Bioengineering

静电纳米纤维支架与渐变的纤维组织

Published: April 19, 2015 doi: 10.3791/52626

Karl Khandalavala¹, Jiang Jiang¹, Franklin D. Shuler², Jingwei Xie¹

¹Department of Pharmaceutical Sciences, Mary & Dick Holland Regenerative Medicine Program, University of Nebraska Medical Center, ²Department of Orthopedic Surgery, Joan C. Edwards School of Medicine, Marshall University

Summary

在这里，我们提出了一个协议，以制造静电纳米纤维支架与纤维的顺层组织，并探索在调节细胞形态/定位他们的应用程序。梯度对于纳米纤维支架的物理和化学性质提供了各种各样的在生物医学领域的应用程序。

Introduction

纳米纤维，因为它们以模仿细胞外基质的结构和相对大小¹能力用于组织工程一种流行工具。然而，一些天然组织界面，如腱-骨插入位点，含有胶原纤维，其显示出一个可变的组织结构，增加在对准朝向腱并降低在骨部位^2-5。因此，对于有效的组织再生，有必要以制造支架，可以有效地模拟这种结构梯度。

在纤维组合物中的逐渐变化进行以前，已经研究，具体而言，矿物质含量^6。然而，重建结缔组织的结构成分在很大程度上仍然未开发。早期的研究调查形态梯度通过研究大鼠颅骨成骨细胞的增殖表面的二氧化硅粒子密度的影响，并发现了一个INVER硅石颗粒密度和细胞增殖⁷之间本身关系。但介导的细胞增殖前期工作的形态变化，多与表面粗糙度缺乏模仿纤维组织变革^7,8的能力。最近的一项研究试图制造的支架，通过使用一种新的收集器，用于电纺丝⁹模仿的独特胶原纤维取向。虽然本研究成功地制造与两个对准的和随机的纤维的支架，它未能模仿呈现在天然组织中的逐渐变化。另外，在产生了独立的部件，具有从对齐无规取向立即改变，这支架的生物力学特性显著降低。以前没有工作，已经能够生产出适用的纳米纤维支架与对齐和随机连续渐变的纤维取向。我们最近的研究表明纳米纤维支架的成功娱乐在纤维组织层次可以潜在模拟天然胶原组织在腱-骨插入^10。这项工作的目的是提出用于生产纳米纤维支架的带结构非常类似于该纤维组织的在天然腱 - 骨组织界面的协议。

梯度纳米纤维结构都可能产生深远跨越各种领域的应用程序。我们集中在应用到腱-骨插入部位的组织工程用脂肪来源的干细胞（ADSC中），它们已经用于组织再生在各种基材上^11-14结合我们的支架。此外，脂肪干细胞在性质上骨髓干细胞非常相似于多能的术语和其资源丰富，可以用一个简单的吸脂过程^15,16收获。播种这些细胞渐变纳米纤维支架进一步增强他们的那朵通过允许所述细胞可以潜在分化成各种组织的受控分布告工程应用。除了接种干细胞，纳米纤维可以被封装与信号分子对细胞响应的调节。耦合nanoencapsulation这些支架的组织梯度允许的细胞行为或可能的植入物的设计和涂料的研究。的官能分子，如骨形态发生蛋白2（BMP2），这已被证明是诱导成骨细胞分化^15,16，封装可以进一步提高这些支架¹⁰的组织工程应用。

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Protocol

1.溶液的制备

在100毫克/毫升的近似浓度制备的聚（ε -己内酯）（PCL）（M _W =80000克/摩尔）的溶液中。以4:1的比例溶解的PCL在二氯甲烷（DCM）和N，N-二dimethlyformamide酰胺（DMF）的混合物：1（V / V）的10％的浓度（重量/体积）。
放置在20毫升玻璃试管中的溶液混合。放置玻璃管入超声波清洗30分钟，或直到溶液是半透明的。

2.设备准备

加入制备的PCL溶液加到5毫升注射器附有一个21号钝针头。
放置注射器泵在上下电纺丝位置，根据图1。
使用的不锈钢集电极间隙为2厘米×5厘米为对齐纤维衬底上的开放空间。放置集电极从针尖端12公分。
连接的直流（DC）高压电源向针和接地收藏家。确保集电极分别与没有接触到其他实验室设备接地。

3.静电

组注射泵至1.50毫升/小时，直到在针尖形成液滴除去时立即更换。然后，设置流速0.50毫升/小时。
关闭电压操作员12千伏。
静电纺丝直到单轴排列的纤维完全覆盖在收集器的间隙。
应用胶水小玻璃板的边缘，并从该间隙集电极转移纤维玻璃板。放置在玻璃板上的一块铝箔具有相同的尺寸的玻璃板上，并接地的顶部。
根据图3的位置第二注射器收集器。
附加塑料掩模到第二注射器泵和位置它2毫米集电极上方。
添加香豆素6在1％（W / W）至PCL溶液，如果楠oencapsulation是desired-并混合直到溶液是半透明的。
加载PCL或PCL /香豆素6溶液到5ml针的钝21号针头。设置立式泵至0.50毫升/小时和水平拉以9ml / hr或以1mm /分钟的近似速度。
静电纺丝直到掩模已经移动几乎完全关闭的集，但与边缘区域仍掩模之下。

4.光纤鉴定

将样品用双面导电胶带到金属螺栓和外套与铂为40秒，用溅射涂布机，在40毫安。
1. 根据我们以前的研究^17,18检查通过扫描电子显微镜（SEM）的纤维。
2. 在15千伏的加速电压采集图像。
执行在一个单独的纤维样本的快速傅立叶变换（FFT）分析，以测量纤维取向。在测量光纤对准了FFT的详细信息，可以参考吨Ø以往的研究^19,20。

5.播种的干细胞。

通过浸泡在2小时的70％的乙醇溶液消毒的纤维样品。然后洗涤该纤维用蒸馏水以除去任何污染物。
在95％空气/ 5％CO ₂的气氛中获得人脂肪干细胞和培养细胞中的25cm ²烧瓶中，在37℃。每隔¹⁰天改变细胞培养基。
Trypsinize细胞并计数细胞的数目。具体而言，除去从细胞培养烧瓶中的所有培养基并用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗细胞两次。然后加入1 ^M L的0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液（预温水浴中以37℃），以覆盖细胞单层并孵育在所述细胞培养孵化器的烧瓶中2-3分钟。加入4毫升培养介质和洗出从表面所有单元吹打的介质在整个表面。离心细胞悬浮液，并再分散第ë细胞沉淀在培养基中。算上通过血球细胞。约1×10 ⁴个细胞的纳米纤维支架放置在35毫米的培养皿-文化和种子孵育3和7天。
使用荧光素二乙酸酯（5毫克/毫升的丙酮）（FDA）的图像，然后使用荧光显微镜的样品染色的细胞。具体来说，加100微升的FDA解决培养皿和孵育30分钟。前三次荧光成像洗涤细胞，用PBS。通过基于我们以往的研究¹⁰定制垫实验室程序分析细胞方向。

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Representative Results

使用该协议，形成纤维垫与组织梯度。图3示出了在对纳米纤维支架的不同位置拍摄的SEM图像。定性，可以判断为存在来自单轴排列的纤维，在0毫米（ 图3A）到一个随机纤维品种在6毫米（ 图3D）一个进展。在FFT给出的定量值对纤维取向，在定量过程细节详见这里^19。纤维在0毫米展品的FFT表示纤维取向，并以6毫米的FFT模式表示一个随机的取向。有一个在SEM图像清晰进展（ 图3）从一个对准纤维组织日益无规纤维沉积（ 图3B - C）。

脂肪干细胞进行了基于在所述纳米纤维支架的位置的形态变化。图4 图4A - D）拍摄的图像和7天（ 图4E - H）。干细胞角的分布进行定量定制MATLAB程序评估，并使用Kolmogorov-Smirnov检验在各种距离进行分析。 图4I示出了细胞角在不同的位置的分布。在0毫米，或排列的纤维的区域，该细胞的70％出现了内的纳米纤维制造的轴线20°。与此相反，该脂肪干细胞接种在纤维支架的随机部分缺乏这种组织结构，只有20％的范围内出现的20°的细胞。最后，使用香豆素6的化学梯度的形成 - 加载的PCL纤维用荧光显微镜进行了研究。化学梯度是使用显微镜图像（ 图5A）定性确认。图像确认增加CHEMI横跨支架，其由所述荧光图像的稳定增加强度表现出校准浓度。荧光强度（图像J）（ 图5B）的曲线图中由呈现横跨支架线性增长证实了化学浓度的梯度。

图1：示出的实验装置的示意性的单轴取向纤维基材的制备。

图3：在PCL渐变纳米纤维支架在0毫米（A），2毫米（B）中 ，第4毫米（C）和6毫米（D）的SEM图像。二级图像傅立叶快速传输模式（FFT）。模式（A）是一致的纤维，（D）的暗示随机的纤维沉积。这个数字已重印从[10] Macromol。 BIOSCI。，12，谢，J.，麻，B.，迈克尔，PL和舒勒，纳米纤维支架的FD制作灰度等级的纤维组织及其潜在应用。 1336年至1341年，版权所有2012年，从WILEY-VCH许可。

图4：荧光显微镜图像显示培养3天（A - D）后，脂肪干细胞和7天（E - H）。图像显示在顺层支架的不同位置脂肪干细胞的各种形态。 （Ⅰ）：细胞角在支架的不同位置的分布。细胞上排列的纤维（0毫米）纳米纤维取向的轴线的20°之间进行更加浓缩。这个数字已重印从[10] Macromol。 BIOSCI。，12，谢，J.，麻，B.，迈克尔，PL和舒勒，纳米纤维支架的FD制作灰度等级的纤维组织及其潜在应用。 1336年至1341年，版权所有2012年，从WILEY-VCH许可。

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Acknowledgments

这项工作是从内布拉斯加医疗中心和美国国立卫生研究院（授权号1R15 AR063901-01）大学的启动资金部分支持。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polycaprolactone	Sigma-Aldrich	440744
N,N-Dimethlyformamide	Fisher Chemical	D-119-1
Dichloromethane	Fisher Chemical	AC61093-1000
Coumarin 6	Sigma-Aldrich	546283
Adipose Derived Stem Cells	Cellular engineering Technologies	HMSC.AD-100
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	26140-111
Fluorescein Diacetate	Sigma-Aldrich	F7378
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
Trypsin-EDTA	Invitrogen	25300-054
α-Modified Eagle's Medium	Invitrogen	a10490-01
Acetone	Fisher Scientific	s25120a
Phosphate Buffered Saline	Invitrogen	10010023
Glass Slides	VWR international, LLC	101412-842
Syringe Pump	Fisher Scientific	14-831-200	Single syringe
Ultrasonic Cleaner	Branson	1510
High Voltage DC Power Supply	Gamma High Voltage Research	ES30
Scanning Electron Microscope	FEI	Nova 2300
Fluorescence Microscope	Zeiss	Axio Imager 2