för att rita en ROI kring fluorescerande kammaren. Denna ROI storlek motsvarar vanligtvis till en 30 x 30 pixel ellips för en 10 nm diameter kammare ses med ett 100X mål. - Markera alla ROI i ROI Manager. Använd "Multi Measure" funktionen för att bestämma fluorescensintensitet medelvärdet för varje ROI genom hela bild stacken.
OBS: En plugin som heter StackReg kan användas för att rikta in bildstapeln, om så är nödvändigt.
- Utför denna uppgift i ImageJ använder tidsserierna Analyzer och ROI Fastighets plugins - Använd Time Series Analyzer för att välja områden av intresse runt det inre av varje reaktionskammare. Ställ "AutoROIProperties" till ett område som motsvarar det inre av varje reaktionskammare, kolla "Add On Klicka", och välj varje kammare.
- Efter förvärvet av råa fluorescensintensiteten spår för alla kamrarna i ett experiment, bestämma deterministiska komponenten i reaktionen genom att ta ett inter experimentell genomsnitt för alla spår, och subtrahera medel från enskilda rå spår. Använd dataanalys program som IGOR eller MS Excel för denna analys.
OBS: Detta ger brus spår för varje reaktionskammare. - Analysera genuttryck bullret från dessa reaktionskamrar med samma metoder som används för att analysera genuttryck buller härrörande från celler 25.
Representative Results
Den distinkta fördelen med denna mikrofabricerad plattform är i tillämpningen av den styrbara elastomera "styrventil" som oberoende manövreras i syfte att begränsa CFPS reaktioner (Figur 2A). När enheten aktiveras, är membrankamrarna pressas mot glasskiva att begränsa fluorescerande reagens i en rad reaktionskammare (figur 2C). För att kontrollera att kamrarna tillförlitligt begränsa reaktionen genom hela experimentet, var en grundläggande FRAP (fluorescens återhämtning efter fotoblekning) test utfört 37. En fluorofor (AF 555) applicerades på enheten och styrventilen var påverkad; använder slutaröppning av mikroskopet, en enda väl inneslutning av fluoroforen isolerades och photobleached individuellt (figur 2D). Den valda väl blev mörkt och återhämtade sig inte i ljusstyrka tills styrventilen tryckavlastades 20 min60, senare frigöra kammaren från glaset. Detta test verifierar att dessa reaktionskamrar förblir väl tätad för varaktigheten av experimentet.
Under optimala förhållanden, en CFPS reaktion som uttrycker en lätt visualiseras protein (t.ex. GFP eller Luciferase) uttrycker detekterbara protein inom några minuter efter att appliceras på enheten. Över livstid reaktionen proteinsyntesen i det inre och yttre av reaktionskamrarna avbildas och kvantifieras genom att mäta enheter av fluorescensintensiteten inuti varje kammare (figur 3A). Fluorescensintensitet, motsvarande proteinkoncentration, kan mappas över tiden för varje reaktionskammare (fig 3D).
Gene expression är en inneboende stokastisk process som introducerar fluktuationer (buller) vid varje molekylär steg (syntes, nedbrytning, protein-DNA bindande, etc.) 20. En gren av buller biologi fokuserar påbevisvärde gen kretsbuller 41. Uttryck i cellfria system kommer att ha yttre bullereffekter som uppstår på samverkan mellan den molekylära maskiner friheten och de ytor som definierar gränserna för reaktionskärlen. Dessa yttre effekter kommer sannolikt att bli mer uttalad som cellfria reaktioner är begränsade i ännu mindre reaktionskammare. Förmågan att utföra tidsförlopp avbildning av flera trånga CFPS reaktioner gör sedan en noggrann analys av bullerstruktur (magnitud och dynamik) i trånga cellfria system på ett sätt som direkt analogt med metoder som har rapporterats för cellulära system 25. Figur 3C och 3D visar tidsförloppen för konstitutiv GFP-expression från en T7-promotor i en standard 384-brunnars mikroplatta med en brunnsvolym av 15 | il, jämfört med i PDMS reaktionskamrar 10 um i diameter, vilket motsvarar volymer av endast ca 300 fl, ca sju ordnings storleksordning mindre. Variationen i proteinuttryckshastigheter i de 10 um reaktionskammare är mycket högre än i mätningarna väl platta, närmar de som ses i celler.
Multiplexad reaktioner utförda på enheten uppvisar liknande kinetik till CFPS reaktioner utförda i bulk på en mikroplattläsare (figur 3B), där det finns en snabb ökning i fluorescens som platåer, ofta antas vara orsakade av begränsning resurs inom reaktionsvolymen 42,43 . Detta deterministiska tillväxtbeteende, men fluktuerande, är generellt konsekvent över alla reaktionskammare, och mellan experiment - som genomsnittet spår mellan kamrarna över experiment, kan den deterministiska trenden subtraheras från spårvärden, vilket innebär att endast de bruskomponenterna i reaktionen (Figur 4A) . Figur 4B visar GFP uttryck buller efter avlägsnande av deterministiska, gående komponent (överst), Och autokorrelationen för bruset (botten), medan fig 4A visar de motsvarande spåren i de 10 | im reaktionskamrarna. Fördelningen i halvtider autokorrelations spår ger frekvensberoende buller medan noll fördröjning av autokorrelations spår ger storlekarna på buller, som variationen.
Figur 1. Cellfritt proteinsyntesen reaktanter är begränsade i femtoliter skala reaktionskammare för att mäta genuttryck buller. Reagenser från en kommersiell cellfritt proteinuttryck systemet används för att konstitutivt uttrycka GFP inne begränsad PDMS reaktionskammare. En array av dessa kammare kan visualiseras med tidsförlopp fluorescensmikroskopi för att karaktärisera proteinuttryck och genuttryck buller. Den fluorescensintensitet Of varje reaktionskammare med tiden kan ritas som en enskild kurva. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Tillverkning av tvåskikts mikrofluidikanordning med förslutbar femtoliter skalekamrarna. (A) layout och sprängd vy av anordningsskikten. Anordningen är sammansatt av två PDMS skikt och ett täckglas. PDMS-membran, förseglas mellan glas och reglerventil skikten, håller reaktionskamrarna. (B) SEM-bild av PDMS reaktionskammaren. Den inre diametern är 10 | im. (C) Schematisk ingångskanaler i enheten. Cellfri protein Syntes (CFPS) reagenser flygs genom reaktionskanalen. Vatten trycksätts i kontrollenventil för att komprimera reaktionskammare mot glasskiva, tätning kamrarna 37. Reproduceras från Ref. 37 med tillstånd från The Royal Society of Chemistry. (D) Fluorescens återhämtning efter fotoblekning (FRAP) test på en enda bra med FITC indikerar kammare är väl tätat mot yttre miljön. Fluoroforen fångades i kamrarna (övre bilden) och en enda brunn photobleached (lägre bild). Ingen fluorescens återhämtning sågs i photobleached kammaren tills styrventilen släpptes. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. EGFP Expression i trånga cell-Free Reaction. (A) Fluorescens bilder av förseglade reaktions c Hambers vid valda tidpunkter i reaktionen. Proteinproduktion kan ses både inne reaktionskammare och utanför kamrarna i huvudkanalen. (B) EGFP klonades in i en pET3a vektor, tillhandahåller en T7-polymeraspromotor och terminator och en stark ribosombindande ställe (RBS). (C) Normaliserade fluorescensmätningar av konstitutivt uttryck av EGFP i en bulk cellfri reaktion utfördes i en mikroplattläsare. CFPS reaktioner producerar oftast protein snabbt innan saktar till en "steady state" fluorescens - detta är förenat med resursbegränsning 43. Svarta streck indikerar den genomsnittliga spår. (D) Normaliserad fluorescens av 51 råa fluorescensintensitet spår läses från 51 reaktionskammare under flera experiment. Svart streck anger den genomsnittliga spår över flera experiment, som illustrerar den deterministiska komponenten av proteinuttryck./52616/52616fig3large.jpg "Target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Individuella Buller Spår och Buller Autokorrelation av en Cellular och cellfritt system. (A) Från Austin et al., 2006. Buller i GFP uttryck (överst) och normaliserade autokorrelationsfunktioner (nederst) förvärvats från att spåra GFP produktionen i levande bakterier 25. Återges med tillstånd från Macmillan Publishers Ltd: [Nature] 25 (. Vol 439), upphovsrätt (2006). (B) Buller i GFP uttryck (överst) och normaliserade autokorrelationsfunktioner (nederst) förvärvats från GFP produktion i cellfritt system, spåras i mikrofluidikanordning reaktionskammare. Klicka härför en större version av denna siffra.
Discussion
Genuttryck i celler är till sin natur bullriga på grund av små cellulära volymer och låga kopieantal av viktiga reaktanter. Buller biologi fokuserar ofta på de källor, bearbetning och biologiska konsekvenser av fluktuationer i populationer, koncentrationer, positioner, eller tillstånd av molekyler som styr gen kretsar och nätverk 44. Den stora majoriteten av detta arbete har utförts i cellulära system, som har fördelen av att titta bullret av en gen krets inom naturliga ramen för de genetiska nätverk inom cellen. Men cellfria system gör det möjligt att karakterisera inneboende fluktuationer i en individuell gen krets utan störande yttre effekter 18 som inte kan undvikas i cellulära system. Analys av buller kan erbjuda viktiga fysikaliska insikter i hur genetiska kretsar är uppbyggda och hur de fungerar, och har använts i cellulära system för att karaktärisera negativ 25 och positiv
Nyckeln möjliggör inslag av designen är integreringen av matriser av femtoliter-volym (micron skala) reaktionskammare som används för att begränsa reaktanterna i ett cellfritt proteinuttryckssystem, med en elastisk "reglerventil" membran i PDMS som fångar den reaktanter vid en väldefinierad, "tiden noll" för reaktion initiering (Figur 1). Denna kontroll tillåter kinetiken för de reaktioner som ingår i proteinsyntes som skall follskyldig i realtid med hög precision. Som sådan, är det viktigt att hantera cellfria reaktanter så att inter-experimentella variabiliteten minimeras så mycket som möjligt. Denna kontroll tillåter oss att utvärdera brusstruktur av cellfria genetiska kretsar på ett sätt som är analogt med tekniker som tidigare använts för att utvärdera genuttryck i levande celler.
Såsom reaktanter som användes i CFPS system kan vara känsliga för frysnings-upptiningscykler, är det viktigt att hålla reaktanterna kalla och minimerar den tid reaktanterna spenderar upptining på is. Det är en god vana att regelbundet testa uttrycket av CFPS systemet i bulk för att identifiera förändringar i expressionsnivåer över tiden - detta kan göras på ett 10-15 ^ il reaktion i ett Eppendorf-rör, eller i en anordning som en mikroplattläsare , som utför multipla läser över tiden för att fånga reaktionskinetik. Noterar ålder och upptiningstider reaktanterna för varje experiment kommer att hjälpa när du felsöker lågt uttryck levels. Vidare, vid montering CFPS reagens, är det viktigt att notera att reaktionen börjar när den är helt monterad och avlägsnas från isen. För att upprätthålla en konsekvent "tid noll", är det till hjälp att registrera den tid efter initieringen av CFPS reaktionen efter den slutliga tillsatsen av DNA-ingång, och att tillämpa reaktionen så snabbt som möjligt till den inkuberade enheten. Denna process bör ta ca 4-5 min, och fluorescens bör inte vara synlig inom reaktionskammare. Denna styrning säkerställer att den tillgängliga tiden för att visualisera tillväxt delen av reaktionskurvan är maximerad.
Innan du kör CFPS reaktioner på enheten, är det lämpligt att köra kvalitetskontroller för att kontrollera att det inte finns något läckage från kamrarna. En FRAP test kan utföras (som i figur 2D) genom att tillämpa en fluorofor till enheten och utsätta en enskild väl tills brunnen är helt blekt. Om kamrarna ärväl tillslutna, ingen återhämtning ska vara synlig inne i väl - det bör finnas en skarp kontrast mellan väggarna i facket och de inre och yttre utrymmen. Om fluorescens återhämtning är uppenbar eller väggar reaktionskammaren är inte väl definierade, bör trycket på styrventilen ökas eller enheten bör kontrolleras för läckage eller delaminering från glasskiva.
Detta protokoll har testats med CFPS reagenser från en kommersiell E. coli cellfri proteinexpressionskit (skalas till 25 | il), även om andra robusta CFPS system kan användas. Det är möjligt att använda volymerna mycket lägre än 25 l vid tillämpningen reaktioner på enheten, vilket kan vara till hjälp när reagens kostnaden är en begränsande faktor i experiment. När reaktanter läggs till enheten och reaktionskamrarna är förseglade, är det inte möjligt att lägga reaktanter till lösningen utan de-aktivering av styrventilen - alltså den här enheten är inte suitable för reaktioner som kräver tillsats av reagens under reaktionsförloppet. Denna enhet är också inte optimerade för att observera CFPS reaktioner som kan köras längre än 3 h - effekterna av uttorkning och torkning av enheten efter denna tidsperiod har inte utvärderats. Om längre reaktionstider önskas, kan dessa effekter mildras genom att täta anordningen för att förhindra avdunstning, ändra inkubationstemperaturen, eller genom användning av en fuktkammare. Ändringar av enhetens utformning, såsom nanoporösa strukturer i kammarväggarna 49,50 eller införandet av ett poröst membran skikt, representerar några metoder som kan ge reagens utbyte och därmed förlänga reaktionstidsramar.
Mikrofabricerad reaktions fack jämn volym är värdefulla för att upprätthålla konsekventa dimensioner över experiment och mycket lämplig för utredning "sidoreaktioner" med fackväggarna. Till skillnad från metoder som använder ingenn-mikroteknik, dessa reaktioner måste utvärderas i litet antal, och ger inte dimensionell flexibilitet under experimenten. Emellertid är den styrbara designen för dessa reaktionskamrar mycket lämplig för tidsförlopp mikroskopi, och kan vara en lysande komplement till en hög genomströmning metod för inneslutning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SU-8 2015 | Microchem | SU-8 2000 series | Toxic. Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing. |
| SU-8 Thinner | Microchem | SU-8 2000 series | Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing. |
| SU-8 Developer | Microchem | SU-8 2000 series | Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing. |
| Chlorotrimethylsilane | Sigma Aldrich | 92360 FLUKA | Hazardous. Corrosive to the respiratory tract., Reacts violently with water. |
| Sylgard 184 PDMS | Dow Corning | SYLGARD 184 | |
| 0.75 mm hole-puncher | Ted Pella Inc. | 15072 | Harris Uni-Core |
| 23 gauge needles blunt tip | Component Supply Co. | /NE-231PL-25 | |
| #0 glass coverslip | Ted Pella Inc. | 260366 | Gold Seal |
| Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | |
| Microscope | Nikon Instruments | Eclipse TE 300 | |
| CCD camera | Roper Scientific | CoolSNAP-HQ | |
| Shutter | Shutter Insturment | Lambda SC | |
| Light Source | Nikon | Intensilight C-HGFI | |
| Color Filters | Chroma Technology Corp. | ZET 532/106 excitation, ZT 532rdc dichroic, ET 595/50m emission | |
| 100X oil-immersion objective | Nikon | N.A. 1.4 | |
| Temperature Regulator | Oko Lab | H201-T | |
| Metamorph | Universal Imaging Corp. | Version 7.8.3.0 | |
| Marsh Bellofram transducers | Marsh Bellofram | T2000 | |
| 24 gauge PTFE tubing | Component Supply Co. | /SWTT-24-C | |
| Septum vials | National Scientific | C4015- 17W | |
| Power Supply | Hewlett Packard | 6205B Dual DC Power Supply | |
| Sharp 23 gauge needles | Precision Glide | 305129 | |
| Male-to-male luer lock adapters | Qosina | 20024 | Polycarbonate |
| Stainless Steel Blunt Needle 23 gauge | Component Supply Co. | /NE-232PL-5C | Polypropylene |
| S30 E. coli protein expression system | Promega | L1110 | |
| Pet3a-GFP vector/protein | Novagen | 69418-3 | Assembled in-house. Inserted EGFP gene in Pet3a. |
| Quantum Prep Plasmid Midiprep Kit | Biorad | #732-6120 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Alexa Fluor 555 | Molecular Probes | AF555 | http://www.lifetechnologies.com |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.46r | |
| Plugin: Time Series Analyzer | Balaji J Dept. of Neurobiology, UCLA | Version 3.0 | |
| Plugin: StackReg/TurboReg | Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne Biomedical Imaging Group | Distribution is dated July 7, 2011 | |
| Plugin: ROI Manager Tools | Tiago Ferreira | 12/15/2013 Version |
References
- Klammt, C., et al. High level cell-free expression and specific labeling of integral membrane proteins. European Journal of Biochemistry. 271, 568-580 (2004).
- Wong, R. W., Blobel, G. Cohesin subunit SMC1 associates with mitotic microtubules at the spindle pole. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 15441-15445 (2008).
- Niederholtmeyer, H., Stepanova, V., Maerkl, S. J. Implementation of cell-free biological networks at steady state. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, 15985-15990 (2013).
- Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. Genome replication, synthesis, and assembly of the bacteriophage T7 in a single cell-free reaction. ACS synthetic biology. 1, 408-413 (2012).
- Algire, M. A., et al. Development and characterization of a reconstituted yeast translation initiation system. RNA. 8, 382-397 (2002).
- Iizuka, N., Najita, L., Franzusoff, A., Sarnow, P. Cap-dependent and cap-independent translation by internal initiation of mRNAs in cell extracts prepared from Saccharomyces cerevisiae. Molecular and cellular biology. 14, 7322-7330 (1994).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of visualized experiments: JoVE. (79), e50762 (2013).
- Karig, D. K., Jung, S. -Y., Srijanto, B., Collier, C. P., Simpson, M. L. Probing cell-free gene expression noise in femtoliter volumes. ACS synthetic biology. 2, 497-505 (2013).
- Shin, J., Noireaux, V. An E. coli cell-free expression toolbox: application to synthetic gene circuits and artificial cells. ACS synthetic biology. 1, 29-41 (2012).
- Karzbrun, E., Tayar, A. M., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. Programmable on-chip DNA compartments as artificial cells. Science. 345, 829-832 (2014).
- Zawada, J. F., et al. Microscale to manufacturing scale-up of cell-free cytokine production - a new approach for shortening protein production development timelines. Biotechnology and bioengineering. 108, 1570-1578 (2011).
- Kato, A., Yanagisawa, M., Sato, Y. T., Fujiwara, K., Yoshikawa, K. Cell-Sized confinement in microspheres accelerates the reaction of gene expression. Scientific reports. 2, 283 (2012).
- Simpson, M. L., Sayler, G. S., Fleming, J. T., Applegate, B. Whole-cell biocomputing. Trends in biotechnology. 19, 317-323 (2001).
- Korobkova, E., Emonet, T., Vilar, J. M., Shimizu, T. S., Cluzel, P. From molecular noise to behavioural variability in a single bacterium. Nature. 428, 574-578 (2004).
- Weinberger, L. S., Burnett, J. C., Toettcher, J. E., Arkin, A. P., Schaffer, D. V. Stochastic gene expression in a lentiviral positive-feedback loop: HIV-1 Tat fluctuations drive phenotypic diversity. Cell. 122, 169-182 (2005).
- Arkin, A., Ross, J., McAdams, H. H. Stochastic kinetic analysis of developmental pathway bifurcation in phage λ-infected Escherichia coli cells. Genetics. 149, 1633-1648 (1998).
- Kulkarni, R. P., Dworkin, J., Garcia-Ojalvo, J., Elowitz, M. B. Tunability and noise dependence in differentiation dynamics. Science. 315, 1716-1719 (2007).
- Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. Stochastic gene expression in a single cell. Science. 297, 1183-1186 (2002).
- McAdams, H. H., Arkin, A. Stochastic mechanisms in gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 814-819 (1997).
- Elston, T. C., Blake, W. J., Collins, J. J. Stochasticity in gene expression: from theories to phenotypes. Nature Reviews Genetics. 6, 451-464 (2005).
- Blake, W. J., Kærn, M., Cantor, C. R., Collins, J. J. Noise in eukaryotic gene expression. Nature. 422, 633-637 (2003).
- Rao, C. V., Wolf, D. M., Arkin, A. P. Control, exploitation and tolerance of intracellular noise. Nature. 420, 231-237 (2002).
- Raj, A., van Oudenaarden, A. Nature, nurture, or chance: stochastic gene expression and its consequences. Cell. 135, 216-226 (2008).
- Pedraza, J. M., van Oudenaarden, A. Noise propagation in gene networks. Science. 307, 1965-1969 (2005).
- Austin, D., et al. Gene network shaping of inherent noise spectra. Nature. 439, 608-611 (2006).
- Simpson, M. L., Cox, C. D., Sayler, G. S. Frequency domain analysis of noise in autoregulated gene circuits. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 4551-4556 (2003).
- Weinberger, L. S., Dar, R. D., Simpson, M. L. Transient-mediated fate determination in a transcriptional circuit of HIV. Nature genetics. 40, 466-470 (2008).
- Locke, J. C., Elowitz, M. B. Using movies to analyse gene circuit dynamics in single cells. Nature Reviews Microbiology. 7, 383-392 (2009).
- Nourian, Z., Danelon, C. Linking genotype and phenotype in protein synthesizing liposomes with external supply of resources. ACS synthetic biology. 2, 186-193 (2013).
- Pereira de Souza, T., Stano, P., Luisi, P. L. The minimal size of liposome-based model cells brings about a remarkably enhanced entrapment and protein synthesis. ChemBioChem. 10, 1056-1063 (2009).
- Nomura, S. iM., et al. Gene expression within cell-sized lipid vesicles. ChemBioChem. 4, 1172-1175 (2003).
- Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proceedings of the national academy of sciences of the United States of America. 101, 17669-17674 (2004).
- Park, N., Um, S. H., Funabashi, H., Xu, J., Luo, D. A cell-free protein-producing gel. Nature. 8, 432-437 (2009).
- Swaay, D., deMello, A. Microfluidic methods for forming liposomes. Lab on a Chip. 13, 752-767 (2013).
- Okano, T., Matsuura, T., Kazuta, Y., Suzuki, H., Yomo, T. Cell-free protein synthesis from a single copy of DNA in a glass microchamber. Lab on a Chip. 12, 2704-2711 (2012).
- Ito, T., Okazaki, S. Pushing the limits of lithography. Nature. 406, 1027-1031 (2000).
- Fowlkes, J. D., Collier, C. P. Single-molecule mobility in confined and crowded femtolitre chambers. Lab on a Chip. 13, 877-885 (2013).
- Herold, K. E., Rasooly, A. Lab on a Chip Technology: Biomolecular separation and analysis. 2, Horizon Scientific Press. (2009).
- Unger, M. A., Chou, H. -P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288, 113-116 (2000).
- Karig, D. K., Iyer, S., Simpson, M. L., Doktycz, M. J. Expression optimization and synthetic gene networks in cell-free systems. Nucleic acids research. 40, 3763-3774 (2012).
- Cox, C. D., McCollum, J. M., Allen, M. S., Dar, R. D., Simpson, M. L. Using noise to probe and characterize gene circuits. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 10809-10814 (2008).
- Siegal-Gaskins, D., Noireaux, V., Murray, R. M. American Control Conference (ACC), 2013. , 1531-1536 (2013).
- Jewett, M. C., Swartz, J. R. Substrate replenishment extends protein synthesis with an in vitro translation system designed to mimic the cytoplasm). Biotechnology and bioengineering. 87, 465-471 (2004).
- Simpson, M. L., et al. Noise in biological circuits. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 1, 214-225 (2009).
- Dar, R. D., et al. Transcriptional burst frequency and burst size are equally modulated across the human genome. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 17454-17459 (2012).
- So, L. -h, et al. General properties of transcriptional time series in Escherichia coli. Nature genetics. 43, 554-560 (2011).
- Tan, C., Saurabh, S., Bruchez, M. P., Schwartz, R., LeDuc, P. Molecular crowding shapes gene expression in synthetic cellular nanosystems. Nat Nano. 8, 602-608 (2013).
- Sokolova, E., et al. Enhanced transcription rates in membrane-free protocells formed by coacervation of cell lysate. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, 11692-11697 (2013).
- Retterer, S. T., Siuti, P., Choi, C. -K., Thomas, D. K., Doktycz, M. J. Development and fabrication of nanoporous silicon-based bioreactors within a microfluidic chip. Lab on a Chip. 10, 1174-1181 (2010).
- Siuti, P., Retterer, S. T., Doktycz, M. J. Continuous protein production in nanoporous, picolitre volume containers. Lab Chip. 11, 3523-3529 (2011).
