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Bioengineering

फाइबर संगठन में gradations के साथ Electrospun nanofiber Scaffolds

Published: April 19, 2015 doi: 10.3791/52626
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Pharmaceutical Sciences, Mary & Dick Holland Regenerative Medicine Program, University of Nebraska Medical Center, 2Department of Orthopedic Surgery, Joan C. Edwards School of Medicine, Marshall University

Summary

यहाँ, हम फाइबर की gradated संगठन के साथ electrospun nanofiber scaffolds के निर्माण और सेल आकृति विज्ञान / अभिविन्यास को विनियमित करने में अपने आवेदन पत्र का पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। Nanofiber scaffolds के भौतिक और रासायनिक गुणों के संबंध में अनुपात में जैव चिकित्सा क्षेत्र में आवेदनों की एक विस्तृत विविधता प्रदान करते हैं।

Introduction

Nanofibers क्योंकि इसकी संरचना और रिश्तेदार आकार 1 में बाह्य मैट्रिक्स की नकल करने की उनकी क्षमता के ऊतक इंजीनियरिंग के लिए एक लोकप्रिय उपयोगिता रहे हैं। हालांकि, इस तरह पट्टा करने वाली हड्डी प्रविष्टि साइट के रूप में कुछ देशी ऊतक इंटरफेस, कण्डरा की ओर संरेखण में बढ़ जाती है और हड्डी साइट 2-5 में कम हो जाती है कि एक चर संगठनात्मक संरचना का प्रदर्शन जो कोलेजन फाइबर होते हैं। तो, प्रभावी ऊतक उत्थान के लिए प्रभावी ढंग से इस संरचनात्मक ढाल की नकल कर सकता है कि एक चबूतरा निर्माण करने के लिए एक की जरूरत है।

फाइबर संरचना में क्रमिक परिवर्तन पर आयोजित इससे पहले, वहाँ किया गया है अनुसंधान, विशेष रूप से, खनिज सामग्री 6। हालांकि, संयोजी ऊतक के संरचनात्मक घटक पुनः काफी हद तक बेरोज़गार बना रहता है। पहले के एक अध्ययन चूहा calvarial अस्थिकोरक के प्रसार पर सतह सिलिका के कण घनत्व के प्रभाव का अध्ययन करके रूपात्मक ढ़ाल की जांच की और एक Inver पायासिलिका के कण घनत्व और सेल प्रसार के बीच 7 एसई रिश्ता। लेकिन पिछले काम में सेल प्रसार मध्यस्थता कि morphological परिवर्तन फाइबर संगठनात्मक परिवर्तन 7,8 नकल उतार में क्षमता की कमी खुरदरापन सतह के लिए ज्यादातर संबंधित थे। एक ताजा अध्ययन में 9 electrospinning के लिए एक उपन्यास कलेक्टर का उपयोग करके अद्वितीय कोलेजन फाइबर झुकाव मजाक उड़ाया कि एक चबूतरा निर्माण करने के लिए प्रयास किया। इस अध्ययन दोनों गठबंधन और यादृच्छिक फाइबर के साथ एक चबूतरा का निर्माण करने में सफल रहा है, यह देशी ऊतकों में प्रदर्शित क्रमिक परिवर्तन की नकल करने में विफल रहा है। इसके अलावा, यादृच्छिक उन्मुखीकरण के लिए गठबंधन से एक तत्काल परिवर्तन के साथ, अलग घटकों के उत्पादन में, इस पाड़ के biomechanical गुणों काफी कमी आई है। कोई पिछले काम गठबंधन और यादृच्छिक से फाइबर झुकाव में निरंतर ग्रेडेशन के साथ लागू nanofiber scaffolds के उत्पादन करने में सक्षम हो गया है। हमारे ताजा अध्ययन nanofiber scaffolds के सफल मनोरंजन दिखाया गया हैसंभवतः कण्डरा करने वाली हड्डी प्रविष्टि 10 में देशी कोलेजन संगठन की नकल कर सकते हैं कि फाइबर संगठन में ग्रेडेशन के साथ। इस काम को बारीकी से देशी कण्डरा करने वाली हड्डी के ऊतकों इंटरफ़ेस में फाइबर संगठन की है कि जैसा दिखता है कि एक संरचना के साथ nanofiber scaffolds के उत्पादन के लिए इस्तेमाल प्रोटोकॉल पेश करने के लिए करना है।

ढाल nanofiber संरचनाओं संभावित क्षेत्रों की एक किस्म भर में आवेदनों दूरगामी है। हम पहले से ही विभिन्न substrates 11-14 पर ऊतक उत्थान के लिए उपयोग किया जाता है जो वसा व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं (ADSCs) के साथ हमारे scaffolds के संयोजन से पट्टा करने वाली हड्डी प्रविष्टि साइट के ऊतक इंजीनियरिंग करने के लिए आवेदन पर ध्यान केंद्रित किया। इसके अलावा, ADSCs multipotency के मामले में अस्थि मज्जा स्टेम कोशिकाओं को प्रकृति में बहुत समान हैं और उनके संसाधन एक साधारण liposuction प्रक्रिया 15,16 का उपयोग कर काटा जा सकता है, जो प्रचुर मात्रा में है। आगे gradated nanofiber scaffolds के लिए इन कोशिकाओं सीडिंग उनकी आज़ादी को बढ़ाता हैसंभवतः विभिन्न ऊतकों में अंतर कर सकते हैं कि कोशिकाओं के नियंत्रित वितरण के लिए अनुमति देकर इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के खिलाफ मुकदमा। स्टेम कोशिकाओं को बोने के अलावा, nanofibers सेलुलर प्रतिक्रिया के नियमन के लिए संकेतन अणुओं के साथ समझाया जा सकता है। इन scaffolds के संगठनात्मक ढाल के साथ nanoencapsulation युग्मन सेलुलर व्यवहार या संभव प्रत्यारोपण डिजाइन और कोटिंग्स के अध्ययन के लिए अनुमति देता है। अस्थिकोरक भेदभाव 15,16 प्रेरित करने के लिए दिखाया गया है, जो हड्डी morphogenetic प्रोटीन 2 (BMP2), जैसे कार्यात्मक अणुओं के encapsulation आगे इन scaffolds के 10 में से ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों में वृद्धि कर सकता है।

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Protocol

समाधान की 1. तैयारी

  1. 100 मिलीग्राम / एमएल की एक अनुमानित एकाग्रता में पाली (ε-caprolactone) (पीसीएल) (डब्ल्यू एम = 80,000 / छ MOL) का एक समाधान तैयार है। 4 के अनुपात में dichloromethane (डीसीएम) और एन, एन-dimethlyformamide (DMF) का एक मिश्रण में PCL भंग: 1 (वी / वी) 10% की एक एकाग्रता के साथ (w / v)।
  2. मिश्रण के लिए एक 20 एमएल ग्लास ट्यूब में समाधान रखें। 30 मिनट के लिए अल्ट्रासोनिक क्लीनर में ग्लास ट्यूब स्थान या समाधान पारदर्शी है जब तक।

2. उपकरण तैयारी

  1. संलग्न एक 21 गेज कुंद सुई के साथ एक 5 मिलीलीटर सिरिंज में तैयार PCL के समाधान जोड़ें।
  2. चित्रा 1 के अनुसार, एक ऊर्ध्वाधर electrospinning स्थिति में सिरिंज पंप रखें।
  3. 2 सेमी x गठबंधन फाइबर सब्सट्रेट के लिए 5 सेमी की एक खुली जगह के साथ एक स्टेनलेस स्टील के अंतराल कलेक्टर का प्रयोग करें। कलेक्टर सुई की नोक से 12 सेमी रखें।
  4. करने के लिए प्रत्यक्ष वर्तमान (डीसी) उच्च वोल्टेज बिजली की आपूर्ति कनेक्टसुई और कलेक्टर जमीन। कलेक्टर को व्यक्तिगत रूप से अन्य प्रयोगशाला उपकरण के लिए कोई संपर्क के साथ आधारित है कि सुनिश्चित करें।

3. Electrospinning

  1. जब हटाया सुई नोक पर गठन बूंदों तक 1.50 मिलीग्राम / घंटा के लिए सेट सिरिंज पंप, तुरंत प्रतिस्थापित कर रहे हैं। फिर, 0.50 मिलीग्राम / घंटा के लिए प्रवाह की दर निर्धारित किया है।
  2. 12 केवी वोल्टेज ऑपरेटर मुड़ें।
  3. Electrospin एकाक्षीय गठबंधन फाइबर पूरी तरह से कलेक्टर पर अंतर को कवर जब तक।
  4. एक छोटे से कांच की थाली के किनारों के लिए गोंद लागू करें और कांच की थाली के लिए खाई कलेक्टर से फाइबर हस्तांतरण। कांच की थाली के रूप में एक ही आकार की है और आधारित है कि एल्यूमीनियम पन्नी के एक टुकड़े के शीर्ष पर कांच की प्लेट रखें।
  5. चित्रा 3 के अनुसार दूसरे सिरिंज कलेक्टर स्थिति।
  6. कलेक्टर के ऊपर दूसरा सिरिंज पंप और स्थिति यह 2 मिमी प्लास्टिक मुखौटा संलग्न।
  7. (/ डब्ल्यू डब्ल्यू) PCL के समाधान अगर नेन के लिए 1% से कम Coumarin छह जोड़ेंoencapsulation वांछित है और समाधान पारदर्शी है, जब तक मिश्रण।
  8. एक कुंद 21 गेज सुई के साथ एक 5 मिलीलीटर सुई में PCL या PCL / Coumarin 6 समाधान लोड करें। 0.50 मिलीग्राम / घंटा खड़ी करने के लिए पंप सेट और 9 मिलीलीटर / घंटा पर या 1 मिमी / मिनट की एक अनुमानित गति से खींचने के लिए क्षैतिज।
  9. मुखौटा तक Electrospin कलेक्टर बंद लगभग पूरी तरह से चले गए, लेकिन नकाब के तहत अब भी धार क्षेत्र के साथ किया है।

4. फाइबर विशेषता

  1. 40 एमए में धूम coater का उपयोग कर 40 सेकंड के लिए प्लैटिनम के साथ धातु स्टड और कोट करने के लिए दो तरफा प्रवाहकीय टेप के साथ जगह नमूने हैं।
    1. हमारे पिछले अध्ययनों 17,18 के अनुसार स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (SEM) के माध्यम से फाइबर की जाँच करें।
    2. 15 केवी का एक त्वरक वोल्टेज पर छवियों को ले लीजिए।
  2. फाइबर संरेखण को मापने के लिए एक अलग फाइबर नमूना पर फास्ट फूरियर रूपांतरण (FFT) विश्लेषण करते हैं। FFT के द्वारा मापने फाइबर संरेखण के बारे में विस्तृत जानकारी टी उल्लेख कर सकते हैंपिछले अध्ययनों 19,20 ओ।

5. सीडिंग स्टेम सेल।

  1. 2 घंटे के लिए एक 70% इथेनॉल समाधान में भिगोने से फाइबर नमूने जीवाणुरहित। तो फिर किसी भी contaminants को दूर करने के लिए आसुत जल के साथ फाइबर धो लें।
  2. 95% हवा / 5% सीओ 2 के माहौल में 37 डिग्री सेल्सियस पर एक 25 सेमी 2 फ्लास्क में मानव ADSCs और संस्कृति कोशिकाओं प्राप्त करते हैं। सेल संस्कृति के माध्यम से हर दूसरे दिन 10 बदलें।
  3. कोशिकाओं Trypsinize और कोशिकाओं की संख्या गिनती। विशेष रूप से, सेल संस्कृति कुप्पी से सभी मध्यम संस्कृति को हटाने और दो बार फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ कोशिकाओं को धो लें। तो फिर सेल monolayer को कवर किया और 2-3 मिनट के लिए सेल कल्चर इनक्यूबेटर में कुप्पी सेते (37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में पूर्व गर्म) एक 0.25% trypsin-EDTA समाधान की एक एम एल जोड़ें। 4 मिलीलीटर संस्कृति के माध्यम से जोड़ें और सभी सतह पर मध्यम pipetting द्वारा सतह से सभी कोशिकाओं बाहर धो लो। सेल निलंबन अपकेंद्रित्र और फिर से फैलाने वेंसंस्कृति के माध्यम में ई सेल गोली। Hemacytometer के माध्यम से कोशिकाओं की गणना। और एक 35 मिमी -culture डिश में रखा nanofiber पाड़ को 1 × 10 4 कोशिकाओं के आसपास के बीज 3 और 7 दिनों के लिए सेते हैं।
  4. Fluorescein तो Diacetate (एसीटोन में 5 मिलीग्राम / एमएल) (एफडीए) की छवि एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग नमूने का उपयोग कोशिकाओं दाग। विशेष रूप से, संस्कृति डिश के लिए एफडीए समाधान के 100 μl जोड़ने के लिए और 30 मिनट के लिए सेते हैं। तीन बार फ्लोरोसेंट इमेजिंग से पहले पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें। हमारे पिछले अध्ययनों 10 के आधार पर एक स्वनिर्धारित चटाई-प्रयोगशाला कार्यक्रम द्वारा सेल अभिविन्यास का विश्लेषण करें।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल का उपयोग करना, एक संगठनात्मक ढाल के साथ एक फाइबर चटाई गठन किया गया था। चित्रा 3 nanofiber पाड़ पर विभिन्न स्थानों पर ले जाया SEM छवियों से पता चलता है। गुणात्मक यह 6 मिमी (चित्रा 3 डी) में एक यादृच्छिक फाइबर वर्गीकरण करने के लिए 0 मिमी (चित्रा 3 ए) में एकाक्षीय गठबंधन तंतुओं से एक प्रगति है कि वहाँ से निर्धारित किया जा सकता है। FFT के फाइबर संरेखण के लिए एक मात्रात्मक मूल्य देता है, मात्रात्मक प्रक्रियाओं पर बारीकियों 19 यहाँ विस्तृत कर रहे हैं। 0 मिमी प्रदर्शनी फाइबर संरेखण को इंगित करता है, और 6 मिमी पर FFT के पैटर्न एक यादृच्छिक उन्मुखीकरण का प्रतीक है कि एक FFT में फाइबर। एक तेजी से यादृच्छिक फाइबर जमाव (- सी 3B चित्रा) के लिए एक गठबंधन फाइबर संगठन से SEM छवियों में एक स्पष्ट प्रगति (चित्रा 3) है।

ADSCs nanofiber पाड़ में उनके स्थान पर आधारित है morphological परिवर्तन कराना पड़ा। 4 चित्रा (चित्रा 4E - एच) - G> 3 दिन (डी चित्रा -4 ए) में फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप (जीस) के साथ लिया छवियों से पता चलता है। स्टेम सेल कोण के वितरण के लिए मात्रात्मक एक स्वनिर्धारित MATLAB कार्यक्रम द्वारा मूल्यांकन और विभिन्न दूरी पर Kolmogorov-स्मिर्नोव परीक्षण का उपयोग कर विश्लेषण किया गया था। 4i विभिन्न स्थानों पर सेल कोण के वितरण से पता चलता है। 0 मिमी, या गठबंधन तंतुओं के क्षेत्र में, कोशिकाओं के 70% nanofiber निर्माण की धुरी के 20 डिग्री के भीतर दिखाई दिया। इसके विपरीत, ADSCs 20 डिग्री के अंदर आने वाले कोशिकाओं का केवल 20% के साथ, इस संगठनात्मक संरचना का अभाव फाइबर scaffolds के यादृच्छिक अंश पर वरीयता प्राप्त। अंत में, Coumarin 6 का उपयोग रासायनिक ढाल के गठन - लोड PCL के तंतुओं प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर अध्ययन किया गया। रासायनिक ढाल गुणात्मक माइक्रोस्कोपी छवि (चित्रा 5A) का उपयोग कर पुष्टि की गई। छवि में वृद्धि chemi की पुष्टिफ्लोरोसेंट छवि की तेजी से बढ़ती तीव्रता द्वारा प्रदर्शित किया जाता है, जो पाड़, भर में कैलोरी एकाग्रता। फ्लोरोसेंट तीव्रता (छवि जम्मू) (चित्रा 5 ब) के ग्राफ पाड़ भर में एक रैखिक वृद्धि का प्रदर्शन द्वारा रासायनिक एकाग्रता की ढाल पुष्टि करता है।

चित्र 1
चित्रा 1: एकाक्षीय गठबंधन फाइबर सब्सट्रेट की तैयारी के लिए प्रयोगात्मक सेटअप के योजनाबद्ध दिखाता है।

चित्र 2
चित्रा 2: (ए) ढाल पाड़ के निर्माण के लिए दूसरे सिरिंज पंप की नियुक्ति दर्शाता है। कलेक्टर से ऊपर मुखौटा (बी) प्लेसमेंट। यह आंकड़ा [10] Macromol से reprinted किया गया है। Biosci।, 12, झी, जे, एमए, बी, माइकल, पी एल एंड Shuler, एफडी Fabriफाइबर संगठन और उनके संभावित अनुप्रयोगों में gradations के साथ nanofiber scaffolds के कटियन। 1336-1341, कॉपीराइट 2012, विले-VCH से अनुमति के साथ।

चित्र तीन
चित्रा 3: 0 मिमी (ए), 2 मिमी (बी), 4 मिमी (सी), और 6 मिमी (डी) में PCL gradated nanofiber पाड़ के SEM छवियों। माध्यमिक छवियों फूरियर तेजी से स्थानांतरण पैटर्न (FFT) कर रहे हैं। (ए) में पैटर्न गठबंधन फाइबर, (डी) के यादृच्छिक फाइबर बयान से पता चलता है कि है। यह आंकड़ा [10] Macromol से reprinted किया गया है। Biosci।, 12, झी, जे, एमए, बी, माइकल, पी एल एंड Shuler, फाइबर संगठन में ग्रेडेशन और उनके संभावित अनुप्रयोगों के साथ nanofiber scaffolds के एफडी निर्माण। 1336-1341, कॉपीराइट 2012, विले-VCH से अनुमति के साथ।

चित्रा 4: प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी छवियों 3 दिन (ए - डी) के लिए ऊष्मायन के बाद ADSCs दिखा और 7 दिनों (ई - एच)। छवियाँ gradated पाड़ के विभिन्न स्थानों में ADSCs के विभिन्न morphologies दिखा रहे हैं। (मैं): scaffolds के विभिन्न स्थानों पर सेल कोणों का वितरण। प्रकोष्ठों और अधिक गठबंधन फाइबर (0 मिमी) पर nanofiber संरेखण की धुरी के 20 डिग्री के बीच केंद्रित थे। यह आंकड़ा [10] Macromol से reprinted किया गया है। Biosci।, 12, झी, जे, एमए, बी, माइकल, पी एल एंड Shuler, फाइबर संगठन में ग्रेडेशन और उनके संभावित अनुप्रयोगों के साथ nanofiber scaffolds के एफडी निर्माण। 1336-1341, कॉपीराइट 2012, विले-VCH से अनुमति के साथ।

चित्रा 5
Figu5 पुन: Coumarin 6 समझाया फाइबर की (ए) प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी छवि। (बी) के ग्राफ पाड़ भर फ्लोरोसेंट तीव्रता दर्शाती है। रैखिक वृद्धि पाड़ के माध्यम से रासायनिक एकाग्रता में एक क्रमिक परिवर्तन का प्रतीक है। यह आंकड़ा [10] Macromol से reprinted किया गया है। Biosci।, 12, झी, जे, एमए, बी, माइकल, पी एल एंड Shuler, फाइबर संगठन में ग्रेडेशन और उनके संभावित अनुप्रयोगों के साथ nanofiber scaffolds के एफडी निर्माण। 1336-1341, कॉपीराइट 2012, विले-VCH से अनुमति के साथ।

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Acknowledgments

इस काम नेब्रास्का मेडिकल सेंटर और स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (अनुदान संख्या 1R15 AR063901-01) के विश्वविद्यालय से स्टार्टअप धन से आंशिक रूप से समर्थन किया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polycaprolactone Sigma-Aldrich 440744
N,N-Dimethlyformamide Fisher Chemical D-119-1
Dichloromethane Fisher Chemical AC61093-1000
Coumarin 6 Sigma-Aldrich 546283
Adipose Derived Stem Cells Cellular engineering Technologies HMSC.AD-100
Fetal Bovine Serum Life Technologies 26140-111
Fluorescein Diacetate Sigma-Aldrich F7378
Ethanol Sigma-Aldrich E7023
Trypsin-EDTA Invitrogen 25300-054
α-Modified Eagle's Medium Invitrogen a10490-01
Acetone Fisher Scientific s25120a
Phosphate Buffered Saline Invitrogen 10010023
Glass Slides VWR international, LLC 101412-842
Syringe Pump Fisher Scientific 14-831-200 Single syringe
Ultrasonic Cleaner Branson 1510
High Voltage DC Power Supply Gamma High Voltage Research ES30
Scanning Electron Microscope FEI Nova 2300
Fluorescence Microscope Zeiss Axio Imager 2

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References

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बायोइन्जिनियरिंग अंक 98 Electrospinning nanofiber scaffolds के ग्रेडेशन सेल ऊतक इंजीनियरिंग Nanoencapsulation स्टेम
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Khandalavala, K., Jiang, J., Shuler, F. D., Xie, J. Electrospun Nanofiber Scaffolds with Gradations in Fiber Organization. J. Vis. Exp. (98), e52626, doi:10.3791/52626 (2015).

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