Summary
Здесь мы приводим протокол для изготовления electrospun нановолокна подмости с упорядоченных организации волокон и исследовать свои приложения в регулировании клеточной морфологии / ориентацию. Градиенты в отношении физических и химических свойств нановолокон каркасов предлагают широкий спектр применений в области биомедицины.
Introduction
Нановолокна популярная утилита для тканевой инженерии из-за их способности имитировать внеклеточный матрикс в своей структуре и относительный размер 1. Тем не менее, некоторые нативной ткани интерфейсы, такие как вставки сайта сухожилия-к-кости, содержат коллагеновые волокна, которые обладают переменной организационную структуру, которая увеличивается в направлении выравнивания сухожилия и уменьшает на месте кости 2-5. Таким образом, для эффективной регенерации ткани существует необходимость в изготовлении каркас, который может эффективно имитировать эту структурную градиент.
Ранее, было проведено исследование на постепенных изменений в составе волокна, в частности, содержание минеральных веществ 6. Однако, воссоздавая структурный компонент соединительной ткани остается в значительной степени неизученными. В более раннем исследовании рассмотрены морфологические градиенты по изучению влияния поверхности кремнезема плотности частиц на пролиферацию крысы свода черепа остеобластов и нашел INVERSE отношения между плотностью частиц кремнезема и пролиферации клеток 7. Но морфологические изменения, которые опосредованной пролиферации клеток в предыдущей работе в основном были связаны с шероховатостью поверхности не имея возможности в имитации волокон организационных изменений 7,8. Одно недавнее исследование пытались изготовить каркас, который имитировал уникальные ориентации коллагеновых волокон при использовании нового коллектора для электропрядения 9. Хотя это исследование удалось получить эшафот и выровненных и случайных волокон, она не смогла, чтобы имитировать постепенные изменения выставлены в родных тканей. Кроме того, в производстве отдельных компонентов, с немедленным переходом от выравнивается по случайной ориентацией, биомеханические свойства этого эшафота значительно снизилась. Ни одна из предыдущих работ не был в состоянии произвести соответствующие нановолокна подмости с непрерывными градации ориентацию волокон из выровнены и случайных. Наше недавнее исследование показало, успешное воссоздание нановолокон лесовс градациями в организации волокон, которые потенциально могут имитировать родную организацию коллагена при вставке 10 сухожилия к костям. Эта работа направлена представить протоколы, используемые для производства нановолокон лесов со структурой, напоминающей, что организации волокон в родной интерфейс ткани сухожилия к костям.
Градиент нановолокон структуры потенциально могут иметь далеко идущие применений в различных областях. Мы сосредоточились на приложениях к тканевой инженерии для введения сайте сухожилие к костям, объединив наши строительные леса с жировой стволовых клеток (ADSCs), которые уже используются для регенерации тканей на различных подложках 11-14. Кроме того, ADSCs очень похожи по своей природе стволовых клеток костного мозга в плане мультипотентность и их ресурс имеется в изобилии, которые могут быть собраны с помощью простой процедуры липосакции 15,16. Сеялки эти клетки упорядоченных нановолокон лесов еще больше повышает их ТИСв суд инженерных приложений, позволяя для контролируемого распределения клеток, которые потенциально могут дифференцироваться в различные ткани. В дополнение к посева стволовых клеток, нановолокна могут быть инкапсулированы с сигнальными молекулами для регулирования клеточного ответа. Соединительная nanoencapsulation с организационной градиента этих лесов позволяет для изучения клеточного поведения или возможных имплантатов конструкций и покрытий. Инкапсуляция функциональных молекул, таких как костного морфогенетического белка 2 (Bmp2), который, как было показано, чтобы вызвать дифференцировки остеобластов 15,16, может дополнительно усиливать тканевой инженерии этих каркасов 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Приготовление раствора
- Готовят раствор поли (ε-капролактона) (PCL) (М ш = 80000 г / моль) при приблизительной концентрации 100 мг / мл. Растворить PCL в смеси дихлорметана (DCM) и N, N-dimethlyformamide (ДМФ) в соотношении 4: 1 (об / об) с концентрацией 10% (вес / объем).
- Поместите раствор в стеклянную трубку 20 мл для смешивания. Поместите стеклянную трубку в ультразвуковой очиститель для 30 минут, или до тех пор, пока раствор не станет прозрачным.
2. Устройство Подготовка
- Добавьте приготовленный раствор PCL в 5 мл шприц с 21 калибра тупой иглой.
- Поместите шприцевой насос в вертикальном положении электроформования, в соответствии с фиг.1.
- Использование нержавеющей стали, зазор коллектор с открытым пространством 2 см х 5 см для выровненного волокно в качестве подложки. Поместите коллекционеру 12 см от кончика иглы.
- Подключите постоянного тока (DC) высокого напряжения киглы и обосновать коллектор. Убедитесь, что коллектор по отдельности заземлены без контакта с другого лабораторного оборудования.
3. электропрядения
- Набор шприцевой насос с 1,50 мл / ч, до капелек, образующих на кончике иглы сразу же заменить, когда удалены. Затем устанавливается скорость потока 0,50 мл / ч.
- Поверните оператора напряжение до 12 кВ.
- Electrospin пока одноосно выровненных волокон полностью не покрыть разрыв на коллекторе.
- Наносить клей на краях небольшой стеклянной пластины и передачи волокон из щели коллектора к стеклянной пластины. Поместите стеклянную пластину на верхней части куска алюминиевой фольги, которая имеет тот же размер, стекла и заземлен.
- Расположите второй шприц коллектор в соответствии с рисунком 3.
- Прикрепите пластиковую маску на втором шприцевой насос, и расположить его на 2 мм выше коллектора.
- Добавить кумарина 6 в 1% (вес / вес) в растворе, PCL, если NaNoencapsulation является desired- и перемешать до раствор не станет прозрачным.
- Загрузите PCL или PCL / кумарин 6 решение в иглу 5 мл с тупым 21 иглы. Установка вертикальной насос 0,50 мл / ч, и по горизонтали, чтобы вытащить на 9 мл / ч или при приблизительной скорости 1 мм / мин.
- Electrospin до маски переместился почти полностью от коллектора, но с краевой области все еще под маской.
4. Волоконно Характеристика
- Образцы с двухсторонней проводящей ленты на металлической шпильке и пальто с платиной в течение 40 сек с помощью распылением для нанесения покрытий на 40 мА.
- Проверьте волокон через сканирующего электронного микроскопа (SEM) в соответствии с нашими предыдущими исследованиями 17,18.
- Собирать изображения при ускоряющем напряжении 15 кВ.
- Выполнение быстрого преобразования Фурье (FFT) анализ на отдельном образце волокна для измерения выравнивания волокна. Подробная информация о измерения выравнивания волокна посредством БПФ можете обратиться то предыдущих исследованиях 19,20.
5. Посев стволовых клеток.
- Стерилизация образцов волокна путем выдержки в 70% -ном растворе этанола в течение 2 часов. Затем промыть волокна с дистиллированной водой, чтобы удалить любые примеси.
- Получение человека ADSCs и культуры клеток в 25 см 2 колбе при 37 ° С в атмосфере 95% воздуха / 5% CO 2. Изменение клеточную культуральную среду через день 10.
- Trypsinize клетки и подсчитать количество клеток. В частности, удалить все культуральную среду из культуры клеток колбы и промыть клетки с фосфатным буферным раствором (PBS) дважды. Затем добавить 1 м л 0,25% трипсина-ЭДТА (предварительно теплой в водяной бане до 37 ° C), чтобы покрыть клеточный монослой и инкубировать колбы в клеточной культуре инкубаторе в течение 2-3 минут. Добавить 4 мл культуральной среды и промыть все клетки с поверхности с помощью пипетки среды по всей поверхности. Центрифуга клеточной суспензии и повторно-дисперсных йОсадок клеток адрес в культуральной среде. Граф клеток через гемацитометре. Семя около 1 × 10 4 клеток на нановолокна эшафот, помещенной в 35 мм -Культура блюдо и инкубировать в течение 3 и 7 дней.
- Пятно клетки с помощью флуоресцеина диацетата (5 мг / мл в ацетоне) (FDA), затем изображение образцов с помощью флуоресцентного микроскопа. В частности, добавление 100 мкл раствора FDA в чашку с культурой и инкубируют в течение 30 мин. Вымойте клеток с PBS три раза, прежде чем флуоресцентных изображений. Анализ клеточной ориентации на индивидуальные программы мат-лаборатории на основе наших предыдущих исследований 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Используя этот протокол был сформирован волокнистый мат с организационной градиента. Рисунок 3 показывает изображения SEM, принятые в разных местах на нановолокна эшафот. Качественно, может быть определено, что существует последовательность из одноосно ориентированных волокон на 0 мм (фиг.3А) к случайной волокна ассортимента на 6 мм (фиг 3D). FFT дает количественное значение для выравнивания волокон, особенности на количественном процессов, описанных здесь 19. Волокна при 0 мм обладают FFT, что указывает на то выравнивание волокон, и в 6 мм модели БПФ означает случайную ориентацию. Существует четкое прогресс в изображение SEM (фиг.3) из выровненного организации волокон с более случайного осаждения волокна (фиг.3В - С).
ADSCs прошли морфологические изменения, основанные на их месте в нановолокна эшафот. Рисунок 4 (рис 4А - D) и 7 дней (рис 4E - H). Распределение угла стволовых клеток количественно оценивали индивидуальные программы MATLAB и анализировали с помощью теста Колмогорова-Смирнова на различных расстояниях. Рисунок 4I показывает распределение угла клеток в разных местах. В 0 мм, или области выровненных волокон, 70% клеток оказались в пределах 20 ° от оси нановолокна изготовления. В отличие от этого, ADSCs высевали на случайных частей каркасов волокон не было этой организационной структуры, и только 20% клеток, появляющихся в течение 20 °. Наконец, образование химической градиентом Кумарин 6 - загруженные PCL волокна изучали с помощью флуоресцентной микроскопии. Химический градиент качественно подтвердил, используя образ микроскопии (рис 5А). Изображение подтверждает возрастающую ChemiКонцентрация кал через эшафот, которой обладает всё возрастающей интенсивностью флуоресцентного изображения. График интенсивности флуоресценции (изображение J) (5В) подтверждает градиент концентрации химического вещества, демонстрируя линейный рост через эшафот.
Рисунок 1: Показывает схему экспериментальной установки для подготовки одноосно в соответствие волокна подложки.
Рисунок 2: (а) показывает размещение второго шприца для изготовления строительных лесов градиента. (Б) Размещение над коллектором маски. Эта цифра была перепечатана из [10] Macromol. Biosci., 12, Се, J., Ма, Б., Майкл, PL & Шулер, FD Фабрикатион нановолокна строительные леса, с градациями в волокне организации и их потенциальном применении. 1336-1341, Copyright 2012, с разрешения Wiley-VCH.
Рисунок 3: СЭМ изображения в PCL упорядоченных нановолокон помост на 0 мм (A), 2 мм (В), 4 мм (C), и 6 мм (D). Вторичные образы Фурье модели Быстрая передача (БПФ). План на (а) в том, что выровненных волокон, (г) предполагает случайное осаждение волокон. Эта цифра была перепечатана из [10] Macromol. Biosci., 12, Се, J., Ма, Б., Майкл, PL & Шулер, FD Изготовление нановолокна строительные леса, с градациями в волокне организации и их потенциальном применении. 1336-1341, Copyright 2012, с разрешения Wiley-VCH.
FIGURe 5: (А) люминесцентной микроскопии изображение Кумарин 6-инкапсулированных волокон. (В) график показывает интенсивность флуоресценции через строительные леса. Линейный рост означает постепенное изменение концентрации химического вещества через эшафот. Эта цифра была перепечатана из [10] Macromol. Biosci., 12, Се, J., Ма, Б., Майкл, PL & Шулер, FD Изготовление нановолокна строительные леса, с градациями в волокне организации и их потенциальном применении. 1336-1341, Copyright 2012, с разрешения Wiley-VCH.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа была частично поддержана из автозагрузки средств из Университета Медицинского центра Небраски и Национального института здоровья (номер гранта 1R15 AR063901-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polycaprolactone | Sigma-Aldrich | 440744 | |
| N,N-Dimethlyformamide | Fisher Chemical | D-119-1 | |
| Dichloromethane | Fisher Chemical | AC61093-1000 | |
| Coumarin 6 | Sigma-Aldrich | 546283 | |
| Adipose Derived Stem Cells | Cellular engineering Technologies | HMSC.AD-100 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 26140-111 | |
| Fluorescein Diacetate | Sigma-Aldrich | F7378 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | |
| α-Modified Eagle's Medium | Invitrogen | a10490-01 | |
| Acetone | Fisher Scientific | s25120a | |
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 10010023 | |
| Glass Slides | VWR international, LLC | 101412-842 | |
| Syringe Pump | Fisher Scientific | 14-831-200 | Single syringe |
| Ultrasonic Cleaner | Branson | 1510 | |
| High Voltage DC Power Supply | Gamma High Voltage Research | ES30 | |
| Scanning Electron Microscope | FEI | Nova 2300 | |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | Axio Imager 2 |
References
- Xie, J., Li, X., Xia, Y. Putting electrospun nanofibers to work for biomedical research. Macromol. Rapid Commun. 29 (22), 1775-1792 (2008).
- Genin, G. M., et al. Functional grading of mineral and collagen in the attachment of tendon to bone. Biophys. J. 97 (4), 976-985 (2009).
- Thomopoulos, S., Marquez, J. P., Weinberger, B., Birman, V., Genin, G. M. Collagen fiber orientation at the tendon to bone insertion and its influence on stress concentrations. J. Biomech. 39 (10), 1842-1851 (2006).
- Thomopoulos, S., Williams, G. R., Gimbel, J. A., Favata, M., Soslowsky, L. J. Variation of biomechanical, structural, and compositional properties along the tendon to bone insertion site. J. Orthop. Res. 21 (3), 413-419 (2003).
- Thomopoulos, S., Genin, G. M., Galatz, L. M. The development and morphogenesis of the tendon-to-bone insertion - What development can teach us about healing. Musculoskelet Neuronal Interact. 10 (1), 35-45 (2010).
- Li, X., Xie, J., Lipner, J., Yuan, X., Thomopoulos, S., Xia, Y. Nanofiber scaffolds with gradations in mineral content for mimicking the tendon-to-bone insertion site. Nano Lett. 9 (7), 2763-2768 (2009).
- Kunzler, T. P., Huwiler, C., Drobek, T., Vörös, J., Spencer, N. D. Systematic study of osteoblast response to nanotopography by means of nanoparticle-density gradients. Biomaterials. 28 (33), 5000-5006 (2007).
- Huwiler, C., Kunzler, T. P., Textor, M., Vörös, J., Spencer, N. D. Functionalizable nanomorphology gradients via colloidal self-assembly. Langmuir. 23 (11), 5929-5935 (2007).
- Xie, J., et al. 'Aligned-to-random' nanofiber scaffolds for mimicking the structure of the tendon-to-bone insertion site. Nanoscale. 2 (6), 923-926 (2010).
- Xie, J., Ma, B., Michael, P. L., Shuler, F. D. Fabrication of nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and their potential applications. Macromol. Biosci. 12 (10), 1336-1341 (2012).
- James, R., Kumbar, S. G., Laurencin, C. T., Balian, G., Chhabra, A. B. Tendon tissue engineering: adipose-derived stem cell and GDF-5 mediated regeneration using electrospun matrix systems. Biomed. Mater. 6 (2), 025011 (2011).
- Bodle, J. C., Hanson, A. D., Loboa, E. G. Adipose-derived stem cells in functional bone tissue engineering: lessons from bone mechanobiology. Tissue Eng. Part B Rev. 17 (3), 195-211 (2011).
- Lee, J. H., Rhie, J. W., Oh, D. Y., Ahn, S. T. Osteogenic differentiation of human adipose tissue-derived stromal cells (hASCs) in a porous three-dimensional scaffold. Biochem. Biophys. Res. Commun. 370 (3), 456-460 (2008).
- Tapp, H., Hanley, E. N., Patt, J. C., Gruber, H. E. Adipose-derived stem cells: characterization and current application in orthopaedic tissue repair. Exp. Biol. Med. 234 (1), 1-9 (2009).
- Gimble, J. M., Guilak, F. Adipose-derived adult stem cells: isolation, characterization, and differentiation potential. Cytotherapy. 5 (5), 362-369 (2003).
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7 (2), 211-228 (2001).
- Xie, J., et al. The differentiation of embryonic stem cells seeded on electrospun nanofibers into neural lineages. Biomaterials. 30 (3), 354-362 (2009).
- Xie, J., MacEwan, M. R., Li, X., Sakiyama-Elbert, S. E., Xia, Y. Neurite outgrowth on nanofiber scaffolds with different orders, structures, and surface properties. ACS Nano. 3 (5), 1151-1159 (2009).
- Ayres, C., et al. Modulation of anisotropy in electrospun tissue engineering scaffolds: analysis of fiber alignment by the fast Fourier transform. Biomaterials. 27 (32), 5524-5534 (2006).
- Ayres, C., et al. Measuring fiber alignment in electrospun scaffolds: a user’s guide to the 2D fast Fourier transform approach. J. Biomater. Sci. Poly. Ed. 19 (5), 603-621 (2008).
