Bioengineering

Électrofilées nanofibres échafaudages avec des gradations dans l'organisation fibre

Published: April 19, 2015 doi: 10.3791/52626

Karl Khandalavala¹, Jiang Jiang¹, Franklin D. Shuler², Jingwei Xie¹

¹Department of Pharmaceutical Sciences, Mary & Dick Holland Regenerative Medicine Program, University of Nebraska Medical Center, ²Department of Orthopedic Surgery, Joan C. Edwards School of Medicine, Marshall University

Summary

Ici, nous présentons un protocole pour fabriquer des échafaudages électrofilé de nanofibres avec l'organisation graduée de fibres et d'explorer leurs applications dans la régulation de la morphologie des cellules / orientation. Dégradés en ce qui concerne les propriétés physiques et chimiques des échafaudages de nanofibres offrent une grande variété d'applications dans le domaine biomédical.

Introduction

Les nanofibres sont un utilitaire populaire pour l'ingénierie tissulaire en raison de leur capacité à imiter la matrice extracellulaire dans sa structure et ^une taille relative. Cependant, certaines interfaces tissulaires natives, telles que le site d'insertion du tendon-os, contiennent des fibres de collagène, qui présentent une structure organisationnelle variable qui augmente en direction de l'alignement des tendons et diminue au niveau du site de l'os ^2-5. Ainsi, pour la régénération tissulaire effective, il est nécessaire de fabriquer un échafaudage qui pourrait effectivement mimer la structure de ce gradient.

Auparavant, il a été effectué des recherches sur des changements graduels dans la composition des fibres, en particulier, la teneur en minéraux ^6. Cependant, recréant la composante structurelle des tissus conjonctifs reste largement inexploré. Une étude antérieure a examiné gradients morphologiques en étudiant l'effet de la densité des particules de silice de surface sur la prolifération des ostéoblastes de la voûte crânienne du rat et ont trouvé une inverSE relation entre la densité de particules de silice et la prolifération des cellules ^7. Mais les changements morphologiques médiation prolifération cellulaire dans des travaux antérieurs étaient principalement liés à la rugosité de surface manque la capacité en imitant fibres changements organisationnels ^7,8. Une étude récente a tenté de fabriquer un échafaudage qui imitait les orientations uniques de fibres de collagène en utilisant un roman collecteur pour électrofilage ^neuf. Bien que cette étude a réussi à produire un échafaudage avec des fibres à la fois alignés et aléatoires, il n'a pas réussi à imiter les changements graduels exposées dans les tissus natifs. Aussi, dans la production de composants séparés, avec un changement immédiat de alignée sur l'orientation aléatoire, les propriétés biomécaniques de cette échafaudage diminué de manière significative. Aucun travail précédente a été en mesure de produire des échafaudages de nanofibres applicables avec des gradations continus dans des orientations de fibres de alignés et aléatoire. Notre étude récente a montré loisirs succès des échafaudages de nanofibresavec des gradations dans l'organisation de fibres qui peuvent potentiellement imiter l'organisation de collagène natif au tendon-os insertion ^10. Ce travail vise à présenter les protocoles utilisés pour la production d'échafaudages de nanofibres avec une structure qui ressemble étroitement à celui de l'organisation de la fibre dans l'interface native tendon-os tissus.

Structures de nanofibres gradient ont potentiellement des applications dans une variété de domaines de grande envergure. Nous nous sommes concentrés sur les applications à l'ingénierie tissulaire du site d'insertion du tendon-os en combinant nos échafaudages avec des cellules souches du tissu adipeux (ADSCs) qui sont déjà utilisés pour la régénération tissulaire sur divers substrats ^11-14. En outre, ADSCs sont très similaires dans la nature à des cellules souches de moelle osseuse en termes de ressources et de leur multipotence est abondante qui peut être récolté en utilisant un simple ^15,16 procédure de liposuccion. Ensemencement ces cellules aux échafaudages de nanofibres dégradés améliore encore leur tispoursuivre applications d'ingénierie en permettant la distribution contrôlée des cellules qui peuvent potentiellement se différencier en divers tissus. En plus de l'ensemencement des cellules souches, des nanofibres peuvent être encapsulés avec des molécules de signalisation pour la régulation de la réponse cellulaire. Couplage nanoencapsulation avec le gradient d'organisation de ces échafaudages permet l'étude du comportement cellulaire ou dessins et revêtements implants possibles. L'encapsulation des molécules fonctionnelles telles que la protéine morphogénétique osseuse 2 (BMP2), qui a été montré pour induire la différenciation ostéoblastique ^15,16, permettrait d'améliorer encore les applications d'ingénierie tissulaire de ces échafaudages ^10.

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Protocol

1. Préparation de la solution

Préparer une solution de poly (ε-caprolactone) (PCL) _(Mw = 80 000 g / mol) à une concentration approximative de 100 mg / ml. Dissoudre PCL dans un mélange de dichlorométhane (DCM) et de N, N-dimethlyformamide (DMF) dans un rapport de 4: 1 (v / v) à une concentration de 10% (p / v).
Placer la solution dans un tube en verre de 20 ml pour le mélange. Placez le tube de verre dans nettoyeur à ultrasons pendant 30 minutes, ou jusqu'à ce que la solution est translucide.

2. Appareil Préparation

Ajouter la solution PCL préparé dans une seringue de 5 ml avec une aiguille émoussée de calibre 21 fixée.
Passer pompe de seringue dans une position verticale d'électrofilage, selon la figure 1.
Utilisez un collecteur en acier inoxydable avec espace un espace ouvert de 2 cm x 5 cm pour le substrat de fibres alignées. Placez le collecteur 12 cm de la pointe de l'aiguille.
Branchez le courant continu (CC) haute tension alimentation duaiguille et la terre le collecteur. Assurez-vous que le collecteur est relié à la terre individuellement avec aucun contact à l'autre équipement de laboratoire.

3. Électrofilage

Set pompe seringue à 1,50 ml / h, jusqu'à ce que les gouttelettes formant à la pointe de l'aiguille sont immédiatement remplacés lorsqu'ils sont retirés. Ensuite, définissez le débit à 0,50 ml / h.
Tourner l'opérateur de tension à 12 kV.
Electrospin jusqu'à ce que les fibres uniaxialement alignés couvrir complètement le fossé sur le collecteur.
Appliquer la colle sur les bords d'une plaquette de verre et transférer les fibres à partir du collecteur de l'écart de la plaque de verre. Placer la plaque de verre sur le dessus d'un morceau de feuille d'aluminium qui a la même taille que la plaque de verre et est mis à la terre.
Placer le second capteur de seringue selon la figure 3.
Fixez le masque en plastique à la deuxième pompe de la seringue et le positionner 2 mm au-dessus du collecteur.
Ajouter Coumarine 6 à 1% (p / p) à la solution PCL-si nanoencapsulation est desired- et mélanger jusqu'à ce que la solution est translucide.
Chargez le PCL ou PCL / coumarine 6 solution dans une aiguille de 5 ml avec une aiguille de calibre 21 émoussée. Réglez pompe verticale à 0,50 ml / h et horizontale pour tirer à 9 ml / h ou à une vitesse approximative de 1 mm / min.
Electrospin jusqu'à ce que le masque est déplacé presque complètement hors du collecteur, mais avec la zone de bordure encore sous le masque.

4. Caractérisation de la fibre

Placer les échantillons avec du ruban adhésif double-face conductrice à la tige métallique et couche de platine pendant 40 secondes en utilisant une coucheuse par pulvérisation à 40 mA.
1. Examiner les fibres à travers un microscope électronique à balayage (MEB) après nos études antérieures ^17,18.
2. Recueillir des images à une tension d'accélération de 15 kV.
Effectuer transformée de Fourier (FFT) une analyse rapide sur un échantillon de fibre distincte pour mesurer l'alignement des fibres. Les informations détaillées sur l'alignement des fibres de mesure par FFT peut se référer to études antérieures ^19,20.

5. Les cellules souches semis.

Stériliser les échantillons de fibres par immersion dans une solution d'éthanol à 70% pendant 2 heures. Puis laver les fibres avec de l'eau distillée pour enlever les contaminants.
Obtenir ADSCs humaines et des cellules en culture dans un ² flacon de 25 cm à 37 ° C dans une atmosphère de 95% d'air / 5% de CO _2. Changer le milieu de culture de cellules tous les deux jours ^10.
Trypsiniser les cellules et de compter le nombre de cellules. Plus précisément, enlever tout milieu de culture à partir de la fiole de culture de cellules et laver les cellules avec une solution saline tamponnée phosphate (PBS) deux fois. Ensuite, ajouter 1 m ^l d'une solution à 0,25% de trypsine-EDTA (pré-chaud dans un bain d'eau à 37 ° C) pour couvrir la monocouche cellulaire et on incube le flacon dans l'incubateur de culture cellulaire pendant 2-3 minutes. Ajouter 4 ml de milieu de culture et laver toutes les cellules de la surface par pipetage du milieu sur toute la surface. E Centrifuger la suspension cellulaire et re-disperséee culot cellulaire dans le milieu de culture. Compter les cellules via hématimètre. Seed environ 1 × 10 ⁴ cellules à l'échafaud de nanofibres placé dans une boîte de -culture 35 mm et incuber pendant 3 et 7 jours.
cellules tache en utilisant diacétate de fluorescéine (5 mg / ml dans l'acétone) (FDA), puis l'image les échantillons en utilisant un microscope à fluorescence. Plus précisément, ajouter 100 ul de solution de la FDA pour la boîte de culture et incuber pendant 30 min. Laver les cellules avec PBS trois fois avant de l'imagerie de fluorescence. Analyser l'orientation de la cellule par un programme mat-lab personnalisée basée sur nos études précédentes ^10.

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Representative Results

En utilisant ce protocole, un tapis de fibre à gradient d'organisation a été formé. La figure 3 montre les images MEB prises à divers endroits sur l'échafaud de nanofibres. Sur le plan qualitatif, on peut déterminer qu'il existe une progression des fibres alignées de manière uniaxiale à 0 mm (figure 3A) à un assortiment aléatoire des fibres à 6 mm (figure 3D). La FFT donne une valeur quantitative à l'alignement des fibres, des détails sur les processus quantitatifs sont détaillées ici ^19. 0 mm à fibres présentent une FFT qui indique l'alignement des fibres, et à 6 mm du motif de FFT signifie une orientation aléatoire. Il ya une nette progression dans les images SEM (figure 3) d'une organisation de fibres aligné à un dépôt de fibres de plus en plus aléatoire (figure 3B - C).

ADSCs subi des modifications morphologiques en fonction de leur emplacement dans l'échafaudage de nanofibres. Figure 4 (figure 4A - D) et 7 jours (Figure 4E - H). La répartition de l'angle de cellules souches a été évaluée quantitativement par un programme personnalisé MATLAB et analysée en utilisant le test de Kolmogorov-Smirnov à des distances différentes. La figure 4E illustre la répartition de l'angle de cellule à différents endroits. A 0 mm, ou voisine de fibres alignées, 70% des cellules est apparue dans les 20 ° de l'axe de nanofibre fabrication. En revanche, les ADSCs ensemencées sur les portions aléatoires des échafaudages de fibres manqué cette structure organisationnelle, avec seulement 20% des cellules apparaissant dans les 20 °. Enfin, la formation du gradient chimique utilisant Coumarine 6 - de fibres de PCL chargés a été étudiée par microscopie à fluorescence. Le gradient de produit chimique a été confirmée qualitativement en utilisant l'image de microscopie (figure 5A). L'image confirme l'augmentation chimicoconcentration cal travers l'échafaud, qui est présentée par l'intensité sans cesse croissant de l'image fluorescente. Le graphique de l'intensité de fluorescence (Image J) (figure 5B) confirme le gradient de la concentration chimique en exposant une croissance linéaire à travers l'échafaudage.

Figure 1: montre le schéma du dispositif expérimental pour la préparation du substrat de fibre uniaxialement aligné.

Figure 2: (A) montre le placement de la seconde pompe à seringue pour la fabrication de l'échafaudage de gradient. (B) Placement du masque au-dessus du collecteur. Ce chiffre a été tiré à part de [10] Macromol. Biosci., 12, Xie, J., Ma, B., Michael, PL & Shuler, FD Fabrication des nanofibres échafaudages avec des gradations dans l'organisation fibre et leurs applications potentielles. 1336-1341, Copyright 2012, avec la permission de Wiley-VCH.

Figure 3: les images au MEB de l'échafaudage de nanofibres PCL graduée à 0 mm (A), 2 mm (B), 4 mm (C), et 6 mm (D). Les images secondaires sont Fourier modèles de transfert rapide (FFT). Motif à (A) est celui de fibres alignées, (D) indique le dépôt aléatoire des fibres. Ce chiffre a été tiré à part de [10] Macromol. Biosci., 12, Xie, J., Ma, B., Michael, PL & Shuler, FD Fabrication de nanofibres échafaudages avec des gradations dans l'organisation fibre et leurs applications potentielles. 1336-1341, Copyright 2012, avec la permission de Wiley-VCH.

Figure 4: des images de microscopie de fluorescence montrant ADSCs après une incubation de 3 jours (A - D) et 7 jours (E - H). Images présentent les différentes morphologies de ADSCs dans différents endroits de l'échafaud graduée. (I): La distribution des angles de cellules à différents endroits d'échafaudages. Les cellules ont été beaucoup plus concentrées entre 20 ° de l'axe d'alignement de fibres de nanofibres alignées (0 mm). Ce chiffre a été tiré à part de [10] Macromol. Biosci., 12, Xie, J., Ma, B., Michael, PL & Shuler, FD Fabrication de nanofibres échafaudages avec des gradations dans l'organisation fibre et leurs applications potentielles. 1336-1341, Copyright 2012, avec la permission de Wiley-VCH.

Figure 5: (A) la microscopie de fluorescence image de fibres coumarine 6-encapsulés. (B) Le graphique présente l'intensité de fluorescence dans l'échafaud. L'augmentation linéaire signifie un changement progressif de la concentration du produit chimique à travers l'échafaudage. Ce chiffre a été tiré à part de [10] Macromol. Biosci., 12, Xie, J., Ma, B., Michael, PL & Shuler, FD Fabrication de nanofibres échafaudages avec des gradations dans l'organisation fibre et leurs applications potentielles. 1336-1341, Copyright 2012, avec la permission de Wiley-VCH.

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Acknowledgments

Ce travail a été soutenu en partie par des fonds de démarrage de l'Université du Nebraska Medical Center et l'Institut national de la santé (numéro de subvention 1R15 AR063901-01).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polycaprolactone	Sigma-Aldrich	440744
N,N-Dimethlyformamide	Fisher Chemical	D-119-1
Dichloromethane	Fisher Chemical	AC61093-1000
Coumarin 6	Sigma-Aldrich	546283
Adipose Derived Stem Cells	Cellular engineering Technologies	HMSC.AD-100
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	26140-111
Fluorescein Diacetate	Sigma-Aldrich	F7378
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
Trypsin-EDTA	Invitrogen	25300-054
α-Modified Eagle's Medium	Invitrogen	a10490-01
Acetone	Fisher Scientific	s25120a
Phosphate Buffered Saline	Invitrogen	10010023
Glass Slides	VWR international, LLC	101412-842
Syringe Pump	Fisher Scientific	14-831-200	Single syringe
Ultrasonic Cleaner	Branson	1510
High Voltage DC Power Supply	Gamma High Voltage Research	ES30
Scanning Electron Microscope	FEI	Nova 2300
Fluorescence Microscope	Zeiss	Axio Imager 2